University of Groningen
Adding tools to the box: facilitating host strain engineering of Penicillium chrysogenum for the
production of heterologous secondary metabolites
Pohl, Carsten
DOI:10.33612/diss.119054818
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2020
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Pohl, C. (2020). Adding tools to the box: facilitating host strain engineering of Penicillium chrysogenum for the production of heterologous secondary metabolites. University of Groningen.
https://doi.org/10.33612/diss.119054818
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
6
CHAPTER
Summary
Carsten Pohl1,+, Roel A.L. Bovenberg2,3, Arnold J.M. Driessen1,
1Molecular Microbiology and 2Synthetic Biology and Cell Engineering,
Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen, Groningen, The Netherlands, and 3DSM Biotechnology
Centre, Delft, The Netherlands
+ present address: Department of Applied and Molecular Microbiology,
6
Summary
Since the discovery of penicillin by alexander Fleming, the fungus Penicillium chrysogenum (re-identified as P. rubens) is known for its capability to produce this important β-lactam antibiotic, sparking extensive research efforts to understand the metabolism and to increase the penicillin tites in this fungus. Ultimately, this research led to strains that were capable of producing about 10.000-fold more penicillin1 than the original strain. β-lactam antibiotics,
amongst other antibiotics, became used over excessively on a global scale in the last 75 years, leading to resistance against these antibiotics2 and blunting the sword against the fight of
human and animal pathogens.
While the responsible usage of antibiotics and the need to invest into research for discovery of novel anti-infective was increasingly stimulated with public information campaigns and research funding in the last decade3, the research into bioprospecting
of fungi for anti-infective drug candidates recently also experienced a significant gain of momentum. This was mainly due to advances in synthetic biology, a drop in DNA reading and writing costs, computational prediction of genetic elements and simplified genome editing4–6 as discussed in Chapter 1 of this thesis. For the screening and production of
promising compounds or probing of biosynthetic gene clusters (BGCs), a filamentous fungus with excellent fermentation characteristics and low amounts of secreted endogenous metabolites is beneficial.
With the development of a Cas9 ribonucleoprotein (RNP) based transformation method for P. chrysogenum, reported in Chapter 2 of this PhD thesis, we were able to show that Cas9 was able to stimulate the frequency of donor DNA integration and also allows considerably shortening of the donor DNA flank length required for recombination into the targeted host locus, speeding up the generation of clones. While the Cas9 RNP approach will certainly not be as powerful as the next-generation plasmid-encoded genome editing strategies in filamentous fungi, it circumvents the search for a working expression cassette and only delivers a pulse of Cas9 protein which is sufficient for immediate genome editing without the lag due to transcription and translation7.
We utilized this genome editing approach successfully to examine the Calbistrin BGC in Penicillium decumbens in Chapter 3, after identification of the squalene epoxidase
ergA and the bleomycin resistance protein ble as suitable selection markers for clone
screening. The Calbistrin BGC is constituted of 13 genes and transcriptionally controlled by the transcription factor calC. Interestingly, the membrane transporter calB seems to be selective for the export of Calbistrins, but not the Decumbenone precursors. Further, the biosynthesis of the dioic acid moiety in P. decumbens could not be attributed exclusively to the polyketide synthase calA, making this cluster an interesting candidate for heterologous expression in another filamentous fungi. Therefore, the Calbistrin cluster was introduced into a modified P. chrysogenum strain with reduced secondary metabolite payload that lacks the BGCs for production of Penicillin, Chrysogine, Roquefortin and Fungisporin. This so-called 4xKO strain generated with the methodology developed in
Summary
184
6
Chapter 2. This strain was extensively analyzed in Chapter 4 for changes of intracellular
amino acid levels in glucose limited chemostats and transcriptome data were compared against a panel of Penicillin-production strains. Besides an increased secretion of valine and a more pronounced autophagy response due to lower methionine levels, the 4xKO strain metabolism remains sufficiently flexible. Further, three repeated rounds of Cas9-mediated genome editing did not lead to any unwanted off-target effects as shown by genome resequencing. Interestingly, the heterologous expression of the Calbistrin BGC resulted in the formation of both hypothesized precursors, the linear dioic moiety and decumbenones, but no Calbistrins were observed.
