University of Groningen
Developmental and pathological roles of BMP/follistatin-like 1 in the lung
Tania, Navessa
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2017
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Tania, N. (2017). Developmental and pathological roles of BMP/follistatin-like 1 in the lung. University of Groningen.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
1
DUTCH SUMMARY/
NEDERLANDSE
SAMENVATTING
CHAPTER 9
Voorwoord
Chronisch obstructief longlijden (chronic obstructive pulmonary disease, COPD) wordt gekenmerkt door een progressieve en irreversibele luchtwegobstructie waarin buitensporige en hardnekkige ontsteking van de longen een belangrijke rol speelt. Zoals aangegeven in de algemene inleiding (Hoofdstuk 1), is een juiste balans tussen het zogenaamde Bone morphogenetic protein (BMP4) en zijn endogene remme
Follistatin-like 1 (Fstl1) van cruciaal belang voor goede biologische functies tijdens
normale embryonale long-morfogenese1,2 en in de volwassen long in rusttoestand.3–5 Daarnaast is een immuunmodulerende functie van Fstl1 aangetoond in verschillende ontstekingsziekten.6–8 De functionele rol van Fstl1 in de postnatale ontwikkeling van de longen en in de longen van COPD patiënten is echter nog niet eerder onderzocht. Onlangs heeft een aantal studies de betrokkenheid van Fstl1 bij longfibrose en ernstig allergisch astma aangetoond.9–13 De studies beschreven in dit proefschrift laten zien dat Fstl1 vereist is voor de pulmonale vasculaire ontwikkeling na de geboorte (Hoofdstuk 2). Bovendien tonen wij aan dat Fstl1 eiwitexpressie verhoogd is in het epitheel van
de luchtwegen van COPD patiënten (Hoofdstuk 3). We vonden tevens dat Fstl1 een
ontstekingsbevorderende factor in de luchtwegen is (Hoofdstuk 5). Verder vonden we dat BMP4 signalering de distale variant-clubceldifferentiatie van het epitheel in de luchtwegen reguleert (Hoofdstuk 7). In zijn geheel laten onze bevindingen aannemen dat Fstl1 een cruciale rol speelt in de ontwikkeling en achteruitgang van COPD.
1. De rol van Fstl1 in luchtwegontsteking bij COPD patiënten
De ontwikkeling van de long wordt nauwkeurig aangestuurd door meerdere signaaltransductieroutes, die de vorming van luchtwegen en vasculatuur reguleren. BMP signalering is essentieel in het dynamische proces van vaatgroei en rijping, door het reguleren van de proliferatie en migratie van vasculaire gladde spieren en endotheelcellen.14–19 Sterk gecoördineerde regulatie van BMP signalering is essentieel
voor een goede longontwikkeling.20 Verscheidene genetische vaatziekten zijn in verband
gebracht met afwijkende BMP signalering, waaronder familiaire pulmonale arteriële hypertensie (PAH).18,21–28 Deze centrale rol voor BMP signalering wordt ondersteund
door de bevinding dat muizen waarbij het Fstl1 gen is uitgeschakeld (Fstl1-KO muizen) kleinere longen met verdikte alveolaire septa hebben. Deze muizen hebben last van ademnood en sterven vrijwel direct na de geboorte,1,2 wat aangeeft dat Fstl1 nodig
is voor longontwikkeling en alveolarisatie. Opvallend genoeg vonden we dat muizen met endotheel-specifieke Fstl1 deletie (Fstl1-eKO) ook last hadden van ademnood en 3 weken na de geboorte stierven (Hoofdstuk 2). De postnatale sterfte van de Fstl1-eKO muizen suggereert een belangrijke rol voor endotheliaal Fstl1 in postnatale ontwikkeling van de pulmonaire vasculatuur. Fstl1-eKO muizen stierven gemiddeld 21 dagen na de geboorte, wat in het alveolaire stadium van de longontwikkeling is dat van cruciaal belang is voor de alveolaire en vasculaire netwerkvorming en rijping.20,29
Vertakking van de luchtwegen en het vasculaire netwerk moet worden gecoördineerd om de blootstelling van bloed aan zuurstof te optimaliseren.20 De vorming van het
9
pulmonaire vasculaire netwerk bleek dan ook verstoord in Fstl1-eKO muizen, leidend tot ademnood (Hoofdstuk 2).
Hoewel minieme pulmonaire vasculaire remodeling in de grote en elastische arteriën in Fstl1-eKO muizen werd waargenomen, vonden we met name verhoogde percentages van actine bevattende kleine longvaten 21 dagen na de geboorte in deze muizen (Hoofdstuk 2). Bovendien vonden we dat de cardiale output van het rechterventrikel was verlaagd in Fstl1-eKO muizen (Hoofdstuk 2). Verder onderzoek naar de onderliggende mechanismen toonde aan dat gefosforyleerd Smad1/8/5 - een aanwijzing voor actieve BMP signalering - en BMP-gereguleerde eiwitten (Jagged1, endogline, en endotheline-1) verhoogd waren tijdens het vroege stadium van longontwikkeling (7 dagen na de geboorte) (Hoofdstuk 2). De remodeling van de longvaatjes in de Fstl1-eKO muizen ging gepaard met een verhoogde eiwitexpressie van endotheline-1, hetgeen een sterke vaatvernauwende werking heeft, na zowel 7 en Figuur 1. De rol van endotheliaal Follistatin-like 1 bij het moduleren van BMP/Smad signalering tijdens de postnatale ontwikkeling van de longvaten. In aanwezigheid van endotheliaal Fstl1
worden de BMP-geïnduceerde fosforylering van Smad1/5 en daarop volgende downstream targetgenen geremd. Deletie van endotheliaal Fstl1 in Fstl1-eKO muizen is geassocieerd met over-activatie van door BMP gefosforyleerde Smad1/5 en de targetgenen endogline, JAG1 en GATA2.
21 dagen na de geboorte. (Hoofdstuk 2). De combinatie van een hoge endotheline-1-expressie en een hoog percentage van actine bevattende kleine longvaten zou kunnen
leiden tot een verhoging van de pulmonale vasculaire weerstand (Hoofdstuk 2). De
progressieve en onomkeerbare defecten in longvatstructuur en-functie in Fstl1-eKO muizen zouden de ademnood kunnen verklaren, omdat de niet adequaat gevormde kleine longvaten niet in staat zijn om in de juiste mate bloed naar de longen te brengen. Dit zou kunnen leiden tot een gebrek aan zuurstoftoevoer naar de vitale organen en uiteindelijk tot de dood. Het zou dan ook interessant zijn om de zuurstof- en kooldioxideniveaus in het bloed te onderzoeken, en daarnaast ook de diameter van de kleine longvaten en hoeveelheid spiermassa in de kleine longvaten te bepalen in follow-up studies.
