Exon skipping therapy for dystrophic epidermolysis bullosa
Bremer, Jeroen
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2018
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Bremer, J. (2018). Exon skipping therapy for dystrophic epidermolysis bullosa. University of Groningen.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Appendices
191
A
Appendices 192
Ex
on siz
e
Figur e 1. Ther e is a clear diff er enc e in e xon siz e b et ween the NC1 domain
and the THD . T he length tha t is most obser ved in the THD is 36 bp . M ost e xons of the THD ar e dividable b y 9. The e xons tha t enc
ode the hinge
-domain; e xons 71 and 72, ar e immedia tely f ollo w ed b y the lar gest e xon 73 (201 bp ).
193
A
Ex
on siz
e
Figur e 1. Ther e is a clear diff er enc e in e xon siz e b et ween the NC1 domain
and the THD . T he length tha t is most obser ved in the THD is 36 bp . M ost e xons of the THD ar dividable b y 9. The e xons tha t enc
ode the hinge
-domain; e xons 71 and 72, ar e immedia tely f ollo w ed b y the lar gest e xon 73 (201 bp ).
In
tr
on siz
e
Figur e 2. Ther e is no clear diff er enc e in in tr on siz e b et ween the NC1 domain and the
THD
. T
he in
tr
on siz
e of the NC1 domain and the
THD domain do not clear
ly diff
in length.
The length of the in
tr
ons does not c
or
respond with the length of their sur
rounding e
xons
. I
ntr
on 64 with 1293 bp is b
y far the lar
gest in
tr
on of the
COL7A1
Appendices
195
Appendices
197
Appendices
199
Appendices
201
A
Appendices
202
Figure 1. AON treatment of Mdx mice leads to skipping of exon 23 in skin. RNA
anal-ysis of dermis, whole skin, and epidermis isolated from a skin biopsy taken from Mdx-mice treated with AONs against exon 23. Positive control muscle sample shows wild type length product only. Dermis and whole skin reveal exon skipping of exon 23. Epidermis shows negative for Dmd expression, as expected.
203
A
Figure 2. in vitro transfection of human and mouse fibroblasts show a difference in splice effect. Human fibroblasts and mouse fibroblasts were transfected with 250 nM of the
same exon 73 (201 bp) targeting AON. This resulted in skipping of exon 73 in human fibro-blast. RNA analysis of mouse fibroblasts transfected with the same AON showed skipping of exons 73, 74, and 75 combined (300 bp).
Summary
205
S
Summary
206
The aim of this thesis was to investigate exon skipping as potential therapeutic approach for dystrophic epidermolysis bullosa (DEB). To encapsulate the feasibility and impact of exon skipping as therapeutic approach for DEB, the thesis was divided into two parts. In
Part one, the feasibility of exon skipping was explored in chapters 2 through 5 by the
use of in vitro and in vivo experimental models. In Part two, the potential impact of exon skipping therapy on disease phenotypes was investigated in chapters 6 through 9 by examining naturally occurring exon skipping and alternative splicing in patients suffering from DEB and other EB subtypes. This thesis provided a complete overview of the current status of exon skipping therapy for DEB.
Dystrophic epidermolysis bullosa is caused by mutations in the COL7A1 gene, which encodes the type VII collagen protein. Type VII collagen secures attachment of the epidermis to the dermis by the formation of anchoring fibrils. These anchoring fibrils are composed of laterally aggregated type VII collagen molecules. Prior to lateral aggregation, multiple type VII collagen molecules form triple helices and subsequent dimerization results in mature type VII collagen. Proper triple helix formation is essential for assembly into fully functional anchoring fibrils. Mutations that cause DEB, either cause the complete absence of type VII collagen, or impair the triple helix formation which results in less- or nonfunctional type VII collagen. The clinical phenotype of DEB is varies widely from mild nail dystrophy to severe, generalized blistering of both skin and mucosae accompanied by the formation of scar tissue. In general, mild phenotypes are inherited dominantly (DDEB) and the severe phenotypes recessively (RDEB). The most severe subtype, RDEB-generalized severe (RDEB-gen sev), is caused by bi-allelic null mutations and complete absence of type VII collagen. Patients suffering from RDEB-gen sev die at a young age due to complications of the disease, mostly aggressive squamous cell carcinomas. To date, there is no therapy available, and treatment is merely palliative.