While the heterologous expression of the Calbistrin BGC was relatively straightforward due to the possibility to overexpress the transcription factor calC, the fast screening of promoter and heterologous expression cassettes in P. chrysogenum under shake-flask growth conditions is greatly slowed down due to tedious cleanup of clones from the non-transformed background. Therefore, Chapter 5 explored the strategy to utilize the hisB gene as an auxotrophy marker for fast selection of gain-of-function mutants in liquid culture which showed promising results with in vivo assembly of the Penicillin BGC and subsequent clone-pool cultivation and measurement of Penicillin. Chapter 5 also identified a 1 kbp synthetic promoter with additional copies of the alcA transcription factor binding motif as inducible with methylethylketone, leading to a dynamic range of one order of magnitude in P. chrysogenum. This promoter was finally used to show that the ornithine-decarboxylase degradation tag was sufficient in P. chrysogenum to reduce the stability of DsRed, a method that can be used for induced and selective protein degradation which is of particular interest for studies on essential genes. The approaches tested in Chapter 5 can be promising starting points for further method development in filamentous fungi.
Taken together, this thesis presents the adaption of the RNA-guided endonuclease Cas9 for engineering the genome of the ascomycete fungus P. chrysogenum, whereby the insertion of a donor DNA is greatly facilitated. The approach of delivering the Cas9 protein and the sgRNA as a preassembled ribonucleoprotein particle was further demonstrated in P. decumbens and led to verification of the Calbistrin BGC. This BGC was then selected as a proof-of-principle example for in vivo homologous recombination of a heterologous BGC into a BGC-reduced P. chrysogenum strain. Lastly, the Cas9-boosted homologous recombination frequency was utilized to demonstrate a time-saving approach for building and testing novel expression cassettes transcription factors such as an aldehyde-inducible promoter and protein degradation tags in P. chrysogenum. The genetic tools developed in this thesis speed up the strain construction approaches in this industrially relevant fungus. In the coming decade, precise, simultaneous-multi-loci-editing techniques of filamentous fungi will become routinely applied in research labs and researchers will increasingly consider fungi as a host organism for their purposes if the available toolbox is kept updated and reliable to apply.
6
Nederlandse Samenvatting
Sinds de ontdekking van penicilline door Alexander Fleming staat de schimmel Penicillium
chrysogenum (opnieuw geïdentificeerd als P. rubens) bekend om zijn vermogen om dit
belangrijke β-lactam antibioticum te produceren. Uitgebreid onderzoek wordt gedaan om het metabolisme te begrijpen en de penicillinetiters in deze schimmel te verhogen. Uiteindelijk heeft dit onderzoek geleid tot stammen die in staat waren om ongeveer 10.000 keer meer penicilline1 te produceren dan de oorspronkelijke stam. β-lactam antibiotica,
samen met andere antibiotica, werden de laatste 75 jaar wereldwijd overmatig gebruikt, wat leidde tot resistentie tegen deze antibiotica2 en daar mee het afstompen van het zwaard
in de strijd tegen pathogenen van mens en dier.
Het verantwoordlijke gebruik van antibiotica en de noodzaak om te investeren in onderzoek voor de ontdekking van nieuwe anti-infectiemiddelen werd steeds meer gestimuleerd in de laatste tien jaar met publieke informatiecampagnes en onderzoeksfinanciering3. Maar
ook het onderzoek naar bioprospectie van schimmels voor anti-infectieuze kandidaat-geneesmiddelen heeft de laatste tijd een belangrijke impuls gekregen. Dit was vooral te danken aan de vooruitgang in de synthetische biologie, een daling van de kosten voor het lezen en schrijven van DNA, verbeterde computationele voorspellingen van genetische elementen en vereenvoudigde genoombewerking4–6 zoals besproken in hoofdstuk 1 van
dit proefschrift. Een filamenteuze schimmel met uitstekende fermentatiekarakteristieken en lage hoeveelheden afgescheiden endogene metabolieten (Zoals P. chrysogenum) is gunstig voor de screening en productie van veelbelovende verbindingen of het opsporen van biosynthetische genenclusters (BGC’s) uit andere schimmels, omdat sommige BGC’s nieuwe geneesmiddelen zouden kunnen produceren.
