Periode 9 deel 2
DNA TECHNIEKEN
Lesstof toets 9.2
Biologie voor het MLO zesde druk
Hfdst 15.5 DNA technieken
Het oude boek (vijfde druk) heeft dit hoofdstuk niet
Technieken Biotechnologie
Onder biotechnologie vallen verschillende technieken die erfelijk materiaal van planten en dieren veranderen.
Traditionele en moderne biotechnologie
Een voorbeeld van traditionele biotechnologie is het maken van kaas. Dit gebeurt met de hulp van bacteriën en schimmels.
Onder moderne biotechnologietechnieken vallen bijvoorbeeld: genetische modificatie, stamceltechnieken, klonen en synthetische biologie.
Biotechnologie in de industrie
bijvoorbeeld productie van chemicaliën of plastics.
Productie van brandstoffen op basis van hernieuwbare grondstoffen, zoals bioethanol (Milieuvriendelijk). Bio-ethanol wordt gemaakt van
voedingsgewassen zoals suikerriet, graan, maïs- en suikerbieten en reststromen zoals stro en maïsloof. Het ontstaat door de vergisting van suikers of zetmeel.
H15 Biotechnologie tot H15.5 behandeld in periode 4
Industriële
biotechnologie
Moderne biotechnologie
Genetische modificatie
Onderzoekers kunnen erfelijk materiaal in planten en dieren (organismen) veranderen. Zo voorzien zij die organismen van gewenste eigenschappen. Als ze dat doen op een manier die van nature niet mogelijk is, heet dat genetische modificatie. Het resultaat is eengenetisch gemodificeerd organisme(ggo).
Genetische modificatie van dieren gebeurt vooral voor biomedisch onderzoek. Onder meer op het gebied van kanker, hersenfalen, ouderdomsziekten en ontwikkelingsproblemen.
Door toepassing van biotechnologie kunnen planten en dieren wezenlijk veranderen. Daarom stelt de overheid hier wettelijke grenzen aan.
Klonen
Bijklonen van dierenof planten is de nakomeling genetisch hetzelfde als de oouder. Dit is te vergelijken met stekken of enten bij planten.
In Nederland worden dieren alleen gekloond voor de wetenschap. In landen buiten de Europese Unie worden ook dieren gekloond voor bijvoorbeeld onderzoek of fokprogramma’s.
Jan 2018- Gekloonde apen
Moderne Biotechnologie
Synthetische biologie
Een nieuwe vorm van biotechnologie is synthetische biologie. Hierbij maken onderzoekers kunstmatig (delen van) cellen die beter werken dan biologische onderdelen. Dit kan leiden tot veel toepassingen. Bijvoorbeeld productie van goedkope medicijnen of biobrandstoffen.
De Commissie Genetische Modificatie (Cogem) monitort de ontwikkelingen van synthetische biologie. Ook adviseert Cogem de Rijksoverheid over de risico’s ervan. Tot nu toe volstaat de bestaande wetgeving.
Genetische kettingreactie: gene drive
Bij een genetische kettingreactie wordt een eigenschap van een organisme blijvend veranderd. Dit heet ook wel ‘gene drive’. Alle nakomelingen van het organisme nemen de verandering over. Daardoor kan de eigenschap binnen enkele generaties aan bijna alle nakomelingen worden doorgegeven. Bij andere vormen van genetische modificatie gebeurt dit niet. Met gene drive zou bijvoorbeeld de (infectie)ziekte malaria teruggedrongen kunnen worden door muggen permanent ongevoelig te maken voor de malariaparasiet. Het onderzoek hiernaar gebeurt nu nog alleen in het laboratorium.
Bij gene drive wordt een nieuwe eigenschap doorgegeven aan de gehele nieuwe generatie van het organisme. Daardoor is de verspreiding van de nieuwe eigenschap niet eenvoudig terug te draaien. Ook zijn de gevolgen van gene drive voor de natuur nog niet bekend. Daarom gaat de overheid hier onderzoek naar laten doen.