In this thesis, we investigated antisense oligonucleotide (AON)-mediated exon skipping as potential therapeutic approach for DEB. AON-mediated exon skipping utilizes Watson-Crick base pairing of RNA and DNA and steric hindrance to bypass the splicing machinery at the pre-mRNA level. In the nucleus, pre-mRNA is normally bound by small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) that initiate, facilitate and catalyze splicing. In the splicing process, the noncoding introns are removed and coding exons are joined together to form the mature mRNA that is translated into protein. Serine and arginine-rich proteins together with snRNPs bind, and thereby recognize, exons at so-called exonic splice enhancer (ESE) sequences. The AONs are designed to specifically bind and thereby block these ESE regions. As a result, the exon is no longer recognized as an exon and removed together with the surrounding introns, resulting in a slightly shorter mRNA and ultimately protein. The concept of exon skipping as therapy is to utilize AONs to remove an exon that
207
S
harbors the disease-causing mutation and thereby restore protein production.
In Chapter 2, we showed proof-of-concept for exon skipping as systemic therapeutic approach for DEB by systemically treating mice bearing human skin grafts. Using two AONs directed against exon 105, we treated healthy control and RDEB-gen sev patient grafts. The RDEB-gen sev patient cells did not express type VII collagen, due the homozygous c.7828C>T; p.Arg2610Ter null mutation in exon 105. First, in vitro transfection of the AONs into primary cultured fibroblasts and keratinocytes resulted in exon skipping at the RNA level, and restoration of type VII collagen at the protein level. Subsequently, we treated 4 mice bearing patient grafts via subcutaneous AON injection distal from the grafts. After 8 weeks of treatment, the skin grafts were harvested and examined for exon skipping and type VII collagen expression. As expected, the untreated patient grafts had complete absence of type VII collagen, whereas the treated patient grafts revealed exon skipping at the RNA level and re-expression of type VII collagen. Moreover, to some extent, functionality was shown by histological and ultrastructural normalization in the treated patient grafts.
In Chapter 3, we investigated whether the newly formed type VII collagen is functional. Type VII collagen lacking specific exons was recombinantly expressed and subsequently tested in in vitro and in vivo functionality assays. Besides type VII collagen lacking exon 105, exon 13 was chosen to test, as there is a British founder mutation in exon 13 known and thus multiple patients could benefit from a therapy for exon 13 mutations. The in vitro assays showed that type VII collagen lacking exon 13 or exon 105 can bind with comparable affinity as wildtype recombinant type VII collagen to type IV collagen and fibronectin, promote migration of fibroblasts, and form stable triple helices. Moreover, dermal injections of the recombinant type VII collagen lacking exon 13 or 105, promoted skin integrity and prevented blistering as effectively as wildtype recombinant type VII collagen. Overall, the functionality of type VII collagen was not impaired by the removal of exon 13 or 105 in the in vitro and in vivo functional assays used.
During the ultrastructural exploration of human skin grafts, grown on the back of athymic nude mice, we unexpectedly encountered anchoring fibrils (AFs) present in the untreated patient grafts. In Chapter 4 we investigated the origin of these AFs. Grafting models are widely used in DEB research, therefore, the presence of murine type VII collagen should be taken into account during analysis. After verifying the species specificity of two antibodies against human and murine type VII collagen, both healthy control and RDEB patient skin grafts were analyzed by immunofluorescence (IF). In addition to type VII collagen analysis, IF for type IV collagen was performed to visualize the lamina densa. Type IV collagen and type VII collagen IF results confirmed the presence and murine origin of both the
Summary
208
observed anchoring fibrils and type VII collagen in the RDEB patient skin grafts. These results imply that taking the origin of type VII collagen into account is essential for correct interpretation of results obtained with mouse skin graft models. Therefore, we strongly recommend the use of species specific antibodies.
In addition to exon skipping therapy, other RNA-based therapies for genodermatoses are extensively reviewed in Chapter 5. The current status and pros and cons of splice-modulating therapies, transcript replacement, and mutant allele-specific-knockdown are extensively discussed. Additionally, stop codon read-through, and RNA editing are discussed briefly.
