Development of an anitsense-mediated exon skipping therapy for
Duchenne Muscular Dystrophy.
Aartsma-Rus, A.M.
Citation
Aartsma-Rus, A. M. (2005, February 10). Development of an anitsense-mediated exon
skipping therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. Retrieved from
https://hdl.handle.net/1887/604
Version:
Corrected Publisher’s Version
166
Summary
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe, lethal neuromuscular disorder caused by reading frame disrupting mutations (mostly deletions) in the dystrophin gene. This results in the complete absence of dystrophin and leads to the continuous loss of muscle fibers and fibrosis. As a consequence, DMD patients are wheelchair dependent before the age of 12 and often die in the third decade of the life (or earlier) due to respiratory- or heart failure. Deletions in the dystrophin gene that keep the reading frame intact allow the generation of internally deleted, partly functional dystrophins and are associated with the milder Becker muscular dystrophy (BMD). Becker patients often remain ambulant until later in life and have near normal life expectancies.
Normal dystrophin consists of an N-terminal actin-binding domain, a central rod domain (containing 24 spectrin-like repeat units and 4 hinge regions) a cysteine-rich and a C-terminal domain. Dystrophin is thought to fulfill a bridge function between the cytoskeleton and the extracellular matrix, since the actin binding domain binds to cytoskeletal actin, while the C-terminal domain is involved with the transmembranal dystrophin glycoprotein complex (DG C) that is connected to the extracellular matrix via laminin 2. In DMD patients this bridge function is completely lost, since the C-terminal bridgehead is lacking due to a truncating mutation. In BMD patients on the other hand, an internal deletion results in a shorter, but still semi-functional bridge that contains both the N-terminal and C-terminal bridgeheads.
As yet there is no clinically applicable therapy for DMD patients, despite extensive research for a variety of different approaches. Currently, one of the most promising strategies is the antisense-mediated reading frame restoration. The aim of this approach is to induce specific exon skipping to convert an out of frame DMD transcript into its nearest in frame BMD-like counterpart. This would allow the generation of an internally deleted but partly functional dystrophin and should convert DMD into a milder BMD phenotype. The skipping of a specific exon can be induced by antisense oligoribonucleotides (AO Ns), which are small synthetic RNAs. U pon binding of the AO Ns to the pre-mRNA the splicing machinery does not recogniz e the exon as such anymore, and as a result the targeted exon is spliced out with its flanking introns (i.e. the exon is "skipped").
The broad mutation spectrum found for DMD would require the skipping of a series of exons to restore the reading frame for several patients. F ortunately, designing efficient DMD specific AO Ns has proven relatively easy, and we can currently induce the specific skipping of 20 different exons in human control myotube cultures after PEI-mediated AO N delivery (Chapter 2). This would restore the reading frame for over 40% of all DMD patients. The broad therapeutic applicability of this technique was confirmed in myotube cultures derived from 8 different patients (Chapter 3 ). F or each patient skipping of the specific exons could be induced on RNA level and dystrophin synthesis was restored in over 7 5% of treated myotubes. Time course experiments revealed that dystrophin was detectable as early as 16 hours post transfection and increasing levels were found for up to 7 days. In addition, expression of DG C proteins was restored in treated myotube cultures, further confirming the functionality of the BMD-like dystrophins.
Since a significant part of DMD patients carries a mutation that requires the skipping of two exons, we also tested the feasibility of double-exon skipping in two patients (Chapter 4). After treatment with a mix of the respective AO Ns, double exon skipping was detected on RNA level and dystrophin synthesis was restored for over 7 0% of treated myotube cultures for both patients. F urthermore, when we treated control myotubes with AO Ns targeting exons 45 and 51 we observed multi-exon skipping of exon 45 through 51. Multi-exon skipping not only increases the applicability of this technique, it also reduces the mutation specificity, since it allows for the generation of a BMD-like deletion that covers the majority of DMD mutations. The skipping of exon 45 through 51 would already be applicable to 15% of all patients and its feasibility was confirmed in myotubes derived from a patient carrying an exon 48-50 deletion. Subsequent experiments aiming at the skipping of a larger number of exons seem to indicate that the number of exons that can be skipped is limited due to hitherto unknown processes.
nucleic acid (LNA) and a peptide nucleic acid (PNA) AON (Chapter 5). Only the LNA induced higher levels of exon skipping than 2OMePS in patient and control myotube cultures. H owever, when we compared the sequence specificity of these analogues we observed that LNAs appear to be much less sequence specific than 2OMePS AON. Therefore, we conclude that 2OMePS currently seem the favorable compounds to establish clinical trials.
To study exon skipping in vivo we injected PEI-coupled 2OMePS AONs specific for murine exon 46 into the gastrocnemius muscle of normal mice (Chapter 6). Relatively low levels of exon 46 skipping could be detected on RNA level and persisted for over four weeks post injection. Furthermore, we have previously engineered a mouse model that contains the entire human DMD gene (2.6 Mb) integrated into the murine genome (hDMD mouse). These transgenic mice uniquely allow for the preclinical testing of human-specific AONs in vivo. We have injected AONs targeting human exons 44, 46 and 49 into the musculus. gastrocnemicus of hDMD mice, and showed that the skipping of the human exons (but not the murine exons) was indeed specifically induced.