Wetenschappers die willen werken met gene drive,moeten een vergunning aanvragen. Aan de vergunning wordenstrenge voorwaardenverbonden. Bijvoorbeeld de eis te voorkomen dat het organisme dat zij veranderen, in de natuur terecht komt. De Inspectie Leefomgeving en Transport (ILT) houdt hier toezicht op.
Biotechnologie
Opdracht:
- Ga naar start.me periode 9
- Bekijk de uitleg klassieke moderne biotechnologie
- Maak de oefening klassieke moderne biotechnologie
Genetische modificatie
Bij kruisingen ontstaan regelmatig recombinanten, maar gewone kruisingen zijn alleen mogelijk binnen de soort.
Recombinant DNA techniek= De techniek om erfelijk materiaal van het ene soort organisme in te brengen in dat van een andere soort. Je noemt het DNA dat hierdoor ontstaat recombinant-DNA.
Transgeen / transgenese= inbrengen van DNA afkomstig van een organisme van een andere soort
Cisgeen / cisgenese= inbrengen van DNA dat afkomstig van een organisme van hetzelfde soort
Recombinante DNA technologie
De techniek maakt gebruik van plasmiden en restrictie-enzymen (knipenzymen) en ligases (plakenzymen).
Plasmiden zijn kleine ringvormige stukjes DNA die naast het grote ringvormige DNA-molecuul in bacteriën voorkomen.
Plasmiden kunnen zich onafhankelijk van het chromosomale DNA van de bacterie vermeerderen Met hulp van plasmiden kunnen bacteriën genen met soortgenoten of zelfs met andere soorten bacteriën uitwisselen.
Restrictie-enzymen spelen een rol in de natuurlijke afweer van bacteriën tegen virussen. Ze kunnen DNA 'openknippen';
daarom noem je ze knipenzymen. De restrictie-enzymen schakelen een binnengedrongen virus uit door zijn DNA stuk te knippen. Waar de knip gebeurt, ontstaan twee uiteinden, die
sticky ends
(kleverige eindjes) worden genoemd.Ligases zijn enzymen die in staat zijn gebroken DNA-strengen te repareren, aan elkaar te 'plakken'. Vandaar dat ze plak- enzymen worden genoemd. Vooral de
sticky ends
worden gemakkelijk aan elkaar geplakt.Recombinante DNA technologie
De recombinant-DNA-techniek verloopt als volgt (uitgebeeld bij het menselijke gen dat voor insuline codeert):
1. Een plasmide wordt met behulp van restrictie-enzymen opengeknipt.
2. Een stuk DNA met het insuline gen wordt uit het menselijke DNA geknipt en met behulp van ligase in de plasmide geplakt.
3. De plasmiden worden opgenomen door bacteriën die in cultuur gebracht worden en zich vele malen delen. Zo ontstaan er miljoenen bacteriën met het gerecombineerde plasmide.
4. De bacterie is transgeen geworden door genetische modificatie.
Zie de animatie op Bioplek (klik hier voor de tablet).
Recombinant DNA techniek
Campylobacter jejuni besmetting
Wat is Guillain barré syndroom?
DNA Technieken
Polymerase Chain Reaction (PCR)
De polymerase-kettingreactie, vaak afgekort tot PCR (van Polymerase Chain Reaction), is een methode om in het laboratorium kleine stukjes DNA heel vaak te kopiëren tot er genoeg van is om het DNA te bouwen en te analyseren.
DNA Sequencen
Door het DNA vervolgens te sequencen kan men de volgorde van de nucleotiden in het DNA bepalen
Kloneren van genen
DNA Finger Printing
Introduction PCR
De PCR-methode, in 1983 uitgevonden door Kary Mullis
Vele doeleinden een aantal voorbeelden:
Het kloneren van een gewenst stuk DNA van een organisme om het bijvoorbeeld in een ander organisme te brengen (bij genetische modificatie).
Bij het analyseren van DNA-monsters bij
forensisch onderzoek.
Om verwantschap na te gaan; je kunt bijvoorbeeld aantonen dat iemand de vader is van een bepaald kind.