Part two of the thesis, focused on naturally occurring exon skipping and alternative
splicing to provide insight into the impact of exon skipping as therapy for DEB, and possibly other types of epidermolysis bullosa.
In Chapter 6, the literature was scrutinized for DEB causing mutations that induce skipping of an entire exon. In total, 19 such mutations were found in the literature and 7 were identified in the DEB-cohort from Dutch EB database maintained by the Dermatology department at the University Medical Center Groningen. Both recessively and dominantly inherited phenotypes were observed, and the entire phenotypical spectrum of DEB was observed, from very mild dominant DEB to very severe recessive DEB. Dominant phenotypes caused by exon skipping were not different from phenotypes caused by other mutations, like frequently observed glycine-substitutions in the triple-helical domain. However, the observed recessive phenotypes caused by exon skipping, were generally milder. Two variants leading to RDEB, one that causes homogeneous skipping of exon 15, and one that causes homogeneous skipping of exon 19, are of particular interest as they reflect precisely the aim of AON-mediated exon skipping. Both skipping of exon 15 and skipping of exon 19, lead to mild forms of RDEB, highlighting the expected impact of successful exon skipping treatment in RDEB.
In Chapter 7, we describe a patient with junctional EB (JEB), in which bi-allelic null mutations in exon 18 (c.1490_1491delinsT, p.Ala497Valfs*23) and 49 (c.3487G>T, p.Glu1163Ter) were expected to result in the complete absence of type XVII collagen. However, clinical assessment revealed healthy skin patches and an overall milder than expected phenotype. Thorough analysis of the healthy looking skin patches at the DNA level, using laser dissection microscopy, identified an additional correcting mutation at the intron 48 acceptor site (c.3419–1G>T) that reinstated the reading frame by skipping of exon 49. This so-called revertant mosaicism lead to expression of type XVII collagen and healthy looking skin. Additionally, residual expression of type XVII collagen was observed in mutant skin. Analysis at the mRNA level revealed a low level of natural skipping of exon
209
S
49 in mutant skin as well. This exon skipping was induced by the inherited c.3487G>T mutation in exon 49, which abolishes an exonic splice enhancer sequence. This case illustrates that for JEB caused by mutations in the triple helical domain of type XVII collagen, especially in exon 49, exon skipping as therapy might also work.
In Chapter 8, we examined a case of a patient with severe generalized EBS caused by a heterozygous 30-bp long deletion in intron 6 (c.1218+2_1218+31del) of the KRT5 gene. This deletion significantly shortens the intron at the genomic DNA level and, as it encompasses the highly conserved splice sequences of the intron 6 splice donor site, it resulted in skipping of exon 6. This was confirmed by analysis of the mRNA. Despite the exon being skipped entirely, the patient had the severe generalized form of EBS. Most EBS phenotypes are autosomal dominantly inherited. There is a strong dominant negative effect of the mutant allele over the wild type allele. There are, however, recessive forms of EBS. Recessive EBS is generally more severe than dominantly inherited EBS. Exon skipping therapy will most likely never be 100% efficient, therefore, it will result in a mix of skipped, mutant, and wild type alleles. Therefore, because of the same reasons as for dominant DEB, exon skipping does not seem realistic for EBS.
To emphasize the importance of understanding physiological splicing, we presented a case of a patient with JEB caused by an intronic deletion in the PLEC gene in Chapter 9. In this chapter, we described a novel plectin isoform. This isoform is formed by alternative splicing at the intron 8 donor site. This remarkable finding led to the rescue of plectin expression in the presented case. A homozygous deletion in intron 8, c.906+19_40del, was identified in the proband. Analysis at the mRNA level revealed intron 8 retention that lead to a premature termination codon. Additionally, an alternative transcript was identified that was, interestingly not only found in the proband, but also in 5 healthy controls and was therefore the result of physiological alternative splicing. This alternative transcript is the result of a 12 bp upstream alternative splice donor site of intron 8 and was also observed in striated and myocardium muscle tissues in similar ratios as in skin. PLEC knockout mouse models show a severe neonatal mortality, and, in humans, loss of plectin expression leads to the most severe form of EBS. As the patient had a milder phenotype, the alternative isoform must be functional as it is the only plectin isoform expressed in the patient. The presented case illustrates the importance of understanding physiological splicing in order to adequately anticipate the effect of mutations. Moreover, in the context of exon skipping therapy, it illustrates that there is unexplored territory to discover to fully understand and make advantage of the splicing machinery.
