Erfelijke bloedingsneigingen met granule-defecten veroorzaakt door transcriptiefactormutaties

(1)

113

SUMMARY

The transcription factors GATA1, GFI1B, RUNX1, and FLI1 play a key role in normal megakaryopoiesis and the formation of platelets. Mutations in these genes in inherited bleeding disorders result in overlapping phenotypes. This suggests that these transcription factors are involved in the same processes and pos- sibly influence each other’s function and or expression.

Since transcription factors determine to a great extent which proteins are expressed in a cell, the mutated transcription factors could be used to identify biologi- cal pathways that are crucial in platelet development.

In this review we will discuss the symptoms and mo- lecular mechanisms of identified mutations in GATA1, GFI1B, RUNX1 and FLI1 in individuals with inherited bleeding disorders.

1onderzoeker in opleiding, 2universitair hoofddocent, Laboratorium Geneeskunde, Laboratorium Hematologie, Radboudumc.

Correspondentie graag richten aan dhr. dr. B. van der Reijden, Laboratorium Geneeskunde, Laboratorium Hematologie, Radboudumc, Geert Grooteplein-Zuid 10, 6524 GA Nijmegen, tel.: 024 361 04 01, e-mailadres: bert.vanderreijden@radboudumc.nl

Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld.

Trefwoorden: erfelijke bloedingsneigingen, granule-deficiënties, transcriptiefactormutaties, trombocytopenie Keywords: inherited bleeding disorders, granule deficiencies, transcription factor mutations, thrombocytopenia ONTVANGEN 11 JULI 2018, GEACCEPTEERD 3 JANUARI 2019.

Erfelijke bloedingsneigingen met

granule-defecten veroorzaakt door transcriptiefactormutaties

Inherited bleeding disorders with granule defects caused by transcription factor mutations

R. van Oorschot, Msc1, M.G.J.M. van Bergen, Msc1, dr. B.A. van der Reijden2 SAMENVATTING

De transcriptiefactoren GATA1, GFI1B, RUNX1 en FLI1 spelen een belangrijke rol bij normale megakaryo- poëse en het ontstaan van bloedplaatjes. Erfelijke mutaties in deze transcriptiefactoren veroorzaken bloedingsneigingen met overlappende fenotypen. Dit suggereert dat ze een rol spelen in dezelfde moleculaire processen of mogelijk elkaars functie en/of expressie beïnvloeden. Aangezien transcriptiefactoren in belangrijke mate bepalen welke eiwitten in een cel worden gemaakt, kunnen de mutanten worden gebruikt om biologische paden te identificeren die bijdragen aan bloedplaatjesontwikkeling. In dit over- zichtsartikel wordt ingegaan op de symptomen en mechanismen van de gevonden mutaties in GATA1, GFI1B, RUNX1 en FLI1 bij individuen met erfelijke bloedingsneigingen.

(NED TIJDSCHR HEMATOL 2019;16:113-21)

INLEIDING

Bloedplaatjes worden gevormd door megakaryocyten. Tijdens de megakaryopoëse ondergaan onrijpe megakaryoblasten endomitose waarbij DNA-replicatie plaatsvindt, maar geen celdeling. Vervolgens worden α- en δ-granulen gevormd, die factoren bevatten die de stolling stimuleren. De hierbij ont- stane mature megakaryocyten migreren naar bloedvaatjes in het beenmerg waar zij uitstulpingen, genaamd proplaatjes, door de bloedvatwand steken en vervolgens bloedplaatjes afgeven in de bloedstroom. Bij erfelijke bloedingsneigingen

ontstaan als gevolg van mutaties in het DNA verstoringen bij de vorming van eiwitten die belangrijk zijn voor mega- karyopoëse, en uiteindelijk goed functionerende bloedplaatjes en/of een tekort daaraan. Deze mutaties komen voor in veel verschillende genen. Meest voorkomend zijn mutaties in von-willebrandfactor (1 in 100-1.000) en factor VIII (1 in 5.000-10.000 mannen), wat respectievelijk leidt tot von- willebrandziekte en hemofilie A. Mutaties in andere genen zijn zeer zeldzaam. Zo zijn mutaties in transcriptiefactoren slechts in enkele families gevonden.

(2)

OVERZICHTSARTIKELEN

3

114

K345E R337W

R337Q

PNT ETS

Transactivatie

1 99 198 280 365 452

Y343C DNA-binding

N331fs R324W SNAG

Q287*

C168F

ZV1 ZV2 ZV3 ZV4 ZV5 ZV6

163 186 192 214 220 242 248 270 276 298 304 327 1 20

K265* G272fs H294fs

S185fs homozygoot

C165F

GFI1B-p37

c.2520+1_520+8delGTGGGCAC

NM_004188.6

NM_001135031.1 = GFI1B-p32, mist ZV 1-2 van aminozuren 171-216

L308P homozygoot

N-TAD

V205M

N-ZV C-ZV C-TAD

204 228 258 282 319 413 1 83

GATA1

G208S G208R R216Q

R216W D218Y D218G

D218N X414Rext42

NM_002049.3

RUNX1

FLI1

DNA-binding DNA-binding

FOG1/LMO2- binding

NM_001754.4

A

B

C

D

LSD1-binding

RUNT TAD ID

DNA- & CBFβ-binding NLS

K110E

c.351+1G>T c.442_449del R201Q, R201* Y287*

R204Q, R204*

A156E

R166Q Q335R

Q154fs A134P

1 77 204 323 439 480

NM_002017.4

T246fs

FIGUUR 1. Gevonden mutaties in GATA1, GFI1B, RUNX1 en FLI1 bij individuen met erfelijke bloedingsneigingen. GATA1 (A), GFI1B (B), RUNX1 (C) en FLI1 (D) zijn schematisch weergegeven, met de verschillende functionele domeinen (nummers boven de domeinen geven de aminozuurposities weer) en de gevonden mutaties bij individuen met erfelijke bloedingsneigingen.