Om bij infectieziekten de ziekteverwekker aan te tonen; het DNA van de ziekteverwekker moet dan natuurlijk wel bekend zijn.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Thermocycler
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Voor deze methode is nodig:
het stukje DNA dat gekopieerd (geamplificeerd) moet worden;
Mastermix
•
Het enzym Taq polymerase = DNA-polymerase; (afkomstig van bacteriën die in hete bronnen leven. Het heeft een optimum van ongeveer 72°C.)
•
heel veel nucleotiden (A, C, G en T);
•
kleine beginnetjes, primers genoemd, van waaruit de polymerisatie kan starten. Er zijn voor het proces twee primers nodig. Een primer is een stukje enkelstrengs DNA dat op de 5’ of 3’ nucleotide van het te kopiëren stuk DNA past.
•
Buffer voor de optimale pH
•
MgCl
2 cofactor voor DNA PolymerasePCR procedure bestaat uit drie stappen cyclus. Tijdens de cyclus wordt het stukje DNA één keer gekopieerd. De PCR-cyclus bestaat uit drie stappen:
Stap 1 Denaturatie :
• het DNA wordt verhit tot ongeveer 95°C; hierdoor denatureert het en gaan de twee DNA-strengen uit elkaar.
Stap 2 Annealing:
• de temperatuur wordt verlaagd en de primers worden toegevoegd.
Stap 3 Elongatie:
• de temperatuur wordt weer verhoogd tot 72°C en DNA-polymerase en de nucleotiden worden toegevoegd.
• Vanuit de primers worden langs de enkelstrengen DNA nieuwe strengen DNA gevormd. Dit wordt de verlenging genoemd.
• Het enkelstrengs DNA dient als matrijs voor de vorming van de nieuwe strengen.
• De temperatuur mag hierbij niet te laag zijn, omdat het DNA anders meteen weer dubbelstrengs wordt en ook niet te hoog, omdat het DNA- polymerase anders denatureert.
De PCR-cyclus duurt ongeveer 4 seconden. Daarna start de cyclus opnieuw en wordt nog 30-40 keer herhaald. Na 30 cycli zijn er al meer dan 1 miljard kopieën van het stuk DNA. En dat is genoeg om te gebruiken bij gelelektroforese.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Principe PCR
PCR
Een animatie van de PCR kun je opBioplekbekijken (klikhiervoor de tablet)
Opdracht:
- Ga naar start.me periode 9 - Bekijk de animatie PCR
- Maak vervolgens de vragen uit het boek 21 t/m 31
Je kunt zelf op je computer ook een PCR uitvoeren:
zie http://www.hhmi.org/biointeractive/bacterial-identification-virtual-lab
DNA Sequencen
Toepassing DNA sequencen
Voor deze methode is nodig
DNA fragmenten (in veelvoud door PCR of door kloneren in bacteriën)
Mastermix
DNA sequencen
Wat is sequencen?
Een speciale PCR reactie met gelabelde (gebonden met een specifieke stof)
nucleotiden. Wanneer de nucleotiden gebonden worden fluoreseren ze en dat wordt
gemeten door een detector.
Gelelektroforese
Gelelektroforese 2 Gelelektroforese 1
Opdracht:
- Maak vervolgens de vragen uit het boek 32 t/m 39
is een scheidingstechniek die DNA fragmenten onder invloed van een elektrisch veld laat bewegen in een gel. Negatief geladen moleculen bewegen naar
beneden waar de positieve pool (anode) zich bevindt. DNA fragmenten worden zo
gescheiden op basis van grootte.
Kloneren van genen - recombinant DNA technologie
Bij kloneren worden bepaalde genen in een bacterie gebracht. Als de bacteriën zich vermenigvuldigen, wordt ook het gen vermenigvuldigd. (uitgebeeld bij het
menselijke gen dat voor insuline codeert):
1. Een plasmide wordt met behulp van restrictie-enzymen opengeknipt.
2. Een stuk DNA met het insuline gen wordt uit het menselijke DNA geknipt en met behulp van ligase in de plasmide geplakt.
3. De plasmiden worden opgenomen door bacteriën die in cultuur gebracht worden en zich vele malen delen. Zo ontstaan er miljoenen bacteriën met het gerecombineerde plasmide.
4. De bacterie is transgeen geworden door genetische modificatie.
Zie de animatie op Bioplek (klik hier voor de tablet).
