University of Groningen
Characterization and computation-supported engineering of an ω-transaminase Meng, Qinglong
DOI:
10.33612/diss.172243517
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2021
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Meng, Q. (2021). Characterization and computation-supported engineering of an ω-transaminase. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.172243517
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
165
SAMENVATTING EN PERSPECTIEVEN
Samenvatting
ω-Transaminases (ω-TAs) zijn PLP-afhankelijke enzymen die steeds belangrijker worden voor de omzetting van ketonen in aminen. De laatste worden gebruikt in een diversiteit aan toepassingen, zoals de synthese van fijnchemicaliën. De hoge enantioselectiviteit van ω-TAs die vaak wordt waargenomen bij asymmetrische aminering reacties, maakt ze bijzonder aantrekkelijk voor de bereiding van chirale bouwstenen voor farmaceutische synthese. Het gebruik van ω-TAs in industriële biokatalyse wordt echter vaak belemmerd door enzyminstabiliteit en een vrij beperkte substraatomvang. Het werk dat in dit proefschrift wordt beschreven, is gericht op het verbeteren van relevante eigenschappen van de fold-type-I homodimere ω-TA van Pseudomonas jessenii (PjTA) via proteïne-engineering, met behulp van computationele ontwerp om de nodige mutaties te vinden (Schema 1).
166
De transaminase PjTA werd eerder ontdekt en gekristalliseerd door onze groep. Het zet van nature 6-aminohexaanzuur om in 6-oxohexaanzuur via de biologische afbraakroute van caprolactam. In Hoofdstuk 2 hebben we de substraatomvang van PjTA onderzocht met 34 verschillende amino donoren, waaronder alifatische aminen, aromatische aminen en proteïnogene en niet-proteïnogene aminozuren. Hiervoor hebben we een gekoppelde enzymtest gebruikt die de vorming van alanine detecteert door het te koppelen aan NADH-afhankelijke regeneratie naar pyruvaat door alaninedehydrogenase. PjTA vertoonde behoorlijke activiteiten ten opzichte van aromatische aminen zoals (S)-1-fenylethylamine, benzylamine en 4-fenylbutylamine, en ook met alifatische aminen zoals 1-aminoheptaan en 1-aminohexaan. Niet-proteïnogene aminozuren die werden geaccepteerd, waren onder meer 6-aminohexaanzuur, 5-aminopentaanzuur en
4-aminobutaanzuur. De activiteiten verschillen met verschillende substraten werden onderzocht door docking simulaties. In vergelijking met de goed bestudeerde ω-TAs van Chromobacterium
violaceum (CvTA) en Vibrio fluvialis (VfTA), vertoonde PjTA een voorkeur voor
6-aminohexaanzuur en 4-aminobutaanzuur. De gemodelleerde structuren van de externe aldiminen van deze twee aminozuren toonden aan dat fenylalanine-zijketens in CvTA (Phe89) en VfTA (Phe85) de ruimte bij de ingang van de actieve site konden beperken door naar een geconserveerde arginine te wijzen (Arg416 in CvTA, Arg415 in VfTA) . Op de corresponderende positie van dit fenylalanine bezit PjTA het kleinere Ser87, wat een ruimere ingang van de actieve site kan verschaffen, waardoor Arg417 een zoutbrug kan vormen met de carboxylaatgroep van een ω-aminozuur. Dit kleine verschil in geometrie van de actieve plaats maakt een dubbele interactie van Arg417 met het substraat mogelijk en de aanwezigheid van Ser87 kan een rol spelen in de rol van dit specifieke enzym in de biologische afbraakroute van caprolactam.