De NM-nummers geven aan van welk transcript het eiwit is weergegeven. De mutaties zijn heterozygoot wanneer niet anders vermeld. (A) N/C-terminaal transactivatiedomein (N/C-TAD); N/C-zinkvinger (N/C-ZV). (B) De meest voorkomende isovorm GFI1B-p37 is weergegeven. GFI1B-p32 mist intact zinkvinger 1 en 2 (aminozuren 171-216), waardoor enkele varianten alleen GFI1B-p37 treffen. ‘Snail’/GFI1-domein (SNAG); zinkvinger (ZV). (C) Nucleair lokalisatiesignaal (NLS); transactivatiedomein (TAD); intermediair domein (ID). (D) ‘Pointed’ domein (PNT); E26 transformatie-specifiek domein (ETS).

De identificatie van mutaties onderliggend aan erfelijke bloedingsneigingen hebben veel inzicht gegeven in welke eiwitten belangrijk zijn voor de productie en functie van bloedplaatjes. Met name van mutaties in transcriptiefactoren kan veel worden geleerd, aangezien deze vaak bij meerdere biologische paden betrokken zijn. De transcriptiefactoren GATA1, GFI1B, RUNX1 en FLI1 werken tijdens megakaryopoëse samen in verschillende eiwitcomplexen en kunnen ook el-

kaars expressie beïnvloeden. Zo kunnen GATA1 en GFI1B in complex de expressie van verschillende genen remmen, waaronder GFI1B zelf.^1,2 Daarnaast is in primaire megakaryoblasten door middel van globale DNA-interactieonder- zoeken gevonden dat GATA1, FLI1 en RUNX1 veel overeen- komstige ‘targets’ hebben.³ Tot slot is op eiwitniveau de interactie van RUNX1 met zowel GATA1 als FLI1 aangetoond.^4,5 De hoogstwaarschijnlijke coöperatie van deze vier

(3)

115

transcriptiefactoren in genexpressieregulatie uit zich in overlappende symptomen als gevolg van mutaties, waaronder bloedingsneigingen met macro-trombocytopenie en granule- defecten. Wij geven een overzicht van de symptomen en moleculaire mechanismen van verschillende mutaties in de transcriptiefactoren GATA1, GFI1B, RUNX1 en FLI1.

‘GATA-BINDING PROTEIN 1’ (GATA1)

GATA1 is cruciaal in de ontwikkeling van erytrocyten en megakaryocyten. Erfelijke (X-gebonden) mutaties in dit gen leiden dan ook tot bloedingsneigingen en ernstige erytrocytafwijkingen, met name bij mannen. De bloedingsneigingen uiten zich onder meer in blauwe plekken, petechiën, bloed- neuzen en aanhoudende bloedingen na een verwonding of operatie. Deze bloedingen worden veroorzaakt door trombocytopenie in combinatie met bloedplaatjesdefecten zoals vergrote bloedplaatjes, verminderde aggregatiefuncties en een duidelijke afname in α-granules. Daarnaast is in het beenmerg van verschillende GATA1-gemuteerde patiënten dysmegakaryopoëse met hyperproliferatie van (immature) megakaryocyten beschreven.^6-10 Naast de bloedplaatjes zijn dus ook de megakaryocyten aangedaan.

GATA1 bevat twee zinkvingers die uit eiwitstructuren bestaan die gespecialiseerd zijn in DNA-, RNA- of eiwitbinding. De C-terminale zinkvinger bindt de consensus-DNA-sequentie (A/T)GATA(A/G), terwijl de N-terminale zinkvinger de DNA- interactie stabiliseert en binding met co-regulatoire eiwitten zoals Friend of GATA1 (FOG1) en het TAL1-eiwit-complex (LMO2, LDB1, TAL1 en E2A) aangaat.¹¹ Het TAL1-complex bindt aan GATA1 via LMO2, waarna genactivatie wordt gerealiseerd.¹² Daarnaast kunnen FOG1 en GATA1 samen zowel genrepressie als genactivatie bewerkstelligen.¹³ Alle tot nog toe beschreven GATA1-‘missense’-mutaties zijn aanwezig in de N-terminale zinkvinger (zie Figuur 1A, pagina 114). De locatie van de mutaties en de resulterende aminozuurveranderingen bepalen het klinisch beeld. Zo veroorzaken ‘missense’-mutaties onder andere (macro)trombocytopenie met ernstige dyserytropoëtische anemie (gevonden bij V205M, G208R en D218Y), milde dyserytropoëse (bij G208S, D218G en D218N), β-thalassemie (bij R216Q) of congenitale erytropoëtische porfyrie (bij R216W).¹⁴ Een uit- gebreide beschrijving van de symptomen is gepresenteerd in Tabel 1. De hierboven genoemde fenotypen worden veroorzaakt door een verstoorde interactie met FOG1 bij de V205M-, G208R-, G208S- en D218Y-mutanten of LMO2 bij de R216Q- en D218G-mutanten, waardoor verlies van functie optreedt.