168
Samenvatting voor niet-ingewijden
Spierdystrofie van Duchenne is een zeer ernstige X - gebonden spierziekte met een incidentie van 1 op de 3500 jongens. Het verloop van de ziekte wordt gekenmerkt door progressieve spierzwakte. Patiënten krijgen hun eerste symptomen tussen het derde en vijfde levensjaar, zijn voor hun twaalfde afhankelijk van een rolstoel en sterven meestal voor hun dertigste als gevolg van ademhalings- of hartfalen. Becker spierdystrofie is een mildere spierziekte; patiënten worden meestal pas op veel latere leeftijd afhankelijk van een rolstoel en de levensverwachting is bijna normaal. Beide ziektes worden veroorzaakt door mutaties in het dystrofine gen, dat codeert voor het dystrofine eiwit. Dit eiwit vervult een brugfunctie tussen het cytoskelet en de extracellulaire matrix en deze functie is noodzakelijk voor de stabiliteit van de spiervezels. Becker patiënten hebben mutaties die het leesraam van de genetische code intact laten, waardoor er een dystrofine gegenereerd kan worden dat in het midden een stukje mist, maar wel nog beide brughoofden bezit, zodat de brugfunctie niet verloren gaat (de brug is alleen iets korter). Duchenne patiënten hebben echter mutaties die het leesraam verstoren. Dit resulteert in een eiwit dat alleen het eerste brughoofd bevat en dus niet kan fungeren als brug, met als gevolg dat de spiervezels zeer gevoelig zijn voor schade en uiteindelijk afsterven.
Op dit moment is er geen toepasbare therapie beschikbaar voor Duchenne patiënten, ondanks dat verschillende mogelijkheden uitvoerig zijn en worden onderzocht. Een van de meest veelbelovende strategiën is het herstellen van het leesraam door middel van antisense oligoribonucleotides (AONs). Deze aanpak heeft als doel om op pre-mRNA niveau een leesraam verstorende mutatie te herstellen door het "skippen" van een exon. Hierdoor zou een Becker-achtig, deels functioneel dystrofine eiwit gemaakt kunnen worden en het ernstige Duchenne fenotype zou worden omgezet in een milder Becker fenotype. Het skippen van een exon wordt bewerkstelligd door AONs. Dit zijn kleine stukjes RNA die kunnen binden aan een bepaald exon, waardoor dit exon niet meer als zodanig wordt herkend door de splicing machinery en het wordt overgeslagen ("geskipt").
Het eerste bewijs dat exon skippen daadwerkelijk therapeutisch zou kunnen zijn in humane cellen werd geleverd door onze groep. Gekweekte spiercellen van 2 Duchenne patienten met een deletie van exon 45 werden behandeld met exon 46 specifieke AONs. RT-PCR analyse wees uit dat exon 46 inderdaad werd geskipt op RNA niveau. Hierdoor werd het leesraam hersteld en dit resulteerde in het herstel van de dystrofine synthese in meer dan 75% van de behandelde spiercellen.
Er komen veel verschillende soorten mutaties voor bij Duchenne patiënten en dus is het skippen van verschillende exonen nodig om het leesraam te kunnen herstellen voor deze verschillende patiënten. Inmiddels hebben we AONs geidentificeerd waarmee we het skippen van 20 verschillende exonen kunnen induceren in gekweekte spiercellen van een controle persoon (Hoofdstuk 2). Het skippen van deze exonen zou toepasbaar zijn voor meer dan 40% van alle Duchenne patiënten. Om aan te tonen dat deze strategie daadwerkelijk therapeutisch is, hebben we enkele van deze AONs gebruikt om het leesraam te herstellen in gekweekte cellen afkomstig van zes verschillende Duchenne patiënten (Hoofdstuk 3). Voor iedere patiënt konden we aantonen dat het beoogde exon was geskipt op RNA niveau en dat het dystrofine eiwit aanwezig was in meer dan 75% van de behandelde cellen. Dat dit eiwit waarschijnlijk functioneel was, werd bevestigd door de observatie dat ook andere, aan dystrofine gerelateerde eiwitten, weer tot expressie kwamen in deze cellen.
Voor toekomstige klinische trials willen we een AON analoog gebruiken die zo efficient en specifiek mogelijk werkt, met zo min mogelijk toxiciteit. De AONs die we tot nog toe gebruikt hebben, bevatten een 2'-O-methyl phosphorothioaat modificatie (2OMePS), die bij hogere concentraties toxisch is. Toch lijkt deze modificatie op dit moment het beste te zijn. We hebben verschillende andere modificaties getest en vonden een minder efficient en/of een minder specifiek effect (Hoofdstuk 5).