Met de ontwikkeling van een Cas9 ribonucleoproteïne (RNP) gebaseerde transformatiemethode voor P. chrysogenum, gerapporteerd in hoofdstuk 2 van dit proefschrift, konden we aantonen dat Cas9 in staat was om de frequentie van donor-DNA-integratie te stimuleren. Ook kon de lengte van de donor-DNA-flank aanzienlijk verkort worden waardoor de generatie van klonen wordt versneld. Hoewel de Cas9 RNP benadering in filamenteuze schimmels niet zo efficiënt mag zijn als de volgende generatie plasmide-gecodeerde genoombewerkingsstrategieën, omzeilt het de zoektocht naar een werkende expressiecassette. Deze methode levert ook slechts een puls van Cas9-eiwit die voldoende is voor onmiddellijke genoombewerking zonder de vertraging als gevolg van transcriptie en translatie7.
Na identificatie van het terbinafine resistentie gen (“ergA”, squaleen epoxidase) en het bleomycine resistentie gen (“ble”, bleomycine resistentie eiwit) als geschikte selectie markers voor kloon screening, gebruikten we de Cas9 genoombewerkings-benadering om het Calbistrin BGC in Penicillium decumbens te onderzoeken in hoofdstuk 3. Het Calbistrin BGC bestaat uit 13 genen en wordt transcriptioneel gereguleerd door de transcriptiefactor calC. Interessant is dat de membraantransporter calB selectief lijkt te zijn voor de export van Calbistrins, maar niet voor de Decumbenonprecursoren. Verder kon de biosynthese
Summary
186
6
van het dioïnezuur deel in P. decumbens niet uitsluitend worden toegeschreven aan de polyketidesynthase calA, waardoor dit cluster een interessante kandidaat is voor heterologe expressie in andere filamenteuze schimmels. Om een andere polyketidesynthase als calA voor de biosynthese van het dioïnezuur uit te sluiten werd het Calbistrin cluster geïntroduceerd in een aangepaste P. chrysogenum stam met een verminderde secundaire metaboliet afscheiding doordat die stam de BGCs voor de productie van Penicilline, Chrysogine, Roquefortine en Fungisporine mist. Deze zogenaamde 4xKO-stam wordt gegenereerd met de in hoofdstuk 2 ontwikkelde methodologie. In hoofdstuk 4 werd deze stam uitgebreid geanalyseerd voor veranderingen van intracellulaire aminozuurniveaus in chemostaten met glucose. Ook werden transcriptoomgegevens verzameld en vergeleken met een panel van Penicilline-producerende stammen. Naast een verhoogde afscheiding van valine en een meer uitgesproken autofagie respons door lagere methionine niveaus, blijft het metabolisme van de 4xKO stam voldoende flexibel en laat een weinig verhoogte synthese van niet-benodigde aminozuren erkennen. Verder hebben drie herhaalde rondes van Cas9-gemedieerde genoombewerking niet geleid tot ongewenste off-target effecten, zoals blijkt uit genoom sequencing van de resulterende stammen. Interessant is dat de heterologe expressie van het Calbistrin BGC resulteerde in de vorming van beide veronderstelde precursoren, het lineaire dioische deel en decumbenonen, maar er werden geen Calbistrins waargenomen.
Hoewel de heterologe expressie van het Calbistrin BGC relatief eenvoudig te realiseren was door overexpressie van de calC transcriptiefactor, wordt de snelle screening van promotor en heterologe expressiecassettes in P. chrysogenum onder shake-fles groeicondities sterk vertraagd door de noodzakelijk voorafgaande expressiestam zuivering van de klonen uit de niet-getransformeerde achtergrond. Daarom is in hoofdstuk 5 de strategie om het hisB gen te gebruiken als een auxotrofiemarker onderzocht voor een snelle selectie van functionele “gain-of-function” mutanten in de vloeistofkweek. Deze aanpak liet veelbelovende resultaten zien met in vivo assemblage van het Penicilline BGC en de daaropvolgende kloonpoolkweek en meting van Penicilline. In hoofdstuk 5 identificeerden we ook een 1 kbp aldehyde-induceerbare synthetische promotor met extra kopieën van het alcA transcriptiefactor bindmotief. Inductie met methylethylketon gaf een dynamisch bereik van één orde van grootte in P. chrysogenum. Deze promotor werd uiteindelijk gebruikt om aan te tonen dat de ornithine-decarboxylase afbraak-tag in P. chrysogenum voldoende was om de stabiliteit van DsRed te verminderen. Deze methode kan gebruikt kan worden voor geïnduceerde en selectieve eiwitafbraak, wat van bijzonder belang is voor studies op essentiële genen. De in hoofdstuk 5 geteste benaderingen kunnen veelbelovende uitgangspunten zijn voor de verdere ontwikkeling van de methode bij filamenteuze schimmels.