Samengevat lijkt het dat Fstl1-eKO muizen gekenmerkt worden door tijdelijke moleculaire veranderingen in BMP signalering, die vroeg beginnen tijdens de postnatale ontwikkeling (7 dagen na de geboorte), terwijl de fysiologische functies en morfologische gevolgen hiervan zich in latere stadia van postnatale ontwikkeling (21 dagen na de geboorte) manifesteren. Het is echter ook mogelijk dat de moleculaire en morfologische veranderingen in de longen een gevolg zijn van een slecht functionerend rechter ventrikel. Als gevolg van hypoxie die aldus ontstaat kan remodeling van de longvaten en een toegenomen endotheline-1-expressie optreden. Toekomstige studies zouden de cardiovasculaire structuur en functies in Fstl1-eKO muizen kunnen bestuderen om te onderzoeken wat de functie is van Fstl1 in het cardiovasculaire systeem. De rol van Fstl1 bij het moduleren van BMP/Smad signalering tijdens de postnatale ontwikkeling van de longvaten wordt weergegeven in Figuur 1.
2. De rol van Fstl1 in ontsteking van de luchtwegen bij COPD patiënten
Eén van de kenmerken van COPD is een inadequate activering van het aangeboren immuunsysteem en abnormaal weefselherstel in reactie op langdurige blootstelling aan pneumotoxische, geïnhaleerde stoffen, zoals sigarettenrook. Op zijn beurt leidt dit tot epitheliale remodeling en fysiologische veranderingen die bijdragen aan de niet volledig reversibele luchtwegvernauwing.30,31 Als eerste barrière tegen het externe
milieu scheidt luchtwegepitheel ontstekingsmediatoren uit met paracriene effecten op naburige mesenchymale cellen, waaronder longfibroblasten en gladde spiercellen van de luchtwegen. Interessant is dat een rol voor Fstl1 in cel-cel communicatie al eerder is gerapporteerd.6,9 Een groeiende hoeveelheid bewijs geeft aan dat Fstl1 een pro-inflammatoire rol heeft in het reguleren van de inflammatoire cytokine secretie in de pathogenese van verschillende ontstekingsziekten en in de verergering van de symptomen van deze ziekten.6,7,32 Het verband tussen Fstl1 en COPD pathogenese is echter nog niet eerder onderzocht. Onze studies naar de expressie van Fstl1 in COPD hebben aangetoond dat Fstl1 sterk verhoogd is in longhomogenaten van rokers zonder COPD en van stadium II als IV COPD-patiënten in vergelijking met personen zonder luchtwegobstructie (Hoofdstuk 3). Nader onderzoek aan longweefsel van COPD-patiënten toonde aan dat het Fstl1 eiwit tot expressie werd gebracht in verschillende delen van het longweefsel, waaronder
9
luchtwegepitheel, endotheel, vasculaire gladde spiercellen, en ontstekingscellen (Hoofdstuk 3). De intensiteit van Fstl1 kleuring, gebruikt als indicator voor de mate van aanwezigheid van het Fstl1 eiwit, was hoger in luchtwegepitheel, endotheel, vasculaire gladde spierbundels en ontstekingscellen van zowel patienten met stadium II en IV COPD (allen ex-rokers) in vergelijking met personen zonder luchtwegobstructie (Hoofdstuk 3). Dit kan erop wijzen dat verhoogde Fstl1 expressie geassocieerd is met COPD. Dit proefschrift is gericht op de mogelijke gevolgen van deze toegenomen Fstl1 expressie en de rol hiervan in de pathogenese van COPD (Hoofdstuk 5 en 7). Intrigerend is dat de expressie van Fstl1 in longhomogenaten van rokers zonder COPD en ex-rokers ook hoger is in vergelijking met niet-rokers zonder COPD, hetgeen wijst op een effect van het ooit-hebben-gerookt, waarschijnlijk door rook-geïnduceerde ontsteking (Hoofdstuk 3). Het zou kunnen dat acute vrijzetting van ontstekingsmediatoren en de daaropvolgende lokale ontsteking waarbij ontstekingscellen worden gerekruteerd in de longen wordt bevorderd door sigarettenrook, wat blijft bestaan na het stoppen met roken. Aangezien Fstl1 een TGF-β1 induceerbare factor is en TGF-β1 afgifte door bronchiale epitheelcellen wordt verhoogd na sigarettenrook behandeling,33 suggereert dit dat TGF-β1 de waargenomen up-regulatie van Fstl1 kan reguleren als reactie op sigarettenrook. Vervolgens hebben we de mogelijke rol van Fstl1 in longcellen onderzocht in het reguleren van de lokale ontsteking (Hoofdstuk 5). Middels studies in verschillende cellijnen bleek dat bronchiale epitheelcellen het meeste Fstl1 tot expressie brengen en uitscheiden in vergelijking met mesenchymale cellen, zoals longfibroblasten en luchtweggladde spiercellen (Hoofdstuk 5). Dit komt overeen met onze waarneming in longweefsel van personen met een normale longfunctie dat Fstl1voornamelijk tot expressie wordt gebracht in epitheelcellen, met name in het apicale deel van trilhaarcellen en in mindere mate in gladde spiercellen in de luchtwegen (Hoofdstuk 3). Andere studies in het hart en de gewrichten suggereren dat Fstl1 een mesenchymaal uitgescheiden factor is.32,34
Gezien het feit dat Fstl1 bekend staat als een endogene antagonist van BMP signalering in de longen,1,2 hebben wij de fosforylering van BMP-specifieke Smad1/5
onderzocht in longhomogenaten van COPD-patiënten (allen ex-rokers) in vergelijking met personen zonder COPD met verschillend rookgedrag. Gefosforyleerd Smad1/5 bleek aanzienlijk verminderd in longhomogenaten van rokers zonder COPD, ex-rokers zonder COPD en COPD stadium II en stadium IV patiënte (allen ex-rokers) in vergelijking
met mensen zonder COPD die nooit gerookt hebben (Hoofdstuk 3). Deze verminderde
Smad1/5 fosforylering kan verklaard worden door de verhoogde expressie van Fstl1, maar ook door verminderde pulmonaire BMP4 expressie. We vonden in de longhomogenaten echter geen significante verschillen in BMP4 eiwitgehalten tussen de groepen (Hoofdstuk 3). In cellijnen wordt BMP4 hoofdzakelijk tot expressie gebracht in mesenchymale cellen, zoals longfibroblasten en luchtweggladde spiercellen, terwijl humane bronchiale epitheelcellen de laagste expressie en uitscheiding van BMP4 hebben. De fosforylering van Smad1/5 in de cellijnen volgde dit patroon van BMP ligand expressie. De verschillende cellulaire bronnen van liganden en hun remmers in de longen wijzen op een mogelijke crosstalk tussen epitheliale en mesenchymale