Kloneren van genen
Bij Kloneren wordt gebruikt gemaakt van bacteriën, plasmiden, restrictie enzymen en DNA ligases
Plasmiden
Zijn kleine cirkelvormige stukjes DNA die zich onafhankelijk van het bacteriële chromosoom vermenigvuldigen
Met dit stukje DNA kan genetische informatie tussen bacteriën uitgewisseld
Plasmiden worden ook wel vectoren genoemd. Om het gen in een bacterie te brengen, is een 'vector' nodig: iets dat het gen bevat en door de bacterie makkelijk wordt opgenomen. Plasmiden zijn zulke vectoren
Plasmiden komen voor bij bacteriën, maar ook bij sommige eukaryoten zoals
gist.
Kloneren van genen
Restrictie enzymen (knip enzymen)
knippen een dubbelstrengs DNA-streng op een specifieke plaats.
Ze komen uit bacteriën, en heten daarnaar: zo komt EcoR I uit E(scherichia) coli.
Sommige restrictie-enzymen geven rechte uiteinden ('blunt ends'). Andere geven ongelijke einden ('sticky ends') die ook weer makkelijk aan elkaar binden.
Restrictie-enzymen werken op vaste sequenties, dus zijn de 'sticky' uiteinden voor één restrictie-enzym altijd gelijk. Hierdoor is het mogelijk vreemd DNA aan elkaar te 'plakken', dus ook om vreemde genen in het DNA van een bepaald organisme te brengen.
Deze organismen worden dan transgeen.
Animatie van Eco-R1
Kloneren van genen
De plasmiden die gebruikt worden bevatten twee speciale genen:
- één voor resistentie tegen een antibioticum, en
- één voor een blauwe kleur van de kolonie.
Ze worden geknipt met hetzelfde restrictie-enzym als gebruikt is voor het DNA met het in te bouwen gen.
Dit moet 1× knippen, namelijk precies in het gen voor de blauwe kleur. Nu voeg je de oplossing van DNA toe. Dit bevat meestal ook nog stukjes DNA zonder het gewenste gen. Sommige plasmiden bouwen het goede DNA in.
Er zijn er ook die niets inbouwen (zelfsluiters), of een verkeerd stukje DNA. De stukken zijn nog niet definitief aan elkaar verbonden. Om dit te doen
voeg je DNA ligasen ( plak enzymen) toe.
Kloneren van genen
De plasmiden worden opgenomen door de bacteriën. Sommige bacteriën nemen niets op, en sommige bacteriën nemen een verkeerd plasmide op.
Het opnemen en tot expressie komen van vreemd DNA heet genetische transformatie
Het inbrengen van plasmiden is bacteriën is vaak door middel van een hitteschok die de doorlaatbaarheid (permeabiliteit) van het celmembraan vergroot.
Waarom kloneren?
Grote productie van eiwitten of stofwisselingsproducten
Opdracht:
- Maak vervolgens de vragen uit het boek 41 t/m 48
DNA Finger printing
Forensisch onderzoek
DNA-Fingerprint: ieder persoon heeft een unieke DNA sequentie. Het unieke DNA profiel noemen we DNA fingerprint
Methode:
DNA van de verdachte is gevonden. Het DNA wordt op specifieke plaatsen in het genoom onderzocht. Op het DNA wat niet codeerd voor genen. Een hypervariabel gebied wat de unieke DNA profiel van een persoon geeft.
Short tandem repeats STR’s (genetische markers)=niet coderend DNA die uit korte stukjes repeterend DNA (de korte stukjes DNA herhalen zichbinnen een stukje sequentie)
PCR vermenivuldigt de STR’s met gelabelde primers
Via capilaire gelelectroforese worden de aantal repeats bepaald op meerdere plaatsen op het DNA
De DNA fingerprint wordt weergegeven als een piekenpatroon met een nummer. Het cijfer staat voor het aantal keer dat de repeat voor komt
De combintie van cijfers en pieken worden vergeleken met andere DNA profielen in een DNA Databank
Als DNA profielen precies overeenkomen is er sprake van een match
DNA Fingerprinting