Met het oog op de mogelijke toepassingen van PjTA als biokatalysator voor de synthese van waardevolle amines en de zeer bescheiden stabiliteit van het wildtype enzym, werd PjTA gestabiliseerd door computationele proteïne-engineering (FRESCO) zoals beschreven in
hoofdstuk 3. Volgens eerder onderzoek, de slechte stabiliteit van dimere ω-TAs kan te wijten zijn
aan het verlies van de geamineerde cofactor PMP, waarvan werd voorgesteld om uit de actieve plaats te diffunderen na de eerste half-reactie, die vervolgens wordt gevolgd door onomkeerbare denaturatie. Dissociatie van subeenheden kan deze cofactor-afgifte vergemakkelijken. Na
computationele voorspelling en experimentele verificatie van mutaties die de stabiliteit verbeteren, gaven de ruimtelijke verdeling van de beste stabiliserende mutaties en de mate van stabilisatie aan dat de subunit-interface cruciaal was voor stabiliteit. Na een rationele combinatie van bevestigde stabiliserende mutaties, werden twee robuuste varianten genaamd PjTA-R4 (∆Tmapp = +18 ° C) en
PjTA-R6 (∆Tmapp = +23 ° C) verkregen. Deze varianten waren actiever bij hun respectievelijke hogere optimale temperaturen, toleranter voor cosolvents (DMSO en methanol) aanwezig in reactiemengsels, en accepteerden beter hoge concentraties van de aminedonor isopropylamine dan het wild-type PjTA. Met PjTA-R6 nam de opbrengst van (S)-1-fenylethylamine in reactiemengsels toe tot 92% (ee>99%) onder zware reactieomstandigheden (1 M isopropylamine als de amino
167
donor, 100 mM acetofenon met 20% DMSO bij 56 °C). De kristalstructuren van de PjTA-R4 en PjTA-R6 varianten werden opgelost en bevestigden grotendeels de verwachte structurele
veranderingen. Een zelden beschreven stabilisatiemechanisme, d.w.z. verwijdering van sterische stam, werd geïdentificeerd als het effect van de meest stabiliserende mutatie I154V. Kortom, deze studie van enzymstabiliteit-engineering geeft aan dat het herontwerp van de computationele interface een snelle en krachtige strategie kan zijn voor de stabilisatie van een ω-TA.
Gebaseerd op de activiteit van PjTA, dat van nature inwerkt op alifatische substraten als aminedonor (Hoofdstuk 2), werd de katalytische activiteit van de robuuste variant PjTA-R6 in de synthese van optisch zuivere alifatische amines uit ketonen onderzocht met behulp van de
goedkope amino donor isopropylamine (Hoofdstuk 4). De resultaten toonden aan dat PjTA-R6 betere prestaties vertoonde in termen van productopbrengst en enantioselectiviteit (ee>95%) bij de synthese van tien relevante alifatische aminen dan de homologe enzymen CvTA en VfTA.
Aangezien een zoutbrug tussen de geconserveerde Arg417 en de carboxylaatgroep van een ketozuur dat als amino-acceptor fungeert, een belangrijk en geconserveerd kenmerk is van de actieve plaatsgeometrie van deze transaminasen, werd aangenomen dat de iminiumfunctie van Arg417 afstotende interacties met alifatische substraten die een carboxylaatgroep missen. Aldus werd mutant R417L geconstrueerd omdat het beter alifatische aminen zou kunnen accepteren. De resultaten toonden aan dat de R6 R417L-mutant vergelijkbare prestaties vertoonde als PjTA-R6, wat aangeeft dat de omschakelingsarginine Arg417 inderdaad overbodig is wanneer een carboxylaat functionaliteit in het substraat ontbreekt. Voor een set alifatische aminen vertoonden de Rosetta Interface Energies van PjTA-R6 en VfTA door Rosetta docking simulaties van de externe aldiminen een duidelijke correlatie met de opbrengst aan amine die werd verkregen. De
gekoppelde structuren onthulden verschillen tussen PjTA-R6 en VfTA in aan / uit-posities voor het geconserveerde arginine, wat enkele van de verschillen tussen deze enzymen verklaarde bij het produceren van alifatische aminen.