Het mechanisme voor R216W is nog niet onderzocht.

Naast mutaties in de N-terminale zinkvinger, is een zeldzame mutatie gevonden (X414Rext42) waardoor het stopcodon ver- andert in een arginine, resulterend in een 42 aminozuren langer

GATA1-eiwit. De indexpatiënt bleek een historie van blauwe plekken te hebben, milde trombocytopenie met macro- trombocyten en een vermindering in α-granules.¹⁵ Verder is kenmerkend dat erytrocyten van aangedane familieleden de Lutheran-bloedgroepantigenen a en b missen (Lu(a-b)-fenotype). Ook voor deze mutatie is nog onduidelijk hoe deze bijdraagt aan het ontstaan van de bloedingsneigingen.

‘GROWTH FACTOR INDEPENDENCE 1B’ (GFI1B) Net als GATA1, reguleert GFI1B zowel megakaryopoëse als erytropoëse. Patiënten met GFI1B-mutaties hebben echter voornamelijk last van een versterkte bloedingsneiging. Hoewel voor enkele mutaties morfologische erytrocytenafwijkingen zijn beschreven, resulteert dit niet in anemie (zie Tabel 2, pagina 117). GFI1B bevat een N-terminaal ‘Snail’/GFI1 (SNAG)-domein wat een interactie kan aangaan met trans- criptieregulatoire eiwitten, en zes C-terminale zinkvingers, waarvan zinkvinger drie tot en met vijf essentieel zijn voor DNA-binding.¹⁶ Van de overige zinkvingers is de functie nog onbekend. Heterozygote truncerende mutaties in het DNA-bindend domein (G272fs, Q287*, H294fs) resulteren in autosomaal dominante bloedingsneigingen, geassocieerd met macrotrombocytopenie, hypogranulaire bloedplaatjes, erytrocytafwijkingen (anisopoikilocytose) en een vermeer- dering van het aantal megakaryocyten in het beenmerg die dysplastisch zijn.^17-19 Daarnaast is op de bloedplaatjes CD34-expressie gevonden die normaal alleen voorkomt op stam- en voorlopercellen. Deze truncerende mutanten zijn dominant-negatief, wat betekent dat ze de represserende functie van GFI1B op genexpressie hebben verloren en daarnaast wildtype GFI1B remmen.

Bij één individu met een factor-V-Leiden-mutatie is additioneel een truncerende GFI1B-mutatie gevonden (K265*) in het DNA-bindend domein (zie Tabel 2 en Figuur 1B). Deze patiënt vertoonde een bloedingsneiging met trombocytopenie, verstoorde bloedplaatjesaggregatie en verminderd aantal α- en δ-granulen. In tegenstelling tot de andere truncerende mutaties, resulteerde K265* in een vermindering van het aantal megakaryocyten.²⁰ Of deze mutant ook dominant-negatief werkt, moet nog worden onderzocht.

Naast truncerende dominant-negatieve mutanten zijn er ook mutaties gevonden die de balans tussen GFI1B-isovormen p37 en p32 veranderen (zie Tabel 2 en Figuur 1B). GFI1B-p37 is de meest voorkomende isovorm en GFI1B-p32 wordt gevormd door alternatieve ‘splicing’ waarbij exon 4 wordt overgeslagen.

Dit resulteert in een eiwit dat zinkvingers één en twee (deels) mist. Een homozygote insertie c.551insG, aanwezig in een Tsjetsjeense familie, veroorzaakt een voortijdig stopcodon (p.Ser185Leufs*3). Deze mutatie treft alleen de GFI1B-isovorm p37, omdat de mutatie in exon 4 is gelegen. De meerder-

(4)

OVERZICHTSARTIKELEN

3

116

heid van het p37-coderende transcript (met voortijdig stopcodon) wordt afgebroken door ‘nonsense-mediated-mRNA decay’. Hierdoor komt op eiwitniveau alleen GFI1B-p32 tot expressie. Aangedane individuen hebben een zeer ernstige bloedingsneiging en hypogranulaire bloedplaatjes met een verminderde aggregatiereactie. De megakaryocyten zijn klein, dysplastisch en brengen, net als de bloedplaatjes, CD34 tot expressie. Interessant is dat de erytrocyten niet zijn aangedaan, wat suggereert dat GFI1B-p32 voldoende is voor erytropoëse, maar niet voor megakaryopoëse.²¹ Verder is in een familie

een heterozygote ‘splice’-variant c.2520+1_2520+8delGTG- GGCAC gevonden die de productie van de p37-isovorm waarschijnlijk remt. Aangedane individuen vertoonden geen bloedingsneiging, maar wel verhoogde bloedplaatjes CD34- expressie.²² Mogelijk is als gevolg van de heterozygote variant nog voldoende GFI1B-p37 aanwezig waardoor er geen bloedingsneiging ontstaat.

Daarnaast zijn er ‘missense’ varianten C165F, C168F en L308P gevonden die gelokaliseerd zijn in de niet-DNA-bindende zinkvingers één en zes (Tabel 2; Figuur 1B).^20,22,23‘Missense’- TABEL 1. GATA1-varianten.

Variant DNA-niveau

Variant eiwitniveau

Fenotype Ref.