Overall, exon skipping therapy for DEB is very promising and should be investigated further. There are several hurdles to take before the therapy can be taken towards the
Summary
210
clinic. In the discussion in Chapter 10, several questions in order from bench to bedside, are extensively discussed to complete the overview of exon skipping as therapeutic approach for DEB.
211
S
Samenvatting
212
Het doel van dit proefschrift was om exon skipping als therapeutische toepassing te onderzoeken voor dystrofische epidermolysis bullosa (DEB). Om dit overzichtelijk in het proefschrift vast te leggen is het verdeeld in twee delen. In Deel één wordt de haalbaarheid van exon skipping onderzocht in hoofdstukken 1-5, door middel van in vitro en in vivo experimentele modellen. In Deel twee, wordt de impact of het effect van exon skipping onderzocht in hoofdstukken 6-9 door natuurlijke exon skipping in DEB en andere EB-types te bestuderen en alternatieve splicing te ontrafelen. Dit proefschrift geeft hiermee een compleet overzicht van exon skipping als mogelijke therapie voor DEB.
Dystrofische epidermolysis bullosa wordt veroorzaakt door mutaties in het COL7A1 gen, dat voor het eiwit type VII collageen codeert. Type VII collageen zorgt voor aanhechting van de epidermis aan de dermis door de formatie van ankerfibrillen. Na synthese vormt type VII collageen triple helices die vervolgens lateraal clusteren als ankerfibrillen. Deze ankerfibrillen verbinden de lamina densa en de onderliggende extracellulaire matrix van de dermis. Het vormen van stabiele triple helices is essentieel voor de correcte vorming van functionele ankerfibrillen. Mutaties die DEB veroorzaken, zorgen voor de complete afwezigheid van type VII collageen of hinderen de vorming van stabiele triple helices dat resulteert in minder- of niet functioneel type VII collageen. Het klinische fenotype van DEB is zeer divers en loopt uiteen van milde nagelafwijkingen tot zeer ernstige, gegeneraliseerde blaarvorming van de huid en slijmvliezen. DEB kan zowel dominant (DDEB) als recessief (RDEB) overerven waarbij over het algemeen patiënten met recessieve fenotypes ernstiger zijn aangedaan dan patiënten met dominante fenotypes. De ernstigste gegeneraliseerde vorm van RDEB, RDEB-gen sev, wordt veroorzaakt door bi-allelische nulmutaties met volledige afwezigheid van type VII collageen als gevolg. Patiënten die lijden aan deze vorm van DEB sterven jong door complicaties van de ziekte, meestal agressieve plaveiselcelcarcinomen. Tot op heden, is er geen therapie beschikbaar en behandeling is palliatief.
In dit proefschrift hebben we antisense oligonucleotide (AON)-gemedieerde exon skipping onderzocht als mogelijke therapie voor DEB. AON-gemedieerde exon skipping maakt gebruik van Watson-Crick baseparing van RNA om het splicing mechanisme te beïnvloeden. In de nucleus binden normaal gesproken kleine nucleaire ribonucleoproteïnes (snRNPs) aan pre-mRNA en vormen samen het splicingmechanisme. In het splicingproces worden de niet-coderende intronen uit het pre-mRNA geknipt en de coderende exonen aan elkaar geplakt om zo het mature mRNA te vormen. Het doel van exon skipping is deze normale splicing te beïnvloeden met AONs. Dat kan door AONs te laten binden aan essentiële zogeheten exonic splice enhancer (ESE) sequenties in het gemuteerde exon. Daarmee worden de ESEs geblokkeerd, waardoor het exon, waarin zich de nulmutatie bevindt, niet langer zal worden herkend als zijnde een exon en samen
213
S
met omliggende intronen uit het mRNA wordt gespliced. Het resultaat is een iets korter matuur mRNA en uiteindelijk eiwit.