Na het verkrijgen van twee zeer stabiele varianten van PjTA (Hoofdstuk 3), werd het substraatbereik van de meest robuuste variant PjTA-R6 uitgebreid (Hoofdstuk 5). Eerdere studies hebben beschreven dat de substraatomvang van ω-TAs in asymmetrische amineringsreacties beperkt is vanwege sterische belemmering in de bindingspockets van de actieve plaats die de restgroepen zouden moeten accommoderen die zijn verbonden met de carbonylkoolstof van het keton. Er kunnen een grote en een kleine bindzak worden onderscheiden, waarbij in het geval van PjTA de grote bindzak overlapt met de actieve-site-tunnel die wordt ingenomen door de
carboxyalkylgroep in de kristalstructuur. Veel volumineuze aminen kunnen niet worden
geproduceerd door PjTA en verwante ω-TAs. In Hoofdstuk 5 werden zes volumineuze amines geselecteerd waarvoor PjTA-R6 geen detecteerbare activiteit heeft. Een computationele proteïne-engineeringstrategie werd onderzocht om de bindingspockets van PjTA-R6 opnieuw vorm te geven. Docking simulaties werden gebruikt om modellen van PjTA-R6 te construeren met de externe aldiminevorm van de doelsubstraten gebonden, en de bindingsenergieën werden geminimaliseerd met behulp van het Rosetta-zoekalgoritme. Dit algoritme zoekt naar varianten
168
met lage energie door de identiteiten en rotameer conformaties van een gekozen set residuen rond het gebonden substraat te variëren. In totaal werden zeven residuen (Met54, Leu57, Trp58, Tyr151, Ala230, Ile261 en Arg417) in de grote bindende pocket en één residu in de kleine bindende pocket (Phe86) opgenomen in de zoekruimte voor alle zes substraten. De potentieel verbeterde varianten met lage Rosetta-interface-energie werden verder gefilterd door visuele inspectie en voor elk doelsubstraat werd een kleine bibliotheek gecreëerd voor experimentele verificatie. Deze zes kleine bibliotheken bevatten in totaal 40 unieke ontwerpen en bij testen in het laboratorium produceerden 38 van deze 40 mutanten inderdaad het beoogde enantiomeerzuivere amine (ee>99%). Bovendien werd de stabiliteit van de meeste mutanten niet aangetast door de geïntroduceerde mutaties. Het bleek dat de opbrengsten van zes geselecteerde volumineuze aminen sterk gecorreleerd waren met Rosetta-interface-energieën, wat de voorspellende kracht van Rosetta illustreert. De W58G-mutant vertoonde de beste prestatie bij de synthese van vijf structureel vergelijkbare volumineuze aminen, terwijl de beste mutant voor de synthese van het resterende volumineuze amine
W58M+F86L+R417L was. De kristalstructuren van deze twee beste varianten werden opgelost en bevestigden grotendeels de gemodelleerde structuren. Het vervangen van Trp58 in de grote inbindzak werd geïdentificeerd als een belangrijke stap in het herontwerp van PjTA-R6 om omvangrijke substraten te accepteren. Over het algemeen werd het gebruik van een efficiënte en nauwkeurige computationele methodologie gedemonstreerd voor het uitbreiden van het
substraatbereik van PjTA-R6. We verwachten dat het een vergelijkbare nuttige strategie is voor de engineering van andere ω-TAs.
Perspectieven
In de literatuur (besproken in Hoofdstuk 1) en in dit werk zijn verschillende ω-TAs varianten met een verhoogde stabiliteit en een uitgebreidere substraatomvang verkregen door
proteïne-engineering. Het werk aan PjTA heeft gemanipuleerde varianten opgeleverd die kunnen worden gebruikt bij de asymmetrische synthese van chirale aminen, waaronder alifatische aminen (hoofdstuk 4), aromatische aminen (hoofdstuk 3) en volumineuze aminen (hoofdstuk 5). De opbrengsten van sommige volumineuze aminen in biotransformaties op laboratoriumschaal waren echter beperkt. De beste variant voor de synthese van (S)-6-methoxytetralin-1-amine (PjTA-R6-W58G) gaf bijvoorbeeld slechts een productopbrengst van 29% (hoofdstuk 5) bij testen met een hoge concentratie van de goedkope amino donor isopropylamine.