‘Missense’-varianten N-terminale zinkvinger

c.613G>A p.V205M Twee aangedane broers met ernstige anemie en bloedingsneiging, macrotrombocytopenie (~20 x 10⁹/l), α-granulevermindering, veel kleine dysplastische megakaryocyten en dyserytropoëse

6

c.622_623

delGGinsTC p.G208S Vier aangedane familieleden met een ernstige bloedingsneiging, macrotrombocytopenie (~30 x 10⁹/l), α-granulevermindering, veel megakaryocyten soms met nucleusafwijkingen en milde dyserytropoëse

7, 44

c.622G>C p.G208R Twee onafhankelijke families met macrocytische anemie en een ernstige tot milde bloedingsneiging, macrotrombocytopenie (~10-50 x 10⁹/l), minder megakaryocyten (klein), dyserytropoëse en organomegalie (lever en milt)

45, 46

c.647G>A p.R216Q Vier onafhankelijke families met een matige bloedingsneiging, macrotrombocytopenie (~20-100 x 10⁹/l), α-granulevermindering, β-thalassemie en splenomegalie, meer dysplastische megakaryocyten (klein) en in enkele gevallen hemolytische anemie en dyserytropoëse

8, 47-49

c.646C>T p.R216W Eén aangedane man met anemie, thalassemie intermedia, congenitale

erytropoëtische porfyrie, trombocytopenie (~70 x 10⁹/l), minder megakaryocyten (klein, dysplastisch), dyserytropoëse en splenomegalie

50

c.653A>G p.D218G Dertien aangedane familieleden met een matige bloedingsneiging, macrotrombocytopenie (~15-30 x 10⁹/l), α-granulevermindering, meer megakaryocyten (klein, dysplastisch), dyserytropoëse en splenomegalie

9, 51, 52

c.652G>T p.D218Y Zeven aangedane familieleden met macrocytische anemie en een ernstige bloedingsneiging, macrotrombocytopenie (~10-20 x 10⁹/l), α-granulevermindering, dysplastische megakaryocyten, dyserytropoëse en splenomegalie

51, 52

c.652G>A p.D218N Drie aangedane familieleden met een matige bloedingsneiging, macrotrombocytopenie (~70 x 10⁹/l), meer megakaryocyten (immatuur), milde dyserytropoëse en splenomegalie

10

Verlies stopcodon, verlengt GATA1

c.1240T>C X414Rext42 Eén aangedane man met een milde bloedingsneiging, macrotrombocytopenie (~90 x 10⁹/l) en bloedgroep Lu(a-b)

15

Transcript: NM_002049.3

(5)

117

varianten C165F en L308P veroorzaken een milde bloedingsneiging, die afwezig is bij C168F. Alle drie resulteren in macrotrombocytopenie, dan wel met verhoogde bloedplaatjes CD34-expressie voor C165F en C168F, of een vermindering in α- en δ-granulen voor L308P. Daarnaast liet de beenmerg- biopsie van een individu met de L308P-variant een vermeer- dering zien van het aantal megakaryocyten, die soms klein en monolobulair waren. Tot slot rapporteerden wij eerder een

aantal GFI1B-varianten gevonden bij patiënten (‘National Institute for Health Research (NIHR) BioResource rare disease study’) met vermoedelijk een erfelijke bloedingsneiging of bloedplaatjesaandoening.²⁴ Momenteel onderzoeken wij of deze causaal zijn voor de bloedingsneiging.

Samenvattend veroorzaken niet alle tot nu toe gerappor- teerde GFI1B-varianten bloedingsneigingen. De mate van functioneel GFI1B-p37 lijkt te correleren met de ernst van TABEL 2. GFI1B-varianten.

Variant DNA-niveau

Variant eiwitniveau

Fenotype Ref.

‘Missense’-varianten in zinkvinger 1

c.494G>T p.C165F Zes aangedane familieleden met een milde bloedingsneiging, macrotrombocytopenie (76-250 x 10⁹/l) en bloedplaatjes-CD34-expressie

23

c.503G>T p.C168F Drie onafhankelijke families met macrotrombocytopenie (76-143 x 10⁹/l) en bloedplaatjes-CD34-expressie

22

Truncerende varianten in DNA-bindende zinkvingers

c.793A>T p.K265* Eén aangedaan persoon met anemie in eerste maanden, milde tot ernstige bloedingsneigingen, trombocytopenie (30-40 x 10⁹/l), verstoorde aggregatie, α/δ-granulevermindering en minder megakaryocyten (klein, dysplastisch)

20

c.814+1G>C p.G272fs Twee aangedane familieleden met een milde bloedingsneiging, macrotrombocytopenie (70-115 x 10⁹/l), bloedplaatjes-CD34-expressie, α-granulevermindering en dyserytropoëse

19

c.859C>T p.Q287* Twaalf aangedane familieleden met milde tot ernstige bloedingsneigingen, macrotrombocytopenie (42-116 x 10⁹/l), bloedplaatjes-CD34-expressie,

α/δ-granulevermindering, meer megakaryocyten (dysplastisch) en dyserytropoëse

18, 26

c.880dup p.H294fs Twaalf aangedane familieleden met een milde bloedingsneiging, macrotrombocytopenie (72-149 x 10⁹/l), bloedplaatjes-CD34-expressie, α-granulevermindering, verstoorde aggregatie en dyserytropoëse

17

‘Missense’-variant in zinkvinger 6

c.923T>C # p.L308P Eén aangedaan persoon met een milde bloedingsneiging, macrotrombocytopenie (30-50 x 10⁹/l), α/δ-granulevermindering en meer megakaryocyten (dysplastisch)