Samengevat presenteert dit proefschrift de aanpassing van de RNA-gestuurde endonuclease Cas9 voor de engineering van het genoom van de ascomyceteschimmel P.
chrysogenum, waarbij het inbrengen van een donor-DNA sterk wordt vergemakkelijkt.
De aanpak van het afleveren van het Cas9 eiwit en het sgRNA als een voorgeassembleerd ribonucleoproteïne werd verder gedemonstreerd in P. decumbens en leidde tot verificatie
6
van het Calbistrin BGC. Dit BGC werd vervolgens geselecteerd als een “proof-of-principle” voorbeeld voor de in vivo homologe recombinatie van een heterologe BGC in een BGC-verminderde P. chrysogenum stam. Ten slotte werd de homologe recombinatiefrequentie van de Cas9-boost gebruikt om een tijdbesparende aanpak aan te tonen voor het bouwen en testen van nieuwe transcriptiefactoren voor expressiecassettes zoals een aldehyde-induceerbare promotor en proteïnedegradatietags in P. chrysogenum. De genetische gereedschappen die in dit proefschrift werden ontwikkeld, versnellen de methodes om nieuwe stammen te construeren in deze industrieel relevante schimmel. In het komende decennium zal nauwkeurige, gelijktijdige-multi-loci-engineering van filamenteuzeschimmels een routinetechniek in onderzoekslaboratoria worden en de onderzoekers zullen steeds vaker schimmels als gastheerorganisme voor hun doeleinden overwegen; als de beschikbare gereedschapskist wordt bijgehouden en betrouwbaar blijft om toe te passen.
Summary
188
6
Zusammenfassung
Seit der Entdeckung von Penicillin durch Alexander Fleming ist der Pilz Penicillium
chrysogenum (re-identifiziert als P. rubens) bekannt für seine Fähigkeit, dieses wichtige
β-Lactam-Antibiotikum herzustellen, das umfangreiche Forschungsanstrengungen zum Verständnis des Stoffwechsels und zur Erhöhung der Penicillintiters in diesem Pilz ausgelöst hat. Letztendlich führte diese Forschung zu Stämmen, die in der Lage waren, etwa das 10-tausendfache an Penicillin1 gegenüber dem ursprünglichen Stamm zu produzieren.
β-Lactam-Antibiotika wurden in den letzten 75 Jahren weltweit übermäßig eingesetzt, was zu Resistenzen gegen diese Antibiotika2 führte und dieses wichtige Schwert im Kampf
gegen Menschen- und Tierpathogenen zunehmend stumpfer machte.
Während der verantwortungsbewusste Einsatz von Antibiotika und die Notwendigkeit in die Forschung zur Entdeckung neuartiger Antiinfektiva zu investieren in den letzten 10 Jahren durch öffentliche Aufklärungskampagnen und Forschungsmittel zunehmend angeregt wurde3, verzeichneten auch die Forschungsbemühungen zur Bioprospektion von
Pilzen für antiinfektiöse Arzneimittelkandidaten in jüngster Zeit einen deutlichen Anstieg. Dies ist hauptsächlich auf Fortschritte in der synthetischen Biologie, einen Rückgang der Lese- und Schreibkosten für DNA, die bioinformatische Vorhersage genetischer Elemente und die vereinfachte Veränderung von Genomen, das sogenannte “Genome Editing”4–6
zurückzuführen, was in Kapitel 1 dieser Arbeit diskutiert wird. Für das Screening und die Herstellung vielversprechender Verbindungen oder die Sondierung von biosynthetischen Genclustern (BGCs) ist ein filamentöser Pilz mit hervorragenden Fermentationseigenschaften und geringen Mengen an sekretierten endogenen Metaboliten von Vorteil.