In Hoofdstuk 2, laten we proof-of-concept zien van exon skipping als systemische therapie voor DEB. In eerste instantie hebben we de AONs in vitro getransfecteerd in primair gekweekte fibroblasten en keratinocyten. De RDEB-gen sev patiëntencellen gebruikt in deze studie zijn volledig negatief voor type VII collageen als gevolg van de homozygote c.7828C>T mutatie. Dit resulteerde in skipping op RNA niveau en herstel van eiwitsynthese in de patiëntencellen. Vervolgens hebben we muizen getransplanteerd en vier muizen met patiënten grafts behandeld met twee AONs tegen COL7A1 exon 105 via subcutane injecties distaal van de graft. Na 8 weken behandeling werden de grafts geoogst en onderzocht voor exon skipping. Zoals verwacht lieten de gezonde controle grafts type VII collageen expressie zien en waren de niet-behandelde patiëntengrafts volledig negatief voor type VII collageen. De behandelde patiëntengrafts lieten echter exon skipping zien op RNA-niveau en herstel van type VII collageen synthese op eiwit-niveau. Bovendien lieten de histologische en ultrastructurele readouts normalisatie zien en daarmee, tot op zekere hoogte, functionaliteit en herstel van het structurele fenotype zien.
In Hoofdstuk 3, hebben we onderzocht of het nieuwgevormde type VII collageen als gevolg van exon skipping functioneel is. Om dit te onderzoeken werden exon 13 of 105 uit het COL7A1 cDNA gekloneerd door middel van deletie-PCRs. Exon 13 werd naast exon 105 gekozen omdat er een Britse founder mutatie is beschreven in exon 13 en dit exon dus aantrekkelijk is als target. Bovendien is het vanuit een moleculair oogpunt interessant om een deletie in de amino-terminus te vergelijken met een deletie aan de carboxyl-teminus van de triple-helix. Deze cDNAs werden vervolgens in HEK293 cellen tot expressie gebracht en het type VII collageen geïsoleerd voor downstream analyses. Vervolgens werd het recombinante type VII collageen zonder exon 13 of 105 in vitro getest op de formatie van stabiele triple helices, binding aan bindingpartners type IV collageen en fibronectine, en het faciliteren van fibroblastenmigratie. In deze testen bleek zowel skipping van exon 13 of exon 105 geen invloed te hebben op de functionaliteit. Eveneens bleek dat dermale injecties van het geskipte eiwit in een type VII collageen hypomorf muismodel leidden tot incorporatie in de basaalmembraan en daarmee de integriteit van de huid bevorderden. Samenvattend bleek het type VII collageen als gevolg van exon 13 of 105 skipping functioneel te zijn in in vitro en in vivo analyses.
Tijdens de transmissie elektronenmicroscopie (TEM) analyses van humane grafts gegroeid op de rug van de muizen werden onverwachts ankerfibrillen geobserveerd in humaan type VII collageen-negatieve grafts. In Hoofdstuk 4 hebben we de oorsprong
Samenvatting
214
van dit type VII collageen onderzocht. Omdat graftmodellen veel worden gebruikt in onderzoek naar DEB is het karakteriseren van type VII collageen expressie in deze grafts essentieel voor juiste interpretatie van geobserveerde resultaten. Na verificatie van de soort-specificiteit van de antilichamen gebruikt voor immunofluorescentie (IF) werd IF uitgevoerd op zowel gezonde controle grafts als RDEB grafts. Ook werd IF voor type IV collageen gedaan om de lamina densa te visualiseren. Zowel de type IV collageen als de type VII collageen IF analyses bevestigden de resultaten van de TEM. De IF voor muizen type VII collageen bevestigde de aanwezigheid van muizen type VII collageen in zowel de gezonde controle als RDEB grafts, terwijl humaan type VII collageen afwezig was in RDEB grafts. De geobserveerde ankerfibrillen zijn dus afkomstig van muizen type VII collageen. De aanwezigheid van ankerfibrillen verklaart waarschijnlijk ook waarom we geen aanwijzingen zagen voor (micro)blaren in de RDEB grafts. Deze resultaten laten zien dat het essentieel is om onderscheid te maken tussen humaan en muizen type VII collageen als dit invloed heeft op de interpretatie van de resultaten.
Naast exon skipping therapie zijn andere RNA-gebaseerde therapieën voor genodermatosen uitgebreid beoordeeld in Hoofstuk 5. Van splice-modulerende therapieën, transcript replacement en specifieke knockdown van een mutant allel zijn het mechanisme, huidige status en de voordelen en nadelen per therapeutische toepassing uitvoerig beschreven.