20

‘Splice’-varianten, GFI1B-isovorm P32>P37

c.551insG # p.S185fs Vier aangedane familieleden met een ernstige bloedingsneiging, macrotrombocytopenie (23-119 x 10⁹/l), bloedplaatjes-CD34-expressie, α-granulevermindering, verstoorde aggregatie, dysplastische megakaryocyten, dyserytropoëse en hypochromia

21

c.2520+1 _520+8del GTGGGCAC

alternatieve splicing exon 4

Zeven aangedane familieleden, alleen bloedplaatjes-CD34-expressie is verhoogd ²²

# homozygoot. Transcript: NM_004188.6

(6)

OVERZICHTSARTIKELEN

3

118

TABEL 3. RUNX1-varianten.

Variant DNA-niveau

Variant eiwitniveau

Fenotype Ref.

RUNT-domeinvarianten

c.328 A>G K110E Veertien aangedane familieleden met hemorragische diathese, abnormale stolling, verminderde bloedplaatsjesaantallen, verminderde δ-granules, drie individuen met myeloblastische leukemie, twee individuen met myelomonoblastische leukemie en drie gevallen van leukemie

29, 53

C.351+1G>T n.b. Vier aangedane familieleden van wie één AML ontwikkelde, bloedplaatjesaantallen 80 x 10⁹/l, beenmerg van een aangedaan familielid vertoonde verminderde kolonievorming richting megakaryocyt, granulocyt-macrofaag en erytroïd

54

c.400 G>C A134P Trombocytopenie, PFA-collageen en epinefrine gestoord, één familielid met AML, bloedplaatjesaantallen 133 x 10⁹/l, 149 x 10⁹/l, 177 x 10⁹/l, 119 x 10⁹/l, 101 x 10⁹/l.

Beenmerg-‘samples’van aangedane personen lieten immature megakaryocyten zien met hoge nucleus-cytoplasma-ratio, sterk basofiele cytoplasma en slecht gelobuleerde nuclei

55

c.442_

449del n.b. Normale bloedplaatjesmorfologie, afwezigheid van ADP-respons en gereduceerde collageen- en arachidonzuurrespons, lage expressie van CD63 en lage ATP-secretie van δ-granules, twee aangedane familieleden van wie één AML ontwikkelde, bloedplaatjesaantallen 50 x 10⁹/l, 120 x 10⁹/l, een beenmerg-‘sample’ liet hyper- cellulair beenmerg zien met blasten (20%) en myelodysplastische kenmerken

56

c.460del Q154fs Vier aangedane familieleden met autosomaal dominante bloedingsneiging, grijze bloedplaatjes en CD34-expressie op bloedplaatjes, bloedplaatjesaantallen 83-111 x 10⁹/l, 51-123 x 10⁹/l, 115-139 x 10⁹/l, 85-106 x 10⁹/l, verminderde plaatjes- eiwitten PF4 en BTG, ADP en ATP, en CD62p (α-granules) en CD63 (δ-granules)

26

c.467 C>A A156E Vijf aangedane familieleden van wie drie AML ontwikkelde na een additionele somatische RUNX1-mutatie

57

c.497 G>A R166Q Vier aangedane familieleden van wie één leukemie ontwikkelde ⁵⁴ c.601 C>T R201* Tien aangedane familieleden van wie vier leukemie ontwikkelde ⁵⁴ c.602 G>A R201Q Negen aangedane individuen van wie vier leukemie ontwikkelde ⁵⁴ c.610 C>T R204* Negen aangedane familieleden van wie vier leukemie ontwikkelde, aangedane

individuen hebben normale megakaryocytenmorfologie en -grootte, elektronmicro- scopie en lichtmicroscopie lieten normale bloedplaatjes zien, bloedplaatjesaantallen 140 x 10⁹/l, perifeer bloed van een aangedaan familielid vertoonde verminderde kolonievorming richting megakaryocyt, granulocyt-macrofaag en erytroïd

54, 58, 59

c.610 C>G R204Q Vier aangedane familieleden van wie een familielid T-ALL ontwikkelde en één familielid AML

57

Intermediaire varianten

c.733delC T246fs Autosomaal dominante trombocytopenie met chronische myelomonocytische leukemie ³⁴ C-terminale varianten

c.861 C>A Y287* Gestoorde aggregatie, verminderde bloedplaatjesaantallen, verminderde α- en δ-granules, fosfolipidedefecten, verminderde ITGA-receptoren, 15 aangedane individuen van wie twee met AML en één overleden aan leukemie

29

c.1004 A>G Q335R Drie aangedane familieleden van wie één AML ontwikkelde en één AML ontwikkelde na T-ALL

57

n.b.=niet beschikbaar. Transcript RUNX1c: NM_001754.4

(7)

119

de symptomen aangezien de dominant-negatieve en homozygote ‘splice’-mutaties leiden tot een bloedingsneiging met eenduidige kwantitatieve en kwalitatieve bloedplaatjesaf- wijkingen, terwijl dit variërend is bij de ‘missense’-varianten en heterozygote ‘splice’-variant. Of de ‘missense’-varianten pathogeen zijn voor alle klinische afwijkingen is onduidelijk.

Identificatie van additionele families zou in de toekomst helderheid kunnen brengen. Voor alle geteste GFI1B-varianten is echter CD34-expressie op de bloedplaatjes gevonden, en daarmee lijkt CD34 een biomarker te zijn voor erfelijke GFI1B-varianten.