cellen in het aansturen van biologische functies, met inbegrip van de regulering van inflammatoire cytokine afgifte. Door deze bevindingen hebben we besloten om te onderzoeken wat de precieze rol van Fstl1 in luchtwegontsteking in het algemeen, en de mogelijke bijdrage aan de ontwikkeling van COPD in het bijzonder (Hoofdstuk 5). De waargenomen toegenomen Fstl1 expressie in het luchtwegepitheel patiënten met COPD werd nagebootst door Fstl1 tot overexpressie te brengen in epitheelcellen, en het effect hiervan op pro-inflammatoire cytokine afgifte van pulmonale mesenchymale cellen te bestuderen. Overexpressie van Fstl1 in bronchiale epitheelcellen vergrootte de afgrifte van de ontstekingsfactoren IL-6 en GM-CSF wat duidt op een pro-inflammatoire functie (Hoofdstuk 5). Celmedium verkregen van bronchiale epitheelcellen waarin Fstl1 tot overexpressie was gebracht (Fstl1-CM) werd gebruikt om mesenchymale cellen mee te behandelen. Interessant genoeg ontdekten we dat dit Fstl1-CM de IL-6 en IL-8-transcriptie en eiwit afgifte door mesenchymale cellen verhoogde, wat suggereert dat Fstl1 pro-inflammatoire cytokine afgifte in de longen zou kunnen reguleren. (Hoofdstuk 5). Hoewel eerdere studies meldden dat Fstl1 de directe afgifte van IL-6 en IL-8 uit mesenchymale cellen bevordert,6,8,35,36 vertonen onze gegevens met behulp
van recombinante Fstl1 behandeling en overexpressie en knockdown van Fstl1 in longfibroblasten geen enkel effect op het basale niveau van IL-1β geïnduceerde IL-6 en IL-8-eiwit afgifte, wat suggereert dat Fstl1 op zichzelf onvoldoende is om cytokine afgifte te induceren uit mesenchymale cellen. Derhalve hypothetiseren wij dat Fstl1 de afgifte van ontstekingsmediatoren uit bronchiale epitheelcellen zou kunnen induceren, welke op hun beurt de cytokineafgifte uit mesenchymale cellen reguleren. We hebben verschillende uitgescheiden factoren geïdentificeerd als kandidaten voor het effect van Fstl1-CM op IL-6 en IL-8 afgifte uit de longfibroblasten, namelijk IL-6, IL-8, GM-CSF en RANTES, en hebben hun functionele bijdrage met behulp van experimenten met neutraliserende antilichamen bevestigd. Onze studie geeft het eerste in vitro bewijs dat Fstl1 de transcriptie en afgifte van inflammatoire cytokinen, zoals GM-CSF en IL-6, induceert in bronchiale epitheelcellen, die vervolgens de afgifte van IL-6 en IL-8 uit mesenchymale cellen kunnen stimuleren.
3. Fstl1 en metaplasie van slijmbekercellen in COPD: de rol van BMP4 in volwassen epitheliale differentiatie
BMP signalering is cruciaal in het aansturen van de proximaal-naar-distale patroonvorming van luchtwegepitheel in foetale en neonatale longontwikkeling. In volwassen longen is actieve BMP signalering vereist voor epitheliale regeneratie na letsel.37–42 BMP4
is een uitgescheiden mesenchymale factor die het lot van epitheelcellen tijdens longontwikkeling bepaalt.43 Daarnaast is BMP4 vereist voor epitheliale celdifferentiatie, omdat werd aangetoond dat de BMP4 expressie tijdsafhankelijk was upgereguleerd in een transcriptieprofielbepaling.44 Het luchtwegepitheel is de eerste beschermende fysische en functionele barrière van de luchtwegen en longen tegen de externe omgeving. Het epitheel van luchtwegen in volwassen bestaat uit een gemengd evenwicht van slijmbekercellen, trilhaarcellen, basale cellen en clubcellen die zijn verdeeld over de tracheobronchiale boom.45
9
Slijmuitscheidende slijmbekercellen worden voornamelijk tot expressie gebracht in het proximale epithelium, samen met de basale cellen, club cellen en trilhaarcellen.46,47 In de distale, kleine bronchioli zijn er secretoire club cellen, trilhaarcellen, en pulmonale neuro-endocriene cellen. Respiratoire longblaasjes zijn bedekt met een dunne, enkele laag van platte type I en type II kubische alveolaire epitheelcellen.48–50Sigarettenrook verandert de samenstelling van luchtwegepitheel en draagt bij aan epitheliale remodeling bij COPD.51 Luchtwegepitheelremodeling bij COPD wordt
gekenmerkt door metaplasie van slijmbekercellen en basale cellen, en door verlies van functionele clubcellen in de perifere en centrale luchtwegen.52–54 Variant clubcellen
(voorheen claracellen genoemd) zijn secretoire cellen die zich voornamelijk bevinden in de distale luchtwegen en een beschermende rol hebben door het afscheiden van uteroglobine, secretoglobine en surfactant, welke ontstekingsremmende functies hebben en belangrijk zijn voor epitheliale regeneratie.55 Variant clubcellen hebben
stamcelachtige eigenschappen en zijn in staat tot zelfvernieuwing en differentiatie tot trilhaarcellen en slijmbekercellen.50,56 Variant clubcellen hebben een duidelijke afgeplatte
morfologie en worden gekenmerkt door een afwezigheid van CC10 en cytochroom p450 Cyp2f. Normale clubcellen vertonen een typisch kubusvormig epitheliaal fenotype met hoge expressie van CC10 en cytochroom P450 Cyp2f, waardoor ze gevoelig zijn voor naftaleen.55,57,58 Verlies van (variant) clubcellen is waargenomen bij COPD.53,54,59,60 Lage
serum niveaus van club cell secretory protein (CC10, ook bekend als CC16 of SCGB1A1) worden niet alleen geassocieerd met de ernst en prevalentie van COPD, maar ook met een daling van de longfunctie bij COPD.61–65
Tijdens normale mucociliaire differentiatie ontstaan uit basale cellen direct of indirect (via intermediaire clubcellen) slijmbekercellen en trilhaarcellen. Intrigerend genoeg blijkt uit onze studie dat BMP4 basale celdifferentiatie in de richting van variant clubcellen drijft en verdere differentiatie in de richting van slijmbekercellen en trilharencellen onderdrukt (Hoofdstuk 7). Hoewel een eerdere studie een rol voor BMP4 heeft aangetoond in proximale-distale epitheliale differentiatie in de ontwikkelende longen,38 tonen wij als eerste aan dat BMP4 de variant clubceldifferentiatie in volwassen
humane epitheelcellen in ALI (air-liquid interface) kweken bevordert.