In veel gevallen zijn de beperkte opbrengsten die worden waargenomen waarschijnlijk het gevolg van de reacties die een thermodynamisch evenwicht bereiken. Dit kan uiteraard niet worden opgelost door verdere enzymtechniek, maar vereist bioprocestechniek, waarbij
productverwijdering een voor de hand liggende optie is. Aldus kan het evenwicht van
transaminase-reacties met isopropylamine als de amino donor mogelijk worden verschoven naar de richting van amineaccumulatie door het vluchtige coproduct aceton te verwijderen terwijl het gewenste amine in het reactiemengsel blijft. In Hoofdstuk 5 werd een lage luchtdruk (40 kPa)
169
getest op zijn effect op de aminesynthese, maar de opbrengst was niet verbeterd aangezien het substraat keton ook verloren ging onder lage luchtdruk. Manieren om aceton te verwijderen terwijl keton in het reactiemengsel blijft, zijn bestudeerd. Hydrofobe pervaporatie met behulp van het vermogen van polydimethylsiloxaanmembranen om een organische component uit een waterige stroom te scheiden, werd bijvoorbeeld gebruikt om de aminering van acetofenon te verbeteren1. Deze methode verminderde, maar elimineerde niet het ketonverlies en verbeterde de
productopbrengst met 13%. Om verlies van het ketonsubstraat te voorkomen, werd ook de continue in situ verwijdering van aceton met behulp van een selectief membraan bestudeerd2. Dit gaf een aanzienlijk verbeterde omzetting van acetofenon (van 50% naar 98%). Ook gekoppelde reacties ter verbetering van de productopbrengst verdienen aandacht. Op kleine schaal werd een enzymatische methode ontwikkeld met in situ gebruik van een specifieke dehydrogenase om aceton te verwijderen3. Het systeem bestond uit een gistalcoholdehydrogenase van S. cerevisiae (acetonreductie) en een formiaatdehydrogenase van Candida boidinii (NADH-regeneratie) en zou het evenwicht in de richting van de aminesynthese kunnen drijven. Met vier geselecteerde amines steeg de productie tot 99%. Deze onderzoeken naar de verwijdering van aceton verdienen nader onderzoek, rekening houdend met de grote schaal waarop keton-naar-chirale amine-omzettingen zullen moeten worden uitgevoerd indien toegepast voor de productie van farmaceutische
tussenproducten. De beschikbaarheid van zeer robuuste enzymvarianten met op maat gemaakte substraatomvang zal dergelijke onderzoeken naar acetonverwijdering vergemakkelijken en de proceskosten verlagen bij opschaling.
De andere overheersende amino donor bij de asymmetrische aminesynthese is alanine, dat wordt omgezet in het coproduct pyruvaat. Pyruvaat kan worden verwijderd door oxidatie tot lactaat, tot aceetaldehyde door decarboxylering of tot alanine door regeneratie met
alaninedehydrogenase. De laatste reactie gaat ten koste van NADH, dat op zijn beurt kan worden geregenereerd door glucosedehydrogenase of formiaatdehydrogenase. Het is aangetoond dat een dergelijke cascade de productie van alifatische aminen en aromatische aminen zoals (S)-2-butylamine, (S)-2-pentylamine, (S)-2-octylamine en (S)-1-fenylethylamine verbetert met behulp van de (S)-selectieve ω-TA genaamd ATA-1134. Met alanine als de amino donor vereist
productverwijdering cascades die twee of meer enzymen gebruiken, wat het proces van
aminesynthese bemoeilijkt. Algemene proceseconomie en duurzaamheidskwesties zullen bepalen welke aminedonor in de praktijk het meest aantrekkelijk is.
