University of Groningen Towards new personalized treatment options for patients with genomically unstable tumors van Gijn, Stephanie Elise

(1)

University of Groningen

Towards new personalized treatment options for patients with genomically unstable tumors

van Gijn, Stephanie Elise

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.

Document Version

Publisher's PDF, also known as Version of record

Publication date: 2019

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):

van Gijn, S. E. (2019). Towards new personalized treatment options for patients with genomically unstable tumors. Rijksuniversiteit Groningen.

Copyright

Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

(2)

531746-L-bw-van Gijn 531746-L-bw-van Gijn 531746-L-bw-van Gijn 531746-L-bw-van Gijn Processed on: 6-6-2019 Processed on: 6-6-2019 Processed on: 6-6-2019

Processed on: 6-6-2019 PDF page: 101PDF page: 101PDF page: 101PDF page: 101

samenvatting

(3)

Inleiding

DNA reparatie mechanismen en celcyclus checkpoints beschermen cellen tegen genomische instabiliteit

DNA replicatie is de basis van reproductie in alle levende organismen. DNA replicatie verwijst naar de verdubbeling van het DNA waarbij genetische informatie (ook wel erfelijk materiaal) overgedragen wordt op twee dochtercellen. De dochtercellen beschikken over dezelfde genetische informatie, oftewel ze zijn genomisch identiek. Variatie in het genoom kan echter optreden als het DNA beschadigd raakt en foutief of niet gerepareerd wordt. Gelukkig zijn cellen uitgerust met een aantal DNA reparatie mechanismen, die gericht verschillende soorten DNA schade repareren. Deze DNA reparatie mechanismen zijn onderdeel van de “DNA schade respons”, dat ervoor zorgt dat beschadigingen gedetecteerd worden en dat DNA reparatie mechanismen gemobiliseerd worden1. De DNA reparatie mechanismen zijn heel nauwkeurig maar enige mate van variatie kan optreden, wat de basis vormt voor evolutie. Geschat wordt dat een cel per dag minstens 70.000 beschadigingen oploopt door endogene factoren (bijv. schade door bijproducten van cellulaire processen, zoals zuurstof radicalen) of exogene factoren (e.g. UV licht, ioniserende straling, tabaksrook en alcohol)2-4_.

Deze DNA schade en de reparatie ervan kunnen verschillende gevolgen hebben, zoals veranderingen van de DNA sequentie (DNA mutaties), verwijdering of verdubbeling van bepaalde stukken DNA (‘copynumbervariatie’), omkering en translocatie van chromosoom segmenten of verwijdering of verdubbeling van een heel chromosoom (aneuploïdie)5 _{(Figuur 1A).}

Figuur 1: Consequenties van het verlies van genomische integriteit. (A) Vormen van DNA schade

die - wanneer niet accuraat gerepareerd - genomische instabiliteit veroorzaken. (B) Afbeelding van de chromosomen van een normale cel en een kanker cel. De kanker cel vertoont verwijderingen en verdubbelingen van hele chromosomen, herschikkingen van chromosoom segementen en copynumbervariaties.

102 Chapter 7

Punt mutaties Copynumbervariaties verdubbeling

verwijdering

Omkering en translocatie

van chromosoom segmenten Aneuploïdie

A -> T G -> C T -> A T -> A C -> G T -> A C -> G G -> C wild-type translocatie

Karyotype van een normale cel Karyotype van een kanker cel

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 xx 2 3 4 5 1 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 xx A B Figure 1

(4)

De progressieve opeenstapeling van DNA schade wordt ook “genomische instabiliteit” genoemd en is een kenmerk van bijna alle menselijke kankersoorten (Figuur 1B). Een belangrijke oorzaak van een hoge mate van genomische instabiliteit is een defect in DNA reparatie, waardoor DNA schade niet op de juiste manier gerepareerd wordt6_{. Een klassiek voorbeeld hiervan zijn mutaties in ‘Early}

Onset Breast Cancer-1 (BRCA1) en ‘Early Onset Breast Cancer-2 (BRCA2). Draagsters van een mutatie in het BRCA1 of BRCA2 gen hebben een sterk verhoogd risico op borstkanker (38%-87%, ten opzichte van 12% in de “normale” vrouwelijke populatie) en op eierstokkanker (16%-63% ten opzichte van 2% in de “normale” vrouwelijke populatie)7_{. Deze verhoogde risico’s onderstrepen het belang van DNA}

reparatie mechanismen om onze cellen gezond te houden.