Overeenkomstig met eerdere studies in COPD en longfibrose63,66,67 vonden we dat
de functionele BMP4 signalering (Smad1/5/8 fosforylering) is verminderd in COPD, terwijl Fstl1 expressie is verhoogd (Hoofdstuk 3). Door het remmen van de negatieve regulatie van de BMP signaaltransductieroute op differentiatie van slijmbekercellen en basale cellen zou het Toegenomen Fstl1 in luchtwegepitheel bij COPD kunnen bijdragen aan de epitheliale differentiatie in de richting van slijmbekercelhyperplasie, basale celmetaplasie, en verlies van clubcellen. Dit zijn typische kenmerken zijn van ge-remodeled distaal epitheel bij COPD. Onze studie toont een plausibel verband aan tussen het verlies van clubcellen en slijmbekercel- en basale celmetaplasie enerzijds en de waargenomen vermindering van de BMP/Smad signalering bij COPD-patiënten anderzijds.66,67
Bovendien hebben we waargenomen dat BMP4 de expressie van zijn eigen endogene antagonist Fstl1 induceert tijdens luchtwegepitheeldifferentiatie in een tijds- en concentratieafhankelijke manier (Hoofdstuk 7). Dit impliceert dat Fstl1 betrokken zou
kunnen zijn bij BMP functies in epitheeldifferentiatie. Toekomstige studies met Fstl1-CM of Fstl1 neutraliserend antilichaam, en het staken van BMP4 behandeling na 14 dagen in BMP4 behandelde cellen, zouden kunnen beantwoorden of het effect van BMP4 omkeerbaar is, en of de schakeling naar het distale variant clubceldifferentiatieprogramma kan worden omgeleid naar een proximaal trilhaarceldifferentiatieprogramma. Eerder is aangetoond dat BMP-antagonisten kunnen functioneren als een positieve regulator van basale celproliferatie.68,69 Een aanhoudende toename van de BMP antagonist Fstl1 in COPD kan dus leiden tot basale celproliferatie en basale celhyperplasie, wat gewoonlijk wordt waargenomen in luchtwegepitheelremodeling bij COPD.
Tijdens de longontwikkeling wordt Fstl1 tot expressie gebracht door
Figuur 2. De pathologische gevolgen van het toegenomen Fstl1 niveau in het epitheel van de luchtwegen van COPD-patiënten. De expressie van het Fstl1 eiwit is toegenomen in het
luchtwegepitheel van COPD patiënten. Fstl1 is een pro-inflammatoir cytokine dat de epitheliale-mesenchymale communicatie bij IL-6 en IL-8 afgifte medieert. Zo kan Fstl1 bijdragen aan de rekrutering van neutrofielen en macrofagen naar de longen. BMP4 remt de differentiatie van slijmbekercellen, terwijl het de differentiatie van variant clubcellen in het epitheel van de luchtwegen van de volwassen mens bevordert. Toegenomenase Fstl1 in het epitheel van de luchtwegen bij COPD kan zo slijmbekercel hyperplasie bevorderen en het verlies van clubcellen in de hand werken.
slijmbekercelmetaplasie verlies van clubcellen
mesenchymale cellen IL-8IL-6 GM-CSF RANTES IL-6 IL-8 neutrofielen macrofagen Luchtwegontsteking Fstl1 Hoofdstuk 3 Hoofdstuk 5 Hoofdstuk 7 Fstl1 BMP4
9
slijmbekercellen,70 terwijl het in de gezonde volwassen longen voornamelijk de
trilhaarcellen zijn die Fstl1 tot expressie brengen (Hoofdstuk 3 en 5). Daarentegen wordt BMP4 voornamelijk tot expressie gebracht door mesenchymale cellen, zoals longfibroblasten en luchtweggladde spiercellen. Daarom vermoed ik dat epitheliale-mesenchymale communicatie via BMP-signalering een belangrijke regulator van trilhaarcel en slijmbekercel differentiatie is.77
Daarnaast vonden we dat BMP-behandelde cellen verhoogde expressie van zognaamde Notch-gereguleerde genen hebben (Hoofdstuk 3). Notch bepaalt het uiteindelijke lot van epitheelcellen in de luchtwegen. Daarom is het belangrijk de crosstalk tussen BMP en Notch bij longherstel van de volwassen longen te begrijpen om de afwijkende regeneratie van geremodeled epitheel bij COPD te verklaren. In COPD zijn Notch signaleringscomponenten, zoals Hey1 en Hey2, gedownreguleerd.63 Crosstalk
tussen BMP en Notch signalering wordt ook waargenomen tijdens de postnatale ontwikkeling van de longen, waar endotheliale deletie van Fstl1 in Fstl1-eKO muizen
was geassocieerd met verhoogde BMP-gereguleerd Jagged1 (Hoofdstuk 2). Daarnaast
werden de Notch targetgenen Hey1 en Hey3 verhoogd tot expressie gebracht in primaire humane bronchiale epitheelcellen na stimulatie met BMP4. Deze waarnemingen suggereren dat soortgelijke mechanismen een rol spelen in volwassen longcellen en in de ontwikkeling van de longen. Het zou interessant zijn om de samenstelling van het epitheel van de luchtwegen van Fstl1-eKO muizen te karakteriseren om te onderzoeken of variant clubcellen overheersen in het epitheel van Fstl1 deficiënte muizen. Daarnaast zijn toekomstige studies nodig om te onderzoeken of de remming van Notch signalering door middel van het gebruik van neutraliserende antilichamen, BMP-geïnduceerde variant club cel differentiatie in het ALI kweeksysteem kan remmen. Samengevat tonen onze studies aan dat BMP4 de differentiatie van slijmbekercellen remt, terwijl het de differentiatie van variant club-cellen bevordert. Herstel van deze onbalans in de longen van COPD patiënten zou een nieuwe strategie kunnen zijn om het herstel van de waargenomen verminderde BMP-gereguleerde Smad1/5 in COPD longen te verbeteren, alsmede om het verlies van clubcellen tegen te gaan en de metaplasie van slijmbekercellen te verminderen. Onze studie spoort toekomstige studies aan om een dergelijke strategie te onderzoeken in modellen voor luchtwegepitheel schade en herstel in vitro en in vivo. De pathologische gevolgen van het toegenomen Fstl1 niveau in het epitheel van de luchtwegen van COPD-patiënten is weergegeven in Figuur 2. 4. Toekomstperspectieven
De in dit proefschrift gepresenteerde gegevens belichten de tot nu toe onbekende rol van Fstl1/BMP signalering in COPD en bespreken de mogelijke gevolgen van verhoogde expressie van het Fstl1 eiwit bij luchtwegontsteking en epitheliale remodeling.