Naast transaminasen zijn ook aminedehydrogenasen onderzocht om chirale aminen te produceren uit prochirale ketonen. Aminedehydrogenasen zijn NADH-afhankelijke enzymen die de reductieve aminering van ketonen katalyseren, en glucose (of formiaat) dehydrogenase wordt gebruikt om NADH5 te regenereren. Aminedehydrogenasen worden in het algemeen verkregen door proteïne-engineering van aminozuurdehydrogenasen zoals leucinedehydrogenase van Bacillus stereothermophilus5, fenylalaninedehydrogenase van Bacillus badius6,
L-lysinedehydrogenase van Geobacillus stearothermophilus7 en 4-oxopentaanzuurdehydrogenase van Clostridium sticklandii8. Verschillende chirale aminen, waaronder alifatische aminen zoals
170
(R)-2-pentylamine, (R)-2-hexylamine en aromatische aminen zoals fenylethylamine, (R)-1-fenylbutylamine, (R)-(+)-1-aminotetraline en (S)-pentaan-2-amine zijn geproduceerd door gemanipuleerde aminedehydrogenasen. Verschillende (R)-amines kunnen ook worden
gesynthetiseerd door ω-TAs. Een prominent voorbeeld is het biokatalytische productieproces van sitagliptine dat is gebaseerd op een hoogontwikkelde variant van de (R)-selectieve ω-TA van Arthrobacter sp. (ATA-117)9. De keuze tussen biokatalytische routes op basis van amine dehydrogenase en transaminase zal een grondige vergelijking van bioprocestechnische aspecten vereisen, maar uiteraard zal ook de mogelijkheid om enzymen met de vereiste activiteit te
verwerven van cruciaal belang zijn. We verwachten dat het werk in dit proefschrift en studies door andere groepen zullen bijdragen aan de voorspelbaarheid van proteïne-engineering projecten gericht op het afstemmen van transaminasen voor specifieke conversies, wat belangrijk is bij het selecteren van een bepaalde benadering voor het ontwikkelen van een biokatalytisch proces.
De resultaten die in het proefschrift worden gepresenteerd, suggereren ook stappen om de gebruikte proteïne-engineering protocollen verder te verbeteren. In Hoofdstuk 3 bevat de
procedure voor het ontwerpen van mutantenbibliotheken door FRESCO verschillende in silico screeningstappen voorafgaand aan experimentele verificatie: vouw-energieberekeningen, high-throughput MD-simulaties om lokale flexibiliteit te voorspellen en visuele inspectie. Elke stap kan een groot aantal potentieel negatieve mutaties elimineren. Stabiliserende mutaties die in het protocol zijn gemist, kunnen mogelijk worden ontdekt door aanvullende principes van
eiwitstabilisatie op te nemen, zoals de introductie van disulfidebinding10, waaronder mogelijk inter-subunit disulfidebindingen. Bovendien kan stabilisatie van flexibele oppervlaktelussen of het vervangen van dergelijke lussen door stijve lussen de stabiliteit van een eiwit verhogen11. Terwijl computationeel ontworpen oppervlaktemutaties die in Hoofdstuk 3 worden gerapporteerd weinig effect hadden op de stabiliteit van wildtype PjTA, is het goed mogelijk dat ze de stabiliteit van varianten die al met andere methoden zijn verbeterd, verder zouden verbeteren, omdat de zwakste plekken in de structuur kan zijn verschoven. In het huidige werk hebben we geen biofysische methoden gebruikt om de regio's van PjTA vast te stellen waar de ontwikkeling kan beginnen. Het vinden van deze zogenaamde vroege ontvouwende regio's en focusserende mutaties daar kan de stabiliteit van de robuuste varianten verder verbeteren.