‘RUNT-RELATED TRANSCRIPTION FACTOR-1’

(RUNX1)

Er zijn veel verschillende heterozygote varianten geïdentifi- ceerd in RUNX1 (ook bekend als CBFα en AML1), variërend van ‘frameshift’-, ‘missense’- en ‘nonsense’-mutaties tot grote deleties (zie Tabel 3, pagina 118). Deze erfelijke varianten resulteren in bloedingsneigingen, trombocytopenie en bloed- plaatjesdisfunctie (verminderd aantal α- en δ-granulen en aggregatiedefecten).²⁵ Daarnaast is recentelijk beschreven dat mutaties in RUNX1 (Q154fs), net als GFI1B-mutaties, kunnen leiden tot CD34-positieve bloedplaatjes.²⁶ Kenmer-

kend voor erfelijke RUNX1-mutaties is dat ze naast het veroorzaken van een bloedingsneiging een verhoogd risico geven op het ontwikkelen van AML of MDS (‘Familial Plate- let disorder with predisposition to acute myelogenous leukemia’; FPD/AML).²⁵ Omdat de aangedane individuen milde tot matige bloedingsneigingen hebben, wordt de familiaire bloedplaatjesaandoening vaak gemist en alleen de diagnose AML gesteld.²⁷

De meeste RUNX1-mutaties bevinden zich in het RUNT- domein (zie Figuur 1C), dat verantwoordelijk is voor nucleaire lokalisatie, DNA-binding en de interactie met CBFβ om daarmee het heterodimere ‘core binding factor’ (CBF) trans- criptiecomplex te vormen. Meerdere studies onderzochten in vitro het effect van RUNX1-varianten op de verschillende functies van het RUNT-domein. Om de normale functie van RUNX1 uit te voeren moet het eiwit samen met CBFβ naar de nucleus migreren.²⁸ Bij truncerende mutaties (R201*, R204*) is aangetoond dat ze hiertoe niet in staat zijn, waardoor R201*- en R204*-varianten zich bijna exclusief in het cytoplasma bevinden en dus haplo-insufficiëntie veroorzaken.

Dit in tegenstelling tot ‘missense’-mutaties op dezelfde positie (R201Q, R204Q) die wel goed naar de kern migreren, waarbij de interactie met CBFβ nog intact is.²⁹ Voor R201Q is TABEL 4. FLI1-varianten.

Variant DNA-niveau

Variant eiwitniveau

Fenotype Ref.

‘Missense’-varianten N-terminale zinkvinger

c.970 C>T R324W Twee aangedane familieleden met gematigde trombocytopenie (65 x 10⁹/l, 76 x 10⁹/l), grote gefuseerde α-granules, afwezigheid van collageen-geïnduceerde plaatjesaggregatie en MYH10-expressie op de bloedplaatjes

37

c.992-995del N331fs Milde bloedingsneiging met trombocytopenie (142 x 10⁹/l, 157 x 10⁹/l) δ-granule- afwijking en MYH10-expressie op de bloedplaatjes

60

c.1009C>T R337W Milde bloedingsneiging met trombocytopenie (244 x 10⁹/l, 180 x 10⁹/l), alopecia, eczeem, psoriasis en virale infecties. δ-granulesecretiedefect, verminderde ATP-secretie

60

c.1010 G>A R337Q Twee aangedane familieleden met milde (macro)trombocytopenie (154 x 10⁹/l, 131 x 10⁹/l), normale coagulatie, verminderde ATP-secretie en MYH10-expressie op de bloedplaatjes

43

c.1028A>G Y343C Milde bloedingsneiging met trombocytopenie (92 x 10⁹/l, 117 x 10⁹/l), alopecia en eczeem, δ-granulesecretiedefect, MYH10-expressie op de bloedplaatjes

60

c.1033 A>G K345E Eén aangedaan familielid met macrotrombocytopenie (140 x 10⁹/l), normale coagulatie, verminderde ATP-secretie en MYH10-expressie op de bloedplaatjes

43

Transcript: NM_002017.4

(8)

OVERZICHTSARTIKELEN

3

120

echter de DNA-binding verstoord en remt de mutant wildtype RUNX1 dominant-negatief, mogelijk door CBFβ weg te vangen. Hetzelfde werd waargenomen bij de K110E-mutant.^29,30 Daarnaast is voor K110E gevonden dat de ubiquitinering (markering voor proteasomale afbraak), die normaal op K110 plaatsvindt, verstoord is waardoor het gemuteerde eiwit sta- bieler is.³¹ Hierdoor is de K110E-mutant in staat meer CBFβ weg te vangen. Hoewel veel van de geïdentificeerde mutaties zich in het RUNT-domein bevinden, zijn er ook mutaties gevonden in het intermediaire domein en het transactivatiedomein. De C-terminus van RUNX1 kan zowel activatie als repressie induceren door middel van co-factor-interacties via het transactivatiedomein.^32,33 Een ‘frameshift’-mutatie in het intermediaire domein (T246Rfs) resulteert in verlies van het transactivatiedomein. Het RUNT-domein en daarmee de DNA-binding en CBFβ-interactie zijn nog intact, waardoor het gemuteerde eiwit RUNX1 ‘target sites’ bezet houdt en daarmee wildtype RUNX1 dominant-negatief remt.³⁴ De truncerende mutatie Y287* bevindt zich midden in het transactivatiedomein van RUNX1 en verwijderd daarmee een deel van de C-terminus.²⁹ Correctie van deze mutatie in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) van de patiënt resulteerde in herstelde megakaryopoëse in vitro, wat bewijst dat Y287* verantwoordelijk is voor bloedplaatjesdefecten.³⁵ Het gebruik van iPSC’s bij onderzoek naar transcriptiefactoren in megakarypoëse kan dus veel infor- matie verschaffen over de pathogeniciteit van varianten en het onderliggende mechanisme.

