The effect of bacterial isochorismate synthase on the Brassica rapa metabolome
Simoh, S.
Citation
Simoh, S. (2008, June 11). The effect of bacterial isochorismate synthase on the Brassica rapa metabolome. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/12944
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/12944
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
SAMENVATTING
Hogere planten synthetiseren, naast basis voedingstoffen zoals nutriënten, eiwitten, vetten en koolhydraten ook een groot aantal verbindingen met een laag molecuul gewicht, zo genaamde secundaire metabolieten. Deze metabolieten zijn essentiële elementen voor planten om te overleven in hun omgeving. In de afgelopen jaren is er veel onderzoek besteed aan het ontrafelen welke potentie deze secondaire metabolieten hebben voor planten. Een van de mogelijkheden is het modificeren van de plantenbiosyntheseroutes door middel van genetische modificatie. De genen afkomstig van andere bronnen zoals planten van een andere soort, bacteriën of een combinatie van beide kunnen in de plant worden geïntroduceerd en tot overexpressie gebracht om zo de productie van gewenste verbindingen te induceren of verhogen. Aan de andere kant kan de accumulatie van ongewenste metabolieten worden voorkomen door blokkering van bepaalde routes.
In dit proefschrift worden de effecten van introductie van het bacteriële isochorismaat synthase (ICS) gen in Brassica rapa op de secundaire metaboliet productie onderzocht.
Eerdere pogingen door onze groep waren succesvol in het introduceren van de bacteriële salicylzuur (SA) route in tabaksplanten (Verberne et al., 2000). SA is een van de signaalmoleculen verantwoordelijk voor de inductie van systemic acquired resistance (SAR) in planten. Het entC-gen van Escherichia coli coderend voor ICS en het pmsB-gen van Pseudomonas fluorescence coderend voor isochorismate pyruvate lyase (IPL) zijn tot overexpressie gebracht in transgene tabak resulterend in constitutieve accumulatie van SA en verhoogde resistentie tegen virus- en oomyceet infecties. Tabaksplanten getransformeerd met een enkel ICS gen produceren ook SA, echter was de accumulatie lager dan in planten getransformeerd met zowel ICS als IPL. Brassica rapa is één van de economisch meest belangrijke gewassen in de wereld als zeer voedzame groente, als veevoer en voor de productie van zaadolie. Voor verdere verbetering van plantprestaties, zoals verhoging van pathogeenresistentie, is veredeling of genetische modificatie vereist.
Dus is het van groot belang om de resistentie te verbeteren door de introductie van de bacteriële SA route in deze niet modelplant. Een enkel ICS gen is in deze studie gebruikt, omdat overexpressie van IPL mogelijk resulteert in het wegleiden van isochorismaat van essentiële metabolische routes, zoals de productie van phylloquinone.
Het succes van genetische modificatie bij planten is sterk gerelateerd aan de efficiëntie van transformatie en het genintroductiesysteem waarmee het gewenste gen wordt geïntroduceerd en vervolgens tot expressie gebracht in het planten-genoom.
Genintroductie op basis van Agrobacterium tumefaciens transformatie is momenteel het meest gebruikte systeem. Hoofdstuk 2 behandelt het mechanisme van bacterie- infectie in de gastheerplanten, alsmede de factoren in planten betrokken bij deze interactie. Er zijn minstens 5 belangrijke stappen op moleculair niveau beginnend met de aanhechting van Agrobacterium aan de gastheerplant tot de integratie van het T-DNA in het plantengenoom. Dit omvat de activering van virulentie (VIR) genen, vorming van het T- DNA complex en het transport van het T-DNA in de plantencel. De efficiëntie van plantentransformatie is afhankelijk van vele factoren, enkele worden er belicht aan het einde van het hoofdstuk.
Het opstellen van een transformatiesysteem is een vereiste voor het verkrijgen van transgene planten. Zodoende beschrijven we in Hoofdstuk 3 de methode ontwikkeling voor transformatie van B. rapa, waaronder het celkweeksysteem, regeneratie en de groei van getransformeerde ICS planten. Hieraan voorafgaande zijn diverse belangrijke parameters onderzocht voor de optimalisatie van de transformatie efficiëntie, d.w.z.
verschillende Agrobacterium stammen, cocultivatie periode, pH, de fotoperiode, concentratie van de phenolische stof acetosyringone, verdunningsfactor van Agrobacterium en preconditioneren. De aanwezigheid van het transgen in het genoom van de in groeikamers gekweekte planten van de soort oleifera werd bevestigd door PCR.
De expressie van het entC gen coderend voor ICS in mRNA werd bevestigd met RT- PCR. Tevens observeerden we dat alle primair getransformeerde planten een normaal fenotype vertoonden, enkele bereikten het bloeistadium maar produceerden minder zaden. De meeste siliques waren niet in staat zich volledig te ontwikkelen.