Mit der Entwicklung einer auf Cas9-Ribonukleoprotein (RNP) basierenden Transformationsmethode für P. chrysogenum, welche in Kapitel 2 dieser Dissertation beschrieben wird, konnten wir zeigen, dass Cas9 in der Lage ist, die Häufigkeit der Integration von sogenannter fremd-DNA (Donor-DNA) zu stimulieren und auch eine erhebliche Verkürzung der für die Rekombination in den angestrebten Wirtslocus erforderlichen Donor-DNA-Flankenlänge ermöglicht, was die Erzeugung von Klonen beschleunigt. Während der Cas9 RNP-Ansatz sicherlich nicht so leistungsfähig sein wird wie die plasmidcodierten Genombearbeitungsstrategien der nächsten Generation, umgeht er die Suche nach einer funktionierenden Expressionskassette bei neuartigen filamentösen Pilzen und liefert nur einen Impuls von Cas9-Protein, der für das sofortige, präzise Schneiden im Pilzgenom ohne Verzögerung durch Transkription und Translation des Cas9-Proteins ausreichend ist7.
Wir haben diesen Genombearbeitungsansatz erfolgreich eingesetzt, um das Calbistrin BGC in Penicillium decumbens in Kapitel 3 zu untersuchen, nachdem wir die Squalenepoxidase
ergA und das Bleomycin-Resistenzprotein ble als geeignete Selektionsmarker für das
Klonscreening identifiziert hatten. Der Calbistrin BGC besteht aus 13 Genen und wird transkriptionell durch den Transkriptionsfaktor calC gesteuert. Interessanterweise scheint der Membrantransporter calB für den Export von Calbistrinen selektiv zu sein, aber nicht die Decumbenone-Vorläufer. Darüber hinaus konnte die Biosynthese des Dicarbonsäurerestes in
6
P. decumbens nicht ausschließlich auf die Polyketidsynthase calA zurückgeführt werden, was
diesen Cluster zu einem interessanten Kandidaten für die heterologe Expression in anderen filamentösen Pilzen macht. Daher wurde der Calbistrin-Cluster in einen modifizierten P.
chrysogenum-Stamm mit reduzierter Sekundärmetabolitproduktion integriert, dem die
BGCs für die Produktion von Penicillin, Chrysogin, Roquefortin und Fungisporin fehlen. Dieser so genannte 4xKO-Stamm wurde mit den Methoden erzielt, die in Kapitel 2 entwickelt wurden. Dieser Stamm wurde in Kapitel 4 ausführlich auf Veränderungen des intrazellulären Aminosäurespiegels in Glucose-limitierten Chemostaten analysiert und Transkriptomdaten wurden mit einem Panel von Penicillin-Produktionsstämmen verglichen. Neben einer erhöhten Sekretion der Aminosäure Valin und einer stärkeren Aktivierung der Autophagie durch niedrigere intrazelluläre Methioninkonzentrationen bleibt der 4xKO-Stammstoffwechsel ausreichend flexibel. Darüber hinaus führten drei wiederholte Runden des Cas9-Genome-Editings nicht zu unerwünschten Nebenwirkungen, wie die Genomresequenzierung zeigte. Interessanterweise führte die heterologe Expression des Calbistrin BGC zur Bildung beider hypothetischer Vorläufer, der linearen Dicarbonsäure und des Decumbenones, aber es wurden keine Calbistrine detektiert.
Während die heterologe Expression des Calbistrin BGC aufgrund der Möglichkeit den Transkriptionsfaktor calC zu überexprimieren relativ einfach war, wird das schnelle Screening von Promotor- und heterologen Expressionskassetten in P. chrysogenum unter Wachstumsbedingungen in Schüttelkolben durch die langwierige Aufreinigung von Klonen aus dem nicht-transformierten Hintergrund stark verlangsamt. Daher untersuchte Kapitel
5 die Strategie zur Nutzung des hisB-Gens als Auxotrophie-Marker für die schnelle Auswahl
von Mutanten mit Funktionsgewinn in Flüssigkultur, die vielversprechende Ergebnisse mit der in vivo-Rekombination des Penicillin BGC und der anschließenden Klonpool-Kultivierung und Messung von Penicillin zeigten. Kapitel 5 identifizierte auch einen synthetischen Promotor, der über zusätzliche Kopien des alcA-Transkriptionsfaktor-Bindungsmotivs verfügt und mit Methylethylketon induzierbar ist. Die Induzierbarkeit dieses Promoters in
P. chrysogenum umfasst einen Dynamikumfang von einer Größenordnung. Dieser Promotor
wurde schließlich verwendet um zu zeigen, dass der Ornithin-Decarboxylase-Protein-Tag in
P. chrysogenum ausreicht um die Stabilität des Fluoreszenzproteins DsRed zu reduzieren, was
eine eine Methode darstellt, die für den selektiven Proteinabbau verwendet werden kann, was von besonderem Interesse für Studien an essentiellen Genen ist. Die in Kapitel 5 getesteten Ansätze können vielversprechende Ansatzpunkte für die weitere Methodenentwicklung bei filamentösen Pilzen sein.