BRCA1 en BRCA2 zijn belangrijke eiwitten voor de reparatie van dubbelstrengs DNA breuken door middel van “homologe recombinatie”. Deze vorm van DNA reparatie treedt alleen op in delende cellen. Bij homologe recombinatie dient de DNA-kopie als “mal” om de DNA breuk nauwkeurig te repareren. In het geval dat DNA breuken niet gerepareerd kunnen worden door homologe recombinatie, worden andere minder optimale DNA reparatie mechanismen geactiveerd, met genomische instabiliteit als gevolg8_.

Een ander “beveiligingsmechanisme” wordt gevormd door “celcyclus checkpoints” die de celcyclus progressie tijdelijk stop kunnen zetten zodat DNA schade gerepareerd kan worden. De celcyclus kan opgedeeld worden in vier fasen: G1, S, G2 en M-fase. De G1-fase kenmerkt zich als de fase waarin cellen zich voorbereiden op de celdeling, de S-fase waarin DNA gerepliceerd wordt, de G2-fase waarin de celdeling verder wordt voorbereid en de M-fase of mitose waarin cellen zich daadwerkelijk delen. Cyclin-dependent kinase (CDK) complexen bepalen de overgang naar een volgende fase. Twee belangrijke schakels tussen de detectie van DNA schade en het remmen van de celcyclus zijn de eiwitten ATR en ATM. ATM is vooral belangrijk voor het detecteren en repareren van DNA breuken, terwijl ATR belangrijk is in situaties van replicatie stress. Replicatie stress kan optreden wanneer DNA replicatie hyperactief wordt door een te actieve celcyclus machinerie. Het gevolg hiervan is het ontstaan van geblokkeerde replicatie vorken. ATM en ATR spelen een belangrijke rol in het stabiliseren van geblokkeerde replicatie vorken en het herstarten van DNA replicatie9-11_.

Wanneer bovengenoemde mechanismen actief worden, is er ook een beveiligingsmechanisme dat fouten in mitose voorkómt. Om dit goed te begrijpen zullen we eerst wat dieper ingaan op de mitose. De eerste fase van de mitose, profase, begint met de condensatie van het DNA en het verdwijnen van de celkernmembraan. Menselijke cellen bevatten 23 chromosoom paren (één van de vader en één van de moeder), dus totaal 46 chromosomen. Voorafgaand aan mitose wordt elke chromosoom verdubbeld, wat resulteert in twee identieke chromatiden. Deze identieke chromatiden worden goed bij elkaar gehouden na DNA-replicatie. Dit is belangrijk omdat zij elk over een dochtercel verdeeld worden, maar alleen als de condities dit toelaten. Tijdens de prometafase worden de chromosomen gepositioneerd op een rechte lijn in het midden van de cel. Draadvormige structuren van tubuline polymeren, microtubuli genaamd, groeien vanuit beide centrosomen en hechten zich aan de chromatiden. Tot het moment dat alle chromatiden stabiel bevestigd zijn aan microtubuli blijft het “spindle assembly checkpoint” (SAC) beveiligingsmechanisme actief. Het SAC remt chromosoom segregatie totdat elke chromatide bevestigd is aan microtubuli tijdens de metafase. Op dat moment wordt het SAC inactief en worden de twee chromatiden uit elkaar getrokken richting tegenoverliggende spindle polen. Afwijkingen in eiwitten van het SAC vormen een veel voorkomend fenomeen in kankercellen. Dit kan leiden tot chromosomale instabiliteit, een vorm van genomische instabiliteit, waarbij chromosomen ongelijk verdeeld zijn over de dochtercellen12,13_.

Kankertherapieën richten zich op verschillende aspecten van een tumor

De zoektocht naar therapieën die kanker effectief bestrijden richt zich vooral op potentiële moleculaire verschillen tussen kankercellen en normale cellen. Klassieke kankertherapieën richten zich op de verhoogde proliferatie van kankercellen ten opzichte van normale cellen. Met behulp van radiotherapie en chemotherapie wordt getracht zoveel mogelijk DNA schade aan te richten in snel delende kankercellen, wat uiteindelijk resulteert in geprogrammeerde celdood.