PAH is een veel voorkomende comorbiditeit bij COPD.71,72 Onze studie biedt in vivo
bewijs voor een belangrijke rol voor endotheliaal Fstl1 in het titreren van de niveaus van
BMP/Smad signalering tijdens de postnatale ontwikkeling van de longen (Hoofdstuk
2). Echter, de rechtstreekse link en de specifieke functies van endotheliaal Fstl1 in pulmonale arteriële celproliferatie van gladde spiercellen en bij de regulatie van actine
remodeling in pulmonale arteriële gladde spiercellen in de longen van pasgeborenen en in COPD longen moet nog worden opgehelderd. Ongecontroleerde proliferatie van pulmonale arteriële gladde spiercellen en verminderde actine remodeling dragen bij aan vaatvernauwing in PAH. Ex vivo studies met precision-cut lung slices zouden meer duidelijkheid kunnen scheppen over de functionele bijdrage van endotheliaal Fstl1 aan vernauwing van de longvaten. Een in vitro experiment met een co-kweeksysteem van humane long microvasculaire endotheelcellen en vasculaire gladde spiercellen zou de vraag kunnen beantwoorden hoe communicatie tussen deze celtypen de remodeling en vaatvernauwing reguleert.
In longvaten van COPD-patiënten zagen we een toename van Fstl1 eiwitexpressie in endotheelcellen en vasculaire gladde spiercellen in vergelijking met personen met een normale longfunctie (Hoofdstuk 3). Hoewel celspecifieke expressie van door BMP gefosforyleerde Smad signalering niet werd onderzocht, bleek dat de BMP-Smad gereguleerde activatie in longhomogenaten van COPD patiënten was verminderd vergeleken met controles zonder COPD (Hoofdstuk 3). Activering van BMP signalering is verminderd bij patiënten met idiopathische PAH.73–75 Echter, de bijdrage van Fstl1 aan
deze verlaging werd niet onderzocht. Eerdere studies toonden aan dat een endogene BMP-remmer, Gremlin, was verhoogd in endotheelcellen van idiopathische PAH en van PAH veroorzaakt door zuurstofgebrek.76 Bovendien was bij haploinsufficiëntie van
Gremlin 1 de pulmonale vasculaire weerstand verminderd door het verzwakken van vasculaire remodeling,76 wat suggereert dat remming van BMP leidt tot vasculaire
structurele veranderingen en tot vaatvernauwing.86 Uit recent onderzoek blijkt dat
Fstl1 de BMP/Smad signalering kan remmen, terwijl het de TGF-β-geïnduceerde α-smooth muscle actin expressie door longfibroblasten vergemakkelijkt, waardoor wordt bijgedragen aan extracellulaire matrix remodeling en luchtwegfibrose.9 Het zou
zo kunnen zijn dat Fstl1 de α-smooth muscle actin-productie door vasculaire gladde spieren verhoogt en structurele vasculaire veranderingen bevordert, waarmee het uiteindelijk bijdraagt aan toegenomen vaatweerstand en PAH. Een toekomstige studie ter evaluatie van het verband tussen Fstl1 expressie en pulmonale vaatfunctie bij patiënten met PAH secundair aan COPD zou waardevol zijn om uit te voeren.
Dit proefschrift onderzocht ook de mogelijke gevolgen van de toegenomen Fstl1 expressie bij COPD, met name in het epitheel van de luchtwegen. Een pro-inflammatoire rol voor Fstl1, welke epitheliale-mesenchymale communicatie medieert bij de afgifte van cytokinen (Hoofdstuk 4), zou kunnen bijdragen aan de aangeboren immuunrespons van de long die volgt op blootstelling aan bijvoorbeeld sigarettenrook. Om inzicht te verkrijgen in de mogelijke signaaltransductieroutes die betrokken zijn bij Fstl1-aangedreven lokale luchtwegontsteking in de longen zijn verdere studies nodig om de receptor(en) waarmee Fstl1 zijn werking in epitheelcellen en in pulmonaire mesenchymale cellen uitoefent te identificeren.
Verder tonen we aan dat BMP4 de differentiatie van slijmbekercellen remt, terwijl het de differentiatie van variant clubcellen bevordert (Hoofdstuk 5). Follow-up studies met behulp van muismodellen van COPD zijn nodig om het functionele effect van de toegenomen Fstl1 in het luchtwegepitheel te onderzoeken, om te beoordelen of dit de BMP signalering remt en aldus bijdraagt aan de slijmbekercelmetaplasie en het verlies van
9
variant clubcellen. Experimenten met behulp van neutraliserende antilichamen tegen Fstl1 zouden waardevol zijn om deze implicaties te onderzoeken. Gezien de postnatale sterfte van Fstl1-eKO muizen (Hoofdstuk 2) wat verdere studies in sigarettenrook-geïnduceerde COPD muismodellen belemmert, zijn follow-up in vivo studies met behulp van doxycycline geïnduceerde epitheel-specifieke Fstl1-KO de moeite waard om de betrokkenheid van epitheliaal-uitgescheiden Fstl1 in de ontwikkeling van COPD te bestuderen. Verder kan het van belang zijn om Fstl1 expressie en BMP-gereguleerde Smad-fosforylering in de proximale geleidende luchtwegen en de distale luchtwegen te onderzoeken om te bepalen of er een verband is tussen de relatieve expressie (ratio) van BMP/Fstl1 en de epitheelcelsamenstelling in de luchtwegen bij COPD. Samengevat speelt een verstoorde activering van Fstl1/BMP signaaltransductie na epitheel- en vasculaire schade een rol bij COPD. Het is tevens belangrijk om de functionele rol van de Fstl1/BMP as tijdens longontwikkeling te begrijpen. Dit zal leiden tot beter begrip van het abnormale weefselherstelproces bij COPD.