Deze studie werd voortgezet met de analyse van SA en zijn glucoside (SAG) in de primaire transgene planten (Hoofdstuk 4). De SA en SAG gehaltes in transgene planten bepaald op twee verschillende tijdstippen (9 maanden en 18 maanden oud) waren significant verhoogd in vergelijking met controle planten. Echter de gehaltes SA en SAG in getransformeerde planten varieerden tussen individuele planten. Deze resultaten suggereren dat het entC gen tot expressie werd gebracht en functioneel de SA
biosynthese induceert in B. rapa. De introductie van het entC gen coderend voor ICS in B. rapa heeft mogelijk een effect op de accumulatie van bepaalde metabolieten afkomstig van chorismaat. Bijvoorbeeld, phylloquinone (vitamine K1) is afkomstig van chorismaat via ICS, de aromatische aminozuren fenylalanine en tyrosine, die onder andere resulteren in synthese van fenylpropanoiden, flavonoiden, SA en glucosinolaten zijn afkomstig van chorismaat via chorismaat mutase. Tryptofaan is ook afgeleid van isochorismaat via het enzyme anthranilaat synthase. In deze studie zijn de phylloquinone en glucosinolaat niveaus bestudeerd in transgene planten (Hoofdstuk 5). Resultaten toonden aan dat er geen significant verschil is in phylloquinone niveaus tussen transgene en controle planten, maar de glucosinolaat profielen verschillen, en met name de indol en aliphatische glucosinolaten. Deze resultaten geven aan dat de introductie van het entC gen coderend voor ICS in B. rapa, dat invloed heeft op de isochorismaat productie, geen invloed heeft op phylloquinone accumulatie. Het veranderde glucosinolaat profiel is mogelijk veroorzaakt door het verhoogde SA niveau, geproduceerd via isochorismaat, dat resulteert in de activatering van de afweer in planten.
Manipulatie van een biosyntheseroute verhoogt niet alleen de stroming richting gewenste metabolieten maar resulteert vaak ook in een veranderd profiel van primaire en secundaire metabolieten in de plant. De introductie van ICS verandert mogelijk direct of indirect de metabolieten aanwezig in B. rapa. Om die reden is het essentieel om een onbevooroordeelde analyse uit te voeren via metaboloom analyses van de transgene planten (Hoofdstuk 6). Analyse met 1H-NMR gecombineerd met multivariate data analyse suggereert dat glucosinolaten (neoglucobrassicin) en fenylpropanoiden (sinapoyl malaat, feruloyl malaat, caffeoyl malaat) en primaire metabolieten, d.w.z. sommige organische zuren en suikers zijn verhoogd in transgene ICS planten. Echter, primaire metabolieten zoals alanine, valine en threonine waren hoger in controle planten.
In de afgelopen jaren zijn de vele pogingen om transgene B. rapa planten te verkrijgen niet succesvol geweest door de lage efficiëntie van transformatie en aansluitende regeneratie van de getransformeerde plantencel. Eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat een veranderde gen expressie gerelateerd aan de afweer van planten het resultaat is van A. tumefaciens infectie (Ditt et al., 2001; Ditt et al., 2005). De invloed van een bacteriële infectie op transcriptie niveau is uitgebreid bestudeerd, echter
niet op metaboloom niveau. In Hoofdstuk 7 bespreken we de metaboloom analyses van B. rapa na infectie met een ontmantelde en tumor inducerende (nopaline en octopine) A.
tumefaciens stam. De resultaten laten zien dat bepaalde flavonoiden en fenylpropanoiden verlaagd zijn in B. rapa bladeren na een infectie met een ontmantelde (LBA4404) stam.
Een soortgelijk fenomeen werd ook waargenomen voor de bladeren en stengels van planten met tumoren geïnfecteerd met octopine en nopaline stammen.
De manipulatie van het secundaire metabolisme bij planten om bepaalde doelen te bewerkstelligen door middel van genetische modificatie krijgt veel aandacht. Deze benadering kan niet alleen worden toegepast voor introductie van waardevolle eigenshappen aan bestaande landbouw gewassen maar ook om de potentiële bronnen van biodiversiteit te benutten in ontwikkelingslanden. We beschrijven de toekomstige perspectieven van dit gebied in Hoofdstuk 8.
Concluderend, het is aangetoond in dit proefschrift dat het mogelijk is om het entC gen coderend voor ICS in B. rapa te introduceren door middel van genetische modificatie en aansluitend transgene planten te verkrijgen. Echter, zoals hierboven besproken, het ontwikkelen van een transformatie en regeneratie platform voor B. rapa planten met een hoge efficiëntie moet als eerste worden aangepakt. Dit is van het hoogste belang en een uitdagende taak.