Normale cellen hebben BRCA1 en BRCA2 nodig hebben om te kunnen overleven, terwijl verlies van

7

(5)

BRCA1 of BRCA2 tumorcel proliferatie niet beperkt. Studies uit de negentiger jaren, waarbij muizen

gebruikt werden met een BRCA1 of BRCA2 mutatie, illustreren dit aan de hand van muizenembryo’s die vroegtijdig stierven door een hoge mate van genomische instabiliteit. Vervolgens werd ontdekt dat secundaire mutaties een invloed hebben op de vroegtijdige dood van de muizenembryo’s. Zo bleek dat inactivatie van het eiwit p53, o.a. verantwoordelijk voor geprogrammeerde celdood en de vooruitgang van de celcyclus na DNA schade, de kans op overleving van de muizenembryo’s kon vergroten14-16_{. De gedachtegang is dat dit ook gebeurt in tumorcellen die zich aanpassen om}

een hoge mate van genomische instabiliteit te weerstaan. Door alternatieve signaleringsroutes te remmen waarvan kankercellen afhankelijk zijn geworden, is het mogelijk om de groei van tumorcellen selectief te remmen. Een voorbeeld van een therapie gebaseerd op “synthetische lethaliteit” zijn remmers die ingezet kunnen worden voor patiënten met HR-deficiënte tumoren. PARP-remmers zijn in dit geval effectief omdat het enkel strengs DNA reparatie mechanisme geblokkeerd wordt. Hierdoor ontstaat dubbelstrengs DNA schade wat niet gerepareerd kan worden omdat deze tumoren HR-deficiënt zijn. Het gevolg is onherstelbare DNA schade die selectief leidt tot celdood in cellen die beide DNA-reparatie mechanismen niet hebben17-19_{. Bij de behandeling van HR-deficiënte}

tumoren worden PARP-remmers ingezet omdat bewezen is dat deze klinisch goed actief zijn. Kortom, er zouden nieuwe therapieën kunnen volgen bij de ontdekking van genen of signaleringsroutes die verantwoordelijke zijn voor de overleving van genoom instabiele tumorcellen.

Naast het identificeren van genen of signaleringsroutes waarvan genoom instabiele tumoren afhankelijk zijn geworden voor hun overleving, richten nieuwe kankertherapieën zich ook op het exploiteren van eigenschappen die kankercellen hebben ten opzichte van normale cellen. Dit kan verhoogde expressie zijn van een tumor-specifiek eiwit op de celmembraan van kankercellen, dat nauwelijks tot expressie komt op normale cellen. Met behulp van antilichamen die specifiek aan deze eiwitten binden (antilichaam-geneesmiddel-conjugaat), kunnen toxische stoffen heel gericht naar de kankercellen gedirigeerd worden20_{. Een ander voorbeeld is het exploiteren van replicatie}

stress die kankercellen in hoge mate kunnen ondervinden. Drugs die eiwitten als ATR remmen, of een eiwit onder aan in de ATR pathway zoals CHK1, kunnen de replicatie stress verergeren door progressie van de celcyclus te forceren, zelfs wanneer de DNA replicatie nog niet voltooid is. Dit kan leiden tot onherstelbare DNA schade en uiteindelijk celdood21_{. Klinische studies van ATR en}

CHK1-remmers zijn gaande en het is denkbaar dat deze CHK1-remmers op den duur onderdeel kunnen worden van kankertherapieën22_.

De voorgaande voorbeelden laten zien dat eigenschappen van tumoren zoals genetische mutaties kunnen leiden tot de ontwikkeling van op maat gemaakte therapieën. Deze aanpak wordt wel “precision medicine” genoemd. Naar verwachting zullen steeds meer beschikbare gegevens gebruikt worden bij de keuze welke therapie voor een individuele patiënt geschikt is23_{. Integratie}

van klinische, moleculaire en therapie-gerelateerde data zal nodig zijn om medicijngebruik en behandeling zo effectief mogelijk te maken en het optimaal passend te laten zijn bij de patiënt.

Het doel van dit proefschrift

In dit proefschrift gingen we op zoek naar potentiële nieuwe therapieën voor genoom instabiele borst- en hoofd-hals-kankers, waarbij we ons vooral richtten op genen of signaleringsroutes die essentieel geworden zijn voor de overleving van genoom instabiele tumoren.

Samenvatting van de hoofdstukken

In hoofdstuk 1 werd een algemene introductie gegeven over genomische instabiliteit. Hierin werd behandeld wat genomische instabiliteit is, hoe het veroorzaakt kan worden en hoe kankercellen er mee om kunnen gaan.