References
1. Sylva M, Li VSW, Buffing AAA, et al. The BMP antagonist follistatin-like 1 is required for skeletal and lung organogenesis. PloS One. 2011;6(8):e22616. doi:10.1371/journal.pone.0022616.
2. Geng Y, Dong Y, Yu M, et al. Follistatin-like 1 (Fstl1) is a bone morphogenetic protein (BMP) 4 signaling antagonist in controlling mouse lung development. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(17):7058-7063. doi:10.1073/pnas.1007293108.
3. Umezu T, Yamanouchi H, Iida Y, Miura M, Tomooka Y. Follistatin-like-1, a diffusible mesenchymal factor determines the fate of epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(10):4601-4606. doi:10.1073/pnas.0909501107.
4. Hayakawa S, Ohashi K, Shibata R, et al. Cardiac Myocyte-Derived Follistatin-Like 1 Prevents Renal Injury in a Subtotal Nephrectomy Model. J Am Soc Nephrol JASN. 2015;26(3):636-646. doi:10.1681/ ASN.2014020210.
5. Zhou X, Xiao X, Huang T, et al. Epigenetic inactivation of follistatin-like 1 mediates tumor immune evasion in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 2016;7(13):16433-16444. doi:10.18632/ oncotarget.7654.
6. Miyamae T, Marinov AD, Sowders D, et al. Follistatin-Like Protein-1 Is a Novel Proinflammatory Molecule. J Immunol. 2006;177(7):4758-4762. doi:10.4049/jimmunol.177.7.4758.
7. Clutter SD, Wilson DC, Marinov AD, Hirsch R. Follistatin-Like Protein 1 Promotes Arthritis by Up-Regulating IFN-γ. J Immunol. 2009;182(1):234-239. doi:10.4049/jimmunol.182.1.234.
8. Chaly Y, Marinov AD, Oxburgh L, Bushnell DS, Hirsch R. FSTL1 promotes arthritis in mice by enhancing inflammatory cytokine/chemokine expression. Arthritis Rheum. 2012;64(4):1082-1088. doi:10.1002/art.33422.
9. Dong Y, Geng Y, Li L, et al. Blocking follistatin-like 1 attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. J Exp Med. 2015;212(2):235-252. doi:10.1084/jem.20121878.
10. Liu R, Yang Y, Shen J, et al. Fstl1 is involved in the regulation of radial glial scaffold development. Mol Brain. 2015;8:53. doi:10.1186/s13041-015-0144-8.
11. Murphy N, Gaynor KU, Rowan SC, et al. Altered Expression of Bone Morphogenetic Protein Accessory Proteins in Murine and Human Pulmonary Fibrosis. Am J Pathol. 2016;186(3):600-615. doi:10.1016/j.ajpath.2015.10.032.
12. Miller M, Beppu A, Rosenthal P, et al. Fstl1 Promotes Asthmatic Airway Remodeling by Inducing Oncostatin M. J Immunol Baltim Md 1950. 2015;195(8):3546-3556. doi:10.4049/jimmunol.1501105. 13. Miller M, Esnault S, Kurten RC, et al. Segmental allergen challenge increases levels of airway follistatin-like 1 in patients with asthma. J Allergy Clin Immunol. 2016;138(2):596-599.e4. doi:10.1016/j. jaci.2016.01.019.
14. Gangopahyay A, Oran M, Bauer EM, et al. Bone morphogenetic protein receptor II is a novel mediator of endothelial nitric-oxide synthase activation. J Biol Chem. 2011;286(38):33134-33140. doi:10.1074/jbc.M111.274100.
15. Xu J, Zhu D, Sonoda S, et al. Over-expression of BMP4 inhibits experimental choroidal neovascularization by modulating VEGF and MMP-9. Angiogenesis. 2012;15(2):213-227. doi:10.1007/s10456-012-9254-4.
16. Moreno-Miralles I, Ren R, Moser M, Hartnett ME, Patterson C. Bone morphogenetic protein endothelial cell precursor-derived regulator regulates retinal angiogenesis in vivo in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011;31(10):2216-2222. doi:10.1161/ ATVBAHA.111.230235.
17. Helbing T, Rothweiler R, Ketterer E, et al. BMP activity controlled by BMPER regulates the proinflammatory phenotype of endothelium. Blood. 2011;118(18):5040-5049. doi:10.1182/ blood-2011-03-339762.
18. Yao Y, Jumabay M, Wang A, Boström KI. Matrix Gla protein deficiency causes arteriovenous malformations in mice. J Clin Invest. 2011;121(8):2993-3004. doi:10.1172/JCI57567.
19. Suzuki Y, Ohga N, Morishita Y, Hida K, Miyazono K, Watabe T. BMP-9 induces proliferation of multiple types of endothelial cells in vitro and in vivo. J Cell Sci. 2010;123(Pt 10):1684-1692. doi:10.1242/ jcs.061556.
20. Kool H, Mous D, Tibboel D, de Klein A, Rottier RJ. Pulmonary vascular development goes awry in congenital lung abnormalities. Birth Defects Res Part C Embryo Today Rev. 2014;102(4):343-358. doi:10.1002/bdrc.21085.
9
21. International PPH Consortium, Lane KB, Machado RD, et al. Heterozygous germline mutations inBMPR2, encoding a TGF-beta receptor, cause familial primary pulmonary hypertension. Nat Genet. 2000;26(1):81-84. doi:10.1038/79226.