‘FRIEND LEUKAEMIA INTEGRATION 1’ (FLI1) FLI1 bevindt zich op chromosoom 11 (11q23.3) en is mono- allelisch (hemizygoot) gedeleteerd bij Paris-Trousseau en het Jacobsen-syndroom als gevolg van een 11q-deletie.³⁶ Deze syndromen leiden tot milde trombocytopenie, afwezige collageen-geïnduceerde aggregatie en gefuseerde α-granules.^37,38 Recentelijk is gevonden dat de hemizygote FLI1-deletie de bloedingsfenotypen bij deze patiënten veroorzaakt.^39,40 FLI1 is een transcriptiefactor die een ‘E26 transformation specific’ (ETS)-domein bevat dat DNA bindt via GGA(A/T) DNA-motieven en een N-terminaal domein, dat belangrijk is voor transactivatie. FLI1 oefent zijn functie uit via een interactie met ‘GA binding protein transcription factor α subunit’ (GABPα) die ook tot de ETS-transcriptiefactor- familie behoort.⁴¹ FLI1 reguleert megakaryocytaire genen zoals C-MPL (trombopoëtinereceptor), waarbij het ook een interactie kan aangaan met RUNX1.⁴

Recentelijk gepubliceerde aangedane individuen met ‘missense’- en ‘frameshift’-mutaties (R324W, N331Tfs*4, R337W, R337Q, Y343C, K345E) in FLI1 vertonen bloedingsneigingen met macrotrombocytopenie, gefuseerde α-granules en ver-

minderde ATP-secretie uit de δ-granules (zie Tabel 4). Er is dus geen vermindering van α-granules zoals bij GATA1-, GFI1B- en RUNX1-varianten. Alle varianten liggen in het ETS-domein (zie Figuur 1D). De DNA-binding is dan ook verstoord voor R324W, R337W en Y343C. Voor de andere varianten (N331Tfs*4, R337Q, K345E) is dit niet bepaald, maar het is zeer aannemelijk dat dit hiervoor ook geldt.

Kenmerkend voor erfelijke FLI1-defecten is de verhoogde expressie van MYH10 op de bloedplaatjes van aangedane personen.^42,43 RUNX1 reguleert expressie van MYH10 via FLI1, en bij verschillende onderzochte varianten in RUNX1 bleek ook verhoogde expressie van MYH10 op bloedplaatjes aanwezig te zijn.⁴² MYH10 lijkt dus een goede biomarker te zijn voor zowel FLI1- als RUNX1-varianten.

CONCLUSIE

De effecten van erfelijke mutaties in GATA1, GFI1B, RUNX1 en FLI1 vertonen veel overlap, wat zou kunnen worden ver- klaard door de biologische paden die ze samen reguleren.

We zijn nu op het punt waar geïdentificeerde mutanten kunnen worden gebruikt om de samenwerking van GATA1, GFI1B, RUNX1 en FLI1 tijdens megakaryopoëse in beeld te brengen. Hiervoor kunnen patiënt-afgeleide iPSC-lijnen worden gebruikt, waarmee een ongelimiteerde productie van de anders moeilijk bereikbare megakaryocyten te bewerkstelligen valt. Vanuit de iPSC-gedifferentieerde gezonde en gemuteerde megakaryocyten kan vervolgens worden bepaald waar transcriptiefactoren op het DNA binden, welke genen ze reguleren en welke eiwitten uiteindelijk differentieel tot expressie komen. Met nieuwe gen-‘editing’-technieken kunnen vervolgens mutaties worden hersteld om daarmee

‘target’-genen en biologische paden te valideren.

Los van onderzoek blijft het erg belangrijk om identificatie van nieuwe (pathogene) varianten te rapporteren, zodat betere genotype-fenotypecorrelaties kunnen worden gemaakt.

Het rapporteren van niet-pathogene varianten kan veel inzicht geven in de transcriptiefactordomeinen die daadwerkelijk belangrijk zijn voor de functie van het eiwit. Hopelijk worden bijvoorbeeld biomarkers zoals CD34 en MYH10 in de toekomst toegevoegd, zodat duidelijk wordt of inderdaad alle RUNX1-varianten voor verhoogde CD34- en MYH10- expressie zorgen.