104 Chapter 7

(6)

In hoofdstuk 2 gingen we op zoek naar genen waarvan genoom instabiele tumoren afhankelijk zijn geworden om een hoge mate van genomische instabiliteit te kunnen overleven. Met behulp van “functional genomic mRNA profiling” (FGmRNA) en een ‘transcriptoom-wijde associatie analyse’ (TWAS) is de associatie bepaald tussen individuele genen en de mate van genomische instabiliteit. Elf genen bleken een vergelijkbare biologische functie te hebben, hadden een verhoogde gen expressie en behoorden tot de top 250 genen die de hoogste associatie hadden met een hoge mate van genomische instabiliteit. We richtten ons op deze genen met verhoogde gen expressie in tegenstelling tot verwijderde genen, omdat alleen eiwitten die tot expressie komen mogelijk therapeutisch geremd kunnen worden. We vonden dat remming van de eiwitten TPX2 en Aurora-A veel celdood gaf in tumorcellen, die genoom instabiel waren door BRCA2 inactivatie. TPX2 en Aurora-A spelen een belangrijke rol in het vormen van de microtubuli en in de correcte segregatie van chromatiden in mitose. Blijkbaar zijn genoom instabiele cellen meer afhankelijk van de correcte uitvoering van mitose om daarmee nog verdere genomische instabiliteit te voorkómen. Inactivatie van de TPX2/Aurora-A signaleringsroute zou een therapie kunnen zijn voor de behandeling van genoom instabiele tumoren.

In hoofdstuk 3 hebben we de bevindingen uit hoofdstuk 2 uitgebreid door te kijken naar de mate van TPX2 eiwit expressie in borstkanker subtypes. Onze hypothese was dat triple negatieve borstkankers, het subtype met de hoogste mate van genomische instabiliteit, ook een verhoogde mate van TPX2 eiwit expressie zouden hebben. Onze resultaten lieten inderdaad zien dat triple negatieve borstkankers in vergelijking met andere subtypen, de hoogste eiwit expressie van TPX2 hebben. Daarnaast vonden we een positieve associatie tussen TPX2 expressie en de eiwit expressie van cycline E en pRPA, twee eiwitten die indicatief zijn voor replicatie stress, een vorm van genomische instabiliteit. Aangezien verhoogde expressie cycline E en pRPA kenmerken zijn van replicatie stress, suggereren deze resultaten dat TPX2 expressie een indicator kan zijn van replicatie stress en daarbij ook van genomische instabiliteit.

Een ander kankertype dat gekarakteriseerd wordt door een hoge mate van genomische instabiliteit, veroorzaakt door replicatie stress, zijn plaveiselcelcarcinomen van het hoofd-hals gebied. In hoofdstuk 4 hadden we als doel om de mate van replicatie stress in plaveiselcelcarcinomen in kaart te brengen en te ontrafelen van welke genen plaveiselcelcarcinomen afhankelijk zijn geworden voor hun overleving. Aan de hand van FGmRNA profielen van 344 plaveiselcelcarcinomen konden we de associatie tussen de mate van genomische instabiliteit en expressie van individuele genen berekenen. Het gen ATR bleek één van de top kandidaten te zijn die positief geassocieerd was met de mate van genomische instabiliteit. Zoals hiervoor aangeduid is ATR belangrijk voor het stabiliseren, het herstellen en het herstarten van replicatie vorken in cellen die lijden onder een hoge mate van replicatie stress. Om het effect van een ATR-remmer te bekijken en te bepalen of plaveiselcelcarcinomen afhankelijk van ATR zijn geworden voor hun overleving, analyseerden we de replicatie snelheid van biopten van plaveiselcelcarcinomen behandeld met of zonder ATR-remmer. We konden verschillende patronen ontdekken in de replicatie snelheid van de tumorbiopten en concludeerden dat sommige plaveiselcelcarcinomen inderdaad afhankelijk zijn geworden van ATR. Ook al moet nader onderzoek het verband tussen de effectiviteit van ATR-remmers in plaveiselcelcarcinomen verder onderzoeken, suggereren onze bevindingen dat ATR-remmers een potentiële nieuwe therapie kunnen worden in de behandeling van plaveiselcelcarcinomen.

In hoofdstuk 5 hebben we bezien of we tumor-specifieke celmembraan eiwitten konden ontdekken op plaveiselcelcarcinomen van het hoofd-hals gebied waarvoor een antilichaam-geneesmiddel-conjugaat beschikbaar is. Met behulp van FGmRNA vonden we dat het GPNMB eiwit de hoogst voorspelde expressie had in plaveiselcelcarcinomen van het hoofd-hals gebied waarvoor antilichaam-geneesmiddel-conjugaten beschikbaar zijn. Om verder te onderzoeken of het GPNMB eiwit inderdaad hoog tot expressie komt, analyseerden we de GPNMB-expressie in 414 plaveiselcelcarcinomen van het hoofd-hals gebied. Onze resultaten lieten zien dat GPNMB hoog tot expressie komt in plaveiselcelcarcinomen van het hoofd-hals gebied in vergelijking met normaal weefsel. Plaveiselcelcarcinomen van het hoofd-hals gebied zijn niet afhankelijk voor overleving van GPNMB. Ondanks dat zou een therapeutisch middel, dat doelgericht een toxisch medicijn naar

7

(7)

plaveiselcelcarcinomen van het hoofd-hals gebied brengt, een nieuw startpunt kunnen vormen voor de behandeling van deze tumoren.