Zusammenfassend stellt diese Arbeit die Adaption der RNA-geführten Endonuklease Cas9 für die Genomgestaltung der Ascomyceten P. chrysogenum dar, wodurch die Insertion einer donor-DNA stark erleichtert wird. Der Ansatz, das Cas9-Protein und die sgRNA als vormontiertes Ribonukleoprotein-Partikel zu liefern, wurde in P. decumbens demonstriert und führte zur Verifikation des Calbistrin BGC. Dieses BGC wurde dann als Anwendungsbeispiel für die in vivo Rekombination eines heterologen BGC in einem BGC-reduzierten P.
Summary
190
6
chrysogenum Stamm ausgewählt. Schließlich wurde die durch Verwendung von Cas9
verbesserte homologe Rekombinationsfrequenz verwendet, um einen zeitsparenden Ansatz für den Aufbau und die Prüfung neuartiger Transkriptionsfaktoren von Expressionskassetten wie einen aldehyd-induzierbaren Promotor oder Proteinabbau-Tags in P. chrysogenum zu demonstrieren. Die in dieser Dissertation entwickelten Werkzeuge beschleunigen Ansätze zur Konstruktion von neuen Stämmen in diesem industriell relevanten Pilz. Im kommenden Jahrzehnt wird das präzise, parallele Multi-Loci-Genome-Editing von filamentösen Pilzen zur Routinetechnik in Forschungslabors werden und Wissenschaftler werden Pilze zunehmend als Wirtsorganismus für ihre Zwecke betrachten, wenn die verfügbare Toolbox aktualisiert und zuverlässig angewendet werden kann.
6
References
1. van den Berg, M. A. Impact of the Penicillium Chrysogenum Genome on Industrial Production of Metabolites. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 2011, 92 (1), 45–53. https://doi.
org/10.1007/s00253-011-3476-z.
2. Lobanovska, M.; Pilla, G. Penicillin’s
Discovery and Antibiotic Resistance: Lessons for the Future? Yale J. Biol.
Med. 2017, 90 (1), 135–145.
3. Hernando-Amado, S.; Coque, T. M.; Baquero, F.; Martínez, J. L. Defining and Combating Antibiotic Resistance from One Health and Global Health Perspectives. Nat. Microbiol.
2019, 4 (9), 1432–1442. https://doi.
org/10.1038/s41564-019-0503-9.
4. Smanski, M. J.; Bhatia, S.; Zhao, D.; Park, Y.; B A Woodruff, L.; Giannoukos, G.; Ciulla, D.; Busby, M.; Calderon, J.; Nicol, R.; et al. Functional Optimization of Gene Clusters by Combinatorial Design and Assembly.
Nat. Biotechnol. 2014, 32 (12), 1241–1249.
https://doi.org/10.1038/nbt.3063.
5. Schuster, M.; Kahmann, R. CRISPR-Cas9
Genome Editing Approaches in Filamentous Fungi and Oomycetes. Fungal Genet.
Biol. 2019, 130 (April), 43–53. https://doi.
org/10.1016/j.fgb.2019.04.016.
6. Kjærbølling, I.; Mortensen, U. H.; Vesth, T.; Andersen, M. R. Strategies to Establish the Link between Biosynthetic Gene Clusters and Secondary Metabolites. Fungal
Genet. Biol. 2019, 130 (May), 107–121.
https://doi.org/10.1016/j.fgb.2019.06.001. 7. Zuris, J. a; Thompson, D. B.; Shu, Y.; Guilinger,
J. P.; Bessen, J. L.; Hu, J. H.; Maeder, M. L.; Joung, J. K.; Chen, Z.-Y.; Liu, D. R. Cationic Lipid-Mediated Delivery of Proteins Enables Efficient Protein-Based Genome Editing in Vitro and in Vivo. Nat. Biotechnol. 2014, 33 (1). https://doi.org/10.1038/nbt.3081.