In Hoofdstuk 5 werd PjTA-R6 gebruikt als het model voor de engineering van transaminasen die volumineuze aminen kunnen produceren. Terwijl mooie ontwerpen werden verkregen, zouden verdere studies gericht op een grotere groep volumineuze amines moeten worden gedaan om de mogelijkheden van PjTA-herontwerp volledig te verkennen. Een
interessante verbinding zou (R)-1,2-difenylethylamine zijn, waarvan de aminogroep zich tussen twee fenylgroepen bevindt. De reactie is aangetoond met een gemanipuleerde CvTA12. Het zou belangrijk zijn om in silico strategieën te ontwikkelen voor het selecteren van het beste template-enzym voor een bepaalde doelreactie. Engineering PjTA voor de productie van zulke zeer
omvangrijke amines zou zeker een uitdagend eiwitechniekproject opleveren. Verder worden in dit proefschrift alleen ketonen getest als substraten voor amineringsreacties. Acceptatie van aldehyden
171
als substraten door ω-TAs maakt synthese van primaire amines mogelijk, en het zou belangrijk zijn om de robuuste variant PjTA-R6 te testen bij de acceptatie van een reeks aldehyden zoals
benzaldehyde en 4-fenylbutyraldehyde. Het wildtype PjTA gaf een goede activiteit bij de
deaminering van de overeenkomstige aminen (benzylamine en 4-fenylbutylamine) (Hoofdstuk 2). Hoewel de complexe kinetiek van transaminasen niet impliceert dat een goede activiteit met een verbinding als aminodonor een goede activiteit impliceert bij de productie van die verbinding uit keton, is er om mechanistische en thermodynamische redenen enige correlatie te verwachten.
Een interessant primair amine is cinnamylamine, de voorloper van het antischimmelmiddel naftifine. Die verbinding is geproduceerd uit cinnamylalcohol in een cascade waarbij vijf enzymen betrokken zijn, waaronder galactose-oxidase (oxidatie van cinnamylalcohol),
mierikswortelperoxidase (regeneratie van de koperion-cofactor van galactose-oxidase), transaminase (aminering van kaneelaldehyde), alaninedehydrogenase (regeneratie) van de aminodonor alanine), en glucose of formiaat dehydrogenase (regeneratie van de cofactor
NADH)13. Hoewel dit een haalbare strategie kan zijn voor het produceren van cinnamylamine, een eenvoudiger cascade die drie enzymen bevat, namelijk alcoholdehydrogenase (oxidatie van cinnamylalcohol en regeneratie van de cofactor NADH), PjTA-R6 of een vergelijkbare transaminase (aminering van cinnamaldehyde), en alanine dehydrogenase (regeneratie van de aminodonor alanine ten koste van NADH) kan worden overwogen. Bovendien kan de synthese van cinnamylamine uit cinnamylaldehyde met gebruik van isopropylamine als aminodonor ook haalbaar zijn.
Naast aminen zijn ook niet-proteïnogene aminozuren interessante doelwitten voor verder onderzoek, omdat het wild-type PjTA van nature aminohexaanzuur deamineert tot
6-oxohexaanzuur en ook behoorlijke activiteiten vertoont ten aanzien van 5-aminopentaanzuur en 4-aminobutaanzuur (Hoofdstuk 2). Verschillende niet-proteïnogene aminozuren zoals 3-amino-3-fenylpropionzuur en L-norvaline zijn onderzocht met andere ω-TAs14,15. Gerelateerde
hoogwaardige chemicaliën, waaronder aminoalcoholen zoals (R)-fenylglycinol en (R)-3-amino-1-butanol, zijn ook gesynthetiseerd door ontwikkelde ω-TAs16,17. De aminen die als farmaceutica worden gebruikt, zoals sitagliptine9 en imagabalin18, zijn geproduceerd door gemanipuleerde ω TAs. Er is geen melding gemaakt van de productie van enkele andere farmaceutische chemicaliën die een aminogroep zoals fluvoxamine19 bevatten door ω-TAs. Deze voorbeelden illustreren dat de diversiteit van producten die onderzoek verdienen met gemanipuleerde varianten van PjTA-R6 breder is dan de reeks verbindingen die in dit proefschrift worden besproken.