22. Machado RD, Aldred MA, James V, et al. Mutations of the TGF-beta type II receptor BMPR2 in pulmonary arterial hypertension. Hum Mutat. 2006;27(2):121-132. doi:10.1002/humu.20285. 23. Harrison RE, Flanagan JA, Sankelo M, et al. Molecular and functional analysis identifies ALK-1 as the predominant cause of pulmonary hypertension related to hereditary haemorrhagic telangiectasia. J Med Genet. 2003;40(12):865-871. 24. Fujiwara M, Yagi H, Matsuoka R, et al. Implications of mutations of activin receptor-like kinase 1 gene (ALK1) in addition to bone morphogenetic protein receptor II gene (BMPR2) in children with pulmonary arterial hypertension. Circ J Off J Jpn Circ Soc. 2008;72(1):127-133.
25. Johnson DW, Berg JN, Baldwin MA, et al. Mutations in the activin receptor-like kinase 1 gene in hereditary haemorrhagic telangiectasia type 2. Nat Genet. 1996;13(2):189-195. doi:10.1038/ ng0696-189.
26. McAllister KA, Grogg KM, Johnson DW, et al. Endoglin, a TGF-beta binding protein of endothelial cells, is the gene for hereditary haemorrhagic telangiectasia type 1. Nat Genet. 1994;8(4):345-351. doi:10.1038/ng1294-345.
27. Pi X, Lockyer P, Dyer LA, et al. Bmper inhibits endothelial expression of inflammatory adhesion molecules and protects against atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012;32(9):2214-2222. doi:10.1161/ATVBAHA.112.252015.
28. Yao Y, Yao J, Radparvar M, et al. Reducing Jagged 1 and 2 levels prevents cerebral arteriovenous malformations in matrix Gla protein deficiency. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(47):19071-19076. doi:10.1073/pnas.1310905110.
29. Jain RK. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 2003;9(6):685-693. doi:10.1038/ nm0603-685.
30. Knight D. Epithelium–fibroblast interactions in response to airway inflammation. Immunol Cell Biol. 2001;79(2):160-164. doi:10.1046/j.1440-1711.2001.00988.x.
31. Osei ET, Brandsma C-A, Noordhoek JA, Timens W, Postma D, Heijink I. Crosstalk between epithelium and fibroblasts; implications for COPD. Eur Respir J. 2014;44(Suppl 58):P3899.
32. Ouchi N, Oshima Y, Ohashi K, et al. Follistatin-like 1, a secreted muscle protein, promotes endothelial cell function and revascularization in ischemic tissue through a nitric-oxide synthase-dependent mechanism. J Biol Chem. 2008;283(47):32802-32811. doi:10.1074/jbc.M803440200.
33. Shibanuma M, Mashimo J, Mita A, Kuroki T, Nose K. Cloning from a mouse osteoblastic cell line of a set of transforming-growth-factor-beta 1-regulated genes, one of which seems to encode a follistatin-related polypeptide. Eur J Biochem FEBS. 1993;217(1):13-19.
34. Wilson DC, Marinov AD, Blair HC, et al. Follistatin-like protein 1 is a mesenchyme-derived inflammatory protein and may represent a biomarker for systemic-onset juvenile rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2010;62(8):2510-2516. doi:10.1002/art.27485. 35. Murakami K, Tanaka M, Usui T, et al. Follistatin-related protein/follistatin-like 1 evokes an innate immune response via CD14 and toll-like receptor 4. FEBS Lett. 2012;586(4):319-324. doi:10.1016/j. febslet.2012.01.010. 36. Fan N, Sun H, Wang Y, et al. Follistatin-Like 1: A Potential Mediator of Inflammation in Obesity. Mediators Inflamm. 2013;2013:e752519. doi:10.1155/2013/752519.
37. Bellusci S, Henderson R, Winnier G, Oikawa T, Hogan BL. Evidence from normal expression and targeted misexpression that bone morphogenetic protein (Bmp-4) plays a role in mouse embryonic lung morphogenesis. Dev Camb Engl. 1996;122(6):1693-1702.
38. Weaver M, Yingling JM, Dunn NR, Bellusci S, Hogan BL. Bmp signaling regulates proximal-distal differentiation of endoderm in mouse lung development. Dev Camb Engl. 1999;126(18):4005-4015. 39. Sountoulidis A, Stavropoulos A, Giaglis S, et al. Activation of the canonical bone morphogenetic protein (BMP) pathway during lung morphogenesis and adult lung tissue repair. PloS One. 2012;7(8):e41460. doi:10.1371/journal.pone.0041460.
40. Ninomiya N, Michiue T, Asashima M, Kurisaki A. BMP signaling regulates the differentiation of mouse embryonic stem cells into lung epithelial cell lineages. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2013;49(3):230-237. doi:10.1007/s11626-013-9589-1.
from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 2014;32(1):84-91. doi:10.1038/nbt.2754. 42. Huang SXL, Green MD, de Carvalho AT, et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2015;10(3):413-425. doi:10.1038/nprot.2015.023. 43. Morrisey EE, Hogan BLM. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 2010;18(1):8-23. doi:10.1016/j.devcel.2009.12.010. 44. Ross AJ, Dailey LA, Brighton LE, Devlin RB. Transcriptional profiling of mucociliary differentiation in human airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2007;37(2):169-185. doi:10.1165/ rcmb.2006-0466OC.
45. Fahy JV, Dickey BF. Airway Mucus Function and Dysfunction. N Engl J Med. 2010;363(23):2233-2247. doi:10.1056/NEJMra0910061.
46. Hong KU, Reynolds SD, Watkins S, Fuchs E, Stripp BR. Basal cells are a multipotent progenitor capable of renewing the bronchial epithelium. Am J Pathol. 2004;164(2):577-588. doi:10.1016/ S0002-9440(10)63147-1.
47. Rock JR, Onaitis MW, Rawlins EL, et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(31):12771-12775. doi:10.1073/pnas.0906850106. 48. Kimura J, Deutsch GH. Key mechanisms of early lung development. Pediatr Dev Pathol Off J Soc
Pediatr Pathol Paediatr Pathol Soc. 2007;10(5):335-347. doi:10.2350/07-06-0290.1.
49. Rawlins EL, Hogan BLM. Epithelial stem cells of the lung: privileged few or opportunities for many? Dev Camb Engl. 2006;133(13):2455-2465. doi:10.1242/dev.02407.