Ten slotte vatten we onze bevindingen samen in hoofdstuk 6 en bespraken we verwachtingen voor de toekomst van op maat gemaakte therapieën voor de behandeling van genoom instabiele tumoren.

REFERENTIES

1. Bartkova, J. et al. DNA damage response as a candidate anti-cancer barrier in early human tumorigenesis. Nature 434, 864–870 (2005).

2. Tubbs, A. & Nussenzweig, A. Endogenous DNA Damage as a Source of Genomic Instability in Cancer. Cell 168, 644–656 (2017).

3. Langie, S. A. S. et al. Causes of genome instability: the effect of low dose chemical exposures in modern society. Carcinogenesis 36 Suppl 1, S61–88 (2015).

4. Aguilera, A. & García-Muse, T. Causes of Genome Instability. http://dx.doi.org.proxy-ub.rug.nl/10.1146/annurev-genet-111212-133232 47, 1–32 (2013).

5. Santaguida, S. et al. Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System. Dev. Cell 41, 638–651.e5 (2017).

6. Nussenzweig, A. & Nussenzweig, M. C. A backup DNA repair pathway moves to the forefront. Cell 131, 223–225 (2007).

7. Petrucelli, N., Daly, M. B. & Pal, T. BRCA1- and BRCA2-Associated Hereditary Breast and Ovarian Cancer. (2016). 8. Roy, R., Chun, J. & Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection.

Nature Reviews Cancer 12, 68–78 (2012).

9. Zhou, B.-B. S. & Bartek, J. Targeting the checkpoint kinases: chemosensitization versus chemoprotection. Nature Reviews Cancer 4, 216–225 (2004).

10. Morgan, D. O. Cyclin-dependent kinases: engines, clocks, and microprocessors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13, 261– 291 (1997).

11. Visconti, R., Monica, Della, R. & Grieco, D. Cell cycle checkpoint in cancer: a therapeutically targetable double-edged sword. J. Exp. Clin. Cancer Res. 35, 153 (2016).

12. Krenn, V. & Musacchio, A. The Aurora B Kinase in Chromosome Bi-Orientation and Spindle Checkpoint Signaling. Front Oncol 5, 225 (2015).

13. Suijkerbuijk, S. J. E. et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Research 70, 4891–4900 (2010).

14. Hakem, R. et al. The Tumor Suppressor Gene Brca1 Is Required for Embryonic Cellular Proliferation in the Mouse. Cell 85, 1009–1023 (1996).

15. Suzuki, A. et al. Brca2 is required for embryonic cellular proliferation in the mouse. Genes Dev. 11, 1242–1252 (1997). 16. Ludwig, T., Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. & Efstratiadis, A. Targeted mutations of breast cancer susceptibility

gene homologs in mice: lethal phenotypes of Brca1, Brca2, Brca1/Brca2, Brca1/p53, and Brca2/p53 nullizygous embryos. Genes Dev. 11, 1226–1241 (1997).

17. Gavande, N. S. et al. DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment? Pharmacology and Therapeutics 160, 65–83 (2016).

18. Schoonen, P. M. et al. Progression through mitosis promotes PARP inhibitor-induced cytotoxicity in homologous recombination-deficient cancer cells. Nat Commun 8, 15981 (2017).

19. Konecny, G. E. & Kristeleit, R. S. PARP inhibitors for <i>BRCA1/2</i>-mutated and sporadic ovarian cancer: current practice and future directions. Br. J. Cancer 115, 1157–1173 (2016).

20. Nasiri, H., Valedkarimi, Z., Aghebati-Maleki, L. & Majidi, J. Antibody-drug conjugates: Promising and efficient tools for targeted cancer therapy. J. Cell. Physiol. 233, 6441–6457 (2018).

21. Toledo, L., Neelsen, K. J. & Lukas, J. Replication Catastrophe: When a Checkpoint Fails because of Exhaustion. Mol. Cell 66, 735–749 (2017).

22. di Rora, A. G. L., Iacobucci, I. & Martinelli, G. The cell cycle checkpoint inhibitors in the treatment of leukemias. Journal of Hematology & Oncology 2017 10:1 10, 77 (2017).

23. Kumar-Sinha, C. & Chinnaiyan, A. M. Precision oncology in the age of integrative genomics. Nature Biotechnology 2018 36:1 36, 46 (2018).

106 Chapter 7

(8)

(9)