In onze studie waren bijna alle geproduceerde chirale aminen (S)-enantiomeren met >99% e.e. De (R)-aminen zoals (R)-1-fenylethylamine zijn echter niet door PjTA gesynthetiseerd. Een proteïne-engineeringstudie gericht op het omschakelen van de enantioselectiviteit van S naar R lijkt op het eerste gezicht een uitdaging, maar waarschijnlijk niet competitief met een benadering die een R-selectieve fold-type IV transaminase als sjabloon gebruikt. Het algemene idee zou zijn om meer ruimte te creëren voor de kleine bindzak van de actieve site om in de grote groep van het substraat te passen, en om tegelijkertijd de grote bindzak te verkleinen om in de kleine groep van
172
het substraat te passen. Deze strategie is toegepast om de enantioselectiviteit van CvTA om te schakelen bij de synthese van 2-aminotetraline20.
Computationele methoden vormen de kern van de proteïne-engineeringstudies die in dit proefschrift worden beschreven. Computationele docking simulaties werden gebruikt om activiteitsverschillen tussen enzymen en substraten te verklaren (Hoofdstukken 2 en 4).
Computationeel ontwerp werd gebruikt in Hoofdstuk 3 en 5 om varianten van PjTA te ontdekken met respectievelijk verbeterde stabiliteit en op maat gemaakte substraatomvang. In elk geval werden kleine bibliotheken gemaakt door computationele voorspelling van varianten die waarschijnlijk de gewenste eigenschappen vertonen, wat werd bevestigd door experimentele verificatie. Het slagingspercentage van computationeel ontwerp is echter vaak nog bescheiden, waardoor het te uitdagend is om de beste variant voor een bepaalde prestatie te ontwerpen in een eenstapsprotocol. De huidige protocollen kunnen worden geoptimaliseerd via een diepgaand begrip van een enzymkatalytisch mechanisme vóór computationeel ontwerp, en verschillende algoritmen kunnen parallel worden gebruikt om het succespercentage van computationele
voorspellingen te verhogen. In Hoofdstuk 3 was het slagingspercentage voor mutaties die bedoeld waren om de stabiliteit van PjTA te verbeteren slechts 13%. Het hoge slagingspercentage (56%) voor de voorspelde interfacemutaties suggereert dat selectie van zoekruimte op basis van inzicht in onderliggende mechanismen (in dit geval subunit dissociatie) enorm kan bijdragen aan de
voorspelbaarheid van computationeel ontwerp. Een andere manier om door berekeningen ondersteund ontwerp te verbeteren, is het gebruik van bio-informatica. Zoals beschreven in de Inleiding van dit proefschrift (Hoofdstuk 1), kunnen mutaties in de richting van consensus de stabiliteit verbeteren, en zijn er methoden gerapporteerd die computationeel ontwerp en de consensusbenadering combineren. Sequentie-uitlijningen in combinatie met functionele
voorspellingen door bio-informatica kunnen ook nuttig worden voor het selecteren van sjablonen en mutaties die bijdragen aan proteïne-engineering gericht op een gewenste activiteit of
173
Referenties
1. Satyawali, Y., del Pozo, D. F., Vandezande, P., Nopens, I. & Dejonghe, W. Investigating
pervaporation for in situ acetone removal as process intensification tool in ω-transaminase catalyzed chiral amine synthesis. Biotechnol. Prog. 35, e2731 (2019).