50. Kotton DN, Morrisey EE. Lung regeneration: mechanisms, applications and emerging stem cell populations. Nat Med. 2014;20(8):822-832. doi:10.1038/nm.3642. 51. Schamberger AC, Staab-Weijnitz CA, Mise-Racek N, Eickelberg O. Cigarette smoke alters primary human bronchial epithelial cell differentiation at the air-liquid interface. Sci Rep. 2015;5. doi:10.1038/ srep08163. 52. Saetta M, Turato G, Baraldo S, et al. Goblet cell hyperplasia and epithelial inflammation in peripheral airways of smokers with both symptoms of chronic bronchitis and chronic airflow limitation. Am J Respir Crit Care Med. 2000;161(3 Pt 1):1016-1021. doi:10.1164/ajrccm.161.3.9907080.
53. Gamez AS, Gras D, Petit A, et al. Supplementing defect in club cell secretory protein attenuates airway inflammation in COPD. Chest. 2015;147(6):1467-1476. doi:10.1378/chest.14-1174.
54. Pilette C, Godding V, Kiss R, et al. Reduced epithelial expression of secretory component in small airways correlates with airflow obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 2001;163(1):185-194. doi:10.1164/ajrccm.163.1.9912137.
55. Guha A, Vasconcelos M, Cai Y, et al. Neuroepithelial body microenvironment is a niche for a distinct subset of Clara-like precursors in the developing airways. Proc Natl Acad Sci. 2012;109(31):12592-12597. doi:10.1073/pnas.1204710109.
56. Barnes PJ. CLub cells, their secretory protein, and copd. Chest. 2015;147(6):1447-1448. doi:10.1378/ chest.14-3171.
57. Hung KS. Development of neuroepithelial bodies in pre- and postnatal mouse lungs: scanning electron microscopic study. Anat Rec. 1982;203(2):285-291. doi:10.1002/ar.1092030210.
58. Reynolds SD, Giangreco A, Power JH, Stripp BR. Neuroepithelial bodies of pulmonary airways serve as a reservoir of progenitor cells capable of epithelial regeneration. Am J Pathol. 2000;156(1):269-278. doi:10.1016/S0002-9440(10)64727-X.
59. Shijubo N, Itoh Y, Yamaguchi T, et al. Clara cell protein-positive epithelial cells are reduced in small airways of asthmatics. Am J Respir Crit Care Med. 1999;160(3):930-933. doi:10.1164/ ajrccm.160.3.9803113.
60. Rokicki W, Rokicki M, Wojtacha J, Dżeljijli A. The role and importance of club cells (Clara cells) in the pathogenesis of some respiratory diseases. Kardiochirurgia Torakochirurgia Pol Pol J Cardio-Thorac Surg. 2016;13(1):26-30. doi:10.5114/kitp.2016.58961.
61. Bernard A, Marchandise FX, Depelchin S, Lauwerys R, Sibille Y. Clara cell protein in serum and bronchoalveolar lavage. Eur Respir J. 1992;5(10):1231-1238.
62. Vestbo J, Edwards LD, Scanlon PD, et al. Changes in Forced Expiratory Volume in 1 Second over Time in COPD. N Engl J Med. 2011;365(13):1184-1192. doi:10.1056/NEJMoa1105482.
63. Park HY, Churg A, Wright JL, et al. Club cell protein 16 and disease progression in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 2013;188(12):1413-1419. doi:10.1164/rccm.201305-0892OC.
9
64. Lomas DA, Silverman EK, Edwards LD, et al. Evaluation of serum CC-16 as a biomarker for COPD inthe ECLIPSE cohort. Thorax. 2008;63(12):1058-1063. doi:10.1136/thx.2008.102574.
65. Guerra S, Halonen M, Vasquez MM, et al. The relation of circulating CC16 to lung function growth, decline, and development of COPD across the lifespan. Lancet Respir Med. 2015;3(8):613-620. doi:10.1016/S2213-2600(15)00196-4.
66. Myllärniemi M, Lindholm P, Ryynänen MJ, et al. Gremlin-mediated decrease in bone morphogenetic protein signaling promotes pulmonary fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 2008;177(3):321-329. doi:10.1164/rccm.200706-945OC.
67. De Langhe E, Cailotto F, De Vooght V, et al. Enhanced endogenous bone morphogenetic protein signaling protects against bleomycin induced pulmonary fibrosis. Respir Res. 2015;16:38. doi:10.1186/s12931-015-0202-x.
68. Cibois M, Luxardi G, Chevalier B, et al. BMP signalling controls the construction of vertebrate mucociliary epithelia. Development. 2015;142(13):2352-2363. doi:10.1242/ dev.118679.
69. Tadokoro T, Gao X, Hong CC, Hotten D, Hogan BLM. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Dev Camb Engl. 2016;143(5):764-773. doi:10.1242/dev.126656.
70. Adams D, Larman B, Oxburgh L. Developmental expression of mouse Follistatin-like 1 (Fstl1): Dynamic regulation during organogenesis of the kidney and lung. Gene Expr
Patterns. 2007;7(4):491-500. doi:10.1016/j.modgep.2006.10.009.
71. Siafakas NM, Antoniou KM, Tzortzaki EG. Role of angiogenesis and vascular remodeling in chronic obstructive pulmonary disease. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2007;2(4):453-462. 72. Hashimoto M, Tanaka H, Abe S. Quantitative analysis of bronchial wall vascularity in the medium and small airways of patients with asthma and COPD. Chest. 2005;127(3):965-972. doi:10.1378/chest.127.3.965. 73. Morty RE, Nejman B, Kwapiszewska G, et al. Dysregulated bone morphogenetic protein signaling in monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007;27(5):1072-1078. doi:10.1161/ATVBAHA.107.141200. 74. Takahashi K, Kogaki S, Matsushita T, Nasuno S, Kurotobi S, Ozono K. Hypoxia induces alteration of bone morphogenetic protein receptor signaling in pulmonary artery endothelial cell. Pediatr Res. 2007;61(4):392-397. doi:10.1203/pdr.0b013e3180332cba. 75. Long L, Crosby A, Yang X, et al. Altered Bone Morphogenetic Protein and Transforming Growth Factor-β Signaling in Rat Models of Pulmonary Hypertension. Circulation. 2009;119(4):566-576. doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.108.821504.
76. Cahill E, Rowan SC, Sands M, et al. The pathophysiological basis of chronic hypoxic pulmonary hypertension in the mouse: vasoconstrictor and structural mechanisms contribute equally.