REFERENTIES

1. Huang DY, et al. Nucleic Acids Res 2005;33:5331-42.

2. Kuo YY, et al. Mol Cell Biol 2007;27:4261-72.

3. Tijssen MR, et al. Dev Cell 2011;20:597-609.

4. Huang H, et al. Mol Cell Biol 2009;29:4103-15.

5. Elagib KE, et al. Blood 2003;101:4333-41.

6. Nichols KE, et al. Nat Genet 2000;24:266-70.

(9)

121

7. Mehaffey MG, et al. Blood 2001;98:2681-8.

8. Balduini CL, et al. Thromb Haemost 2004;91:129-40.

9. Freson K, et al. Blood 2001;98:85-92.

10. Hermans C, et al. Platelets 2014;25:305-7.

11. Daly ME. Blood Rev 2017;31:1-10.

12. Tripic T, et al. Blood 2009;113:2191-201.

13. Miccio A, et al. EMBO J 2010;29:442-56.

14. Freson K, et al. Platelets 2017:1-4.

15. Singleton BK, et al. Br J Haematol 2013;161:139-42.

16. Van der Meer LT, et al. Leukemia 2010;24:1834-43.

17. Stevenson WS, et al. J Thromb Haemost 2013;11:2039-47.

18. Monteferrario D, et al. N Engl J Med 2014;370:245-53.

19. Kitamura K, et al. J Thromb Haemost 2016;14:1462-9.

20. Ferreira CR, et al. Mol Genet Metab 2017;120:288-94.

21. Schulze H, et al. Haematologica 2017;102:e375-8.

22. Rabbolini DJ, et al. J Thromb Haemost 2017;15:2245-58.

23. Uchiyama Y, et al. Br J Haematol 2018;181:843-7.

24. Chen L, et al. Science 2014;345:1251033.

25. Songdej N, et al. Platelets 2017;28:20-6.

26. Marneth AE, et al. Blood 2017;129:1733-6.

27. Jongmans MC, et al. Leukemia 2010;24:242-6.

28. Lu J, et al. Mol Cell Biol 1995;15:1651-61.

29. Michaud J, et al. Blood 2002;99:1364-72.

30. Berardi MJ, et al. Structure 1999;7:1247-56.

31. Huang G, et al. EMBO J 2001;20:723-33.

32. Imai Y, et al. Biochem Biophys Res Commun 1998;252:582-9.

33. Chuang LSH, et al. Int J Cancer 2013;132:1260-71.

34. Heller PG, et al. Blood 2005;105:4664-70.

35. Connelly JP, et al. Blood 2014;124:1926-30.

36. Jacobsen P, et al. Human Heredity 1973;23:568-85.

37. Stevenson WS, et al. Blood 2015;126:2027-30.

38. Favier R, et al. C R Acad Sci III 1993;316:698-701.

39. Favier R, et al. Thromb Haemost 2003;90:893-7.

40. Vo KK, et al. Blood 2017;129:3486-94.

41. Pang L, et al. Blood 2006;108:2198-206.

42. Antony-Debré I, et al. Blood 2012;120:2719-22.

43. Saultier P, et al. Haematologica 2017;102:1006-16.

44. White JG, et al. Platelets 2007;18:273-83.

45. Kratz CP, et al. Leukemia 2008;22:432-4.

46. Del Vecchio GC, et al. Acta Haematol 2005;114:113-6.

47. Yu C, et al. Blood 2002;100:2040-5.

48. Hughan SC, et al. Blood 2005;105:4369-76.

49. Tubman VN, et al. Blood 2007;109:3297-9.

50. Phillips JD, et al. Blood 2007;109:2618-21.

51. Freson K, et al. Hum Mol Genet 2002;11:147-52.

52. Freson K, et al. Hum Genet 2003;112:42-9.

53. Gerrard JM, et al. Br J Haematol 1991;79:246-55.

54. Song WJ, et al. Nature genetics 1999;23:166-75.

55. Walker LC, et al. Br J Haematol 2002;117:878-81.

56. Beri-Dexheimer M, et al. Eur J Hum Genet 2008;16:1014-8.

57. Preudhomme C, et al. Blood 2009;113:5583-7.

58. Dowton SB, et al. Blood 1985;65:557-63.

59. Osato M, et al. Blood 1999;93:1817-24.

60. Stockley J, et al. Blood 2013;122:4090-43.

AANWIJZINGEN VOOR DE PRAKTIJK

1 Bij families met een geschiedenis van bloedingsneigingen, macrotrombocytopenie en een vermindering in α-granules (te herkennen aan grijze bloedplaatjes in de bloedsmeer) is het zinvol om te screenen voor mutaties in GATA1, GFI1B en RUNX1. Daarnaast is het rapporteren van een RUNX1-mutatie belangrijk, omdat deze is geassocieerd met het ontwikkelen van AML of MDS.

2 Aangezien de meeste mutaties maar in één familie zijn beschreven, is het belangrijk om gevonden mutaties te publiceren, zodat betere genotype-fenotypecorrelaties kunnen worden gemaakt.

3 Varianten geassocieerd met abnormale bloedplaatjesmerkers zoals CD34 (voor RUNX1 en GFI1B) en MYH10 (voor RUNX1 en FLI1) kunnen aanwijzingen geven voor gerichte moleculaire diagnose van erfelijke bloedingsneigingen. Daarnaast is analyse van de granulen (morfologisch en met elektronenmicroscopie) belangrijk om mutaties in transcriptiefactoren beter te koppelen aan de ontwikkeling van bloedplaatjes.

4 Met behulp van beschreven mutaties in transcriptiefactoren die belangrijk zijn voor de vorming van normale megakaryocyten, kunnen de genprogramma’s van de transcriptiefactoren steeds beter worden onderzocht.

5 Het ontwikkelen van megakaryocyten uit iPSC’s draagt in belangrijke mate bij aan het onderzoek naar transcriptieregulatie in megakaryopoëse. In combinatie met transcriptoom- en proteoomanalyses en de huidige gen-‘editing’-technieken kunnen vele deuren worden geopend.