2. Rehn, G., Adlercreutz, P. & Grey, C. Supported liquid membrane as a novel tool for driving the equilibrium of ω-transaminase catalyzed asymmetric synthesis. J. Biotechnol. 179, 50–55 (2014). 3. Cassimjee, K. E., Branneby, C., Abedi, V., Wells, A. & Berglund, P. Transaminations with isopropyl
amine: equilibrium displacement with yeast alcohol dehydrogenase coupled to in situ cofactor regeneration. Chem. Commun. 46, 5569–5571 (2010).
4. Koszelewski, D. et al. Formal asymmetric biocatalytic reductive amination. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 9337–9340 (2008).
5. Abrahamson, M. J., Vázquez-Figueroa, E., Woodall, N. B., Moore, J. C. & Bommarius, A. S. Development of an amine dehydrogenase for synthesis of chiral amines. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3969–3972 (2012).
6. Abrahamson, M. J., Wong, J. W. & Bommarius, A. S. The evolution of an amine dehydrogenase biocatalyst for the asymmetric production of chiral amines. Adv. Synth. Catal. 355, 1780–1786 (2013).
7. Tseliou, V., Knaus, T., Masman, M. F., Corrado, M. L. & Mutti, F. G. Generation of amine dehydrogenases with increased catalytic performance and substrate scope from ε-deaminating L-Lysine dehydrogenase. Nat. Commun. 10, 3717 (2019).
8. Mayol, O. et al. A family of native amine dehydrogenases for the asymmetric reductive amination of ketones. Nat. Catal. 2, 324–333 (2019).
9. Savile, C. K. et al. Biocatalytic asymmetric synthesis of chiral amines from ketones applied to sitagliptin manufacture. Science. 329, 305–309 (2010).
10. Xie, D. F. et al. Improving thermostability of (R)-selective amine transaminase from Aspergillus terreus through introduction of disulfide bonds. Biotechnol. Appl. Biochem. 65, 255–262 (2018). 11. Nestl, B. M. & Hauer, B. Engineering of flexible loops in enzymes. ACS Catal. 4, 3201–3211
(2014).
12. Land, H., Ruggieri, F., Szekrenyi, A., Fessner, W. & Berglund, P. Engineering the active site of an (S)-selective amine transaminase for acceptance of doubly bulky primary amines. Adv. Synth. Catal. 362, 812–821 (2020).
13. Fuchs, M. et al. Amination of benzylic and cinnamic alcohols via a biocatalytic, aerobic, oxidation-transamination cascade. RSC Adv. 2, 6262–6265 (2012).
14. Hwang, B. Y. & Kim, B. G. High-throughput screening method for the identification of active and enantioselective ω-transaminases. Enzyme Microb. Technol. 34, 429–436 (2004).
15. Han, S. W., Park, E. S., Dong, J. Y. & Shin, J. S. Active-site engineering of ω-transaminase for production of unnatural amino acids carrying a side chain bulkier than an ethyl substituent. Appl. Environ. Microbiol. 81, 6994–7002 (2015).
16. Nobili, A. et al. Engineering the active site of the amine transaminase from Vibrio fluvialis for the asymmetric synthesis of aryl-alkyl amines and amino alcohols. ChemCatChem. 7, 757–760 (2015). 17. Gao, X. et al. Reshaping the substrate binding region of (R)-selective ω-transaminase for asymmetric
synthesis of (R)-3-amino-1-butanol. Appl. Microbiol. Biotechnol. 104, 3959–3969 (2020).
18. Midelfort, K. S. et al. Redesigning and characterizing the substrate specificity and activity of Vibrio fluvialis aminotransferase for the synthesis of imagabalin. Protein Eng. Des. Sel. 26, 25–33 (2013). 19. Figgitt, D. P. & McClellan, K. J. Fluvoxamine: An updated review of its use in the management of
adults with anxiety disorders. Drugs. 60, 925–954 (2000).
20. Humble, M. S., Cassimjee, K. E., Abedi, V., Federsel, H.-J. & Berglund, P. Key amino acid residues for reversed or improved enantiospecificity of an ω-transaminase. ChemCatChem. 4, 1167–1172 (2012).