Deel twee van dit proefschrift richt zich op natuurlijk voorkomende exon skipping
en alternatieve splicing om een inzicht te geven in het te verwachten effect van exon skipping therapie voor DEB. Daarnaast licht deel twee een tip van de sluier op voor exon skipping therapie voor andere vormen van epidermolysis bullosa.
In Hoofdstuk 6 is uitvoerig in de literatuur gezocht naar mutaties die het skippen van een volledig exon van het COL7A1 gen veroorzaken. In totaal werden 19 exon skipping mutaties in de literatuur gevonden en daarnaast 7 in het DEB-cohort in de Nederlandse EB database van het Universitair Medisch Centrum Groningen. Zowel dominante als recessieve fenotypes als gevolg van exon skipping werden gevonden, waarbij het hele fenotypische spectrum van DEB werd geobserveerd van milde dominante DEB tot ernstige recessieve DEB. DDEB fenotypes veroorzaakt door exon skipping verschilden niet van de DDEB fenotypes veroorzaakt door glycine-substituties in de triple helix. In tegenstelling tot DDEB werden bij recessieve fenotypes veroorzaakt door exon skipping voornamelijk fenotypes beschreven meer aan de milde kant van RDEB. Twee van de beschreven varianten zijn erg interessant in de context van exon skipping therapie omdat deze bewerkstelligen wat exon skipping therapie probeert te induceren: het skippen van een nulmutatie. De mutaties leidden tot homozygote skipping van exon 15 en exon 19. Het expressieniveau
215
S
van type VII collageen bleek sterk gereduceerd, echter, het resulterende fenotype was mild ten opzichte van het verwachtte fenotype bij een homozygote nulmutatie. De bevindingen van hoofdstuk 6 leiden tot de conclusie dat exon skipping niet geschikt zal zijn voor dominante DEB veroorzaakt door heterozygote mutaties. Echter, de verbetering van het fenotype door natuurlijke exon skipping bij enkele patiënten laat zien dat exon skipping mogelijk wel succesvol is bij recessieve DEB. Opgemerkt moet daarbij worden dat bij enkele patiënten met natuurlijke exon skipping mutaties nog steeds een ernstig gegeneraliseerd fenotype werd beschreven. Of exon skipping zal werken voor alle exonen die in-frame zijn, moet de toekomst dus uitwijzen.
De structuur van het triple helix domein van het type XVII collageen eiwit is vergelijkbaar met dat van type VII collageen. Daarom is de hypothese dat ook voor junctionele EB (JEB), veroorzaakt door nulmutaties in het triple helix domein van het type XVII collageen, exon skipping zou kunnen werken als therapie. In Hoofdstuk 7 beschrijven we een patiënt met JEB, veroorzaakt door bi-allelische nulmutaties in exon 18 (c.1490_1491delinsT, p.Ala497Valfs*23) en exon 49 (c.3487G>T, p.Glu1163Ter) van het COL17A1 gen. Verrassend was het klinische beeld van de patiënt, dat milder was dan verwacht bij bi-allelische nulmutaties. Bovendien waren er lokale gezond uitziende delen van de huid zichtbaar. Verdere analyse van deze gezond ogende huid liet zien dat hier expressie van type XVII collageen aanwezig was. Met laser dissection microscopy (LDM), werden de cellen geïsoleerd die type XVII collageen expressie vertoonden. DNA analyse op deze samples liet zien dat de cellen die type XVII collageen tot expressie brachten een additionele, corrigerende mutatie droegen in de acceptor site van intron 48 (c.3419-1G>T). Dit zogeheten revertant mozaïcisme leidde tot exon 49 skipping en daarbij type XVII collageen expressie en gezond uitziende huid. Analyse van aangedane huid liet ook, in mindere mate dan in de gezond uitziende huid, type XVII collageen expressie zien. Analyse van het mRNA toonde dat de kiembaan mutatie c.3487G>T zelf ook skipping van exon 49 induceerde en daardoor een kleine hoeveelheid type XVII collageen expressie geeft. Deze casus illustreert dat exon skipping als therapie ook voor JEB veroorzaakt door nulmutaties in het triple helix domein van type XVII collageen, zou kunnen werken.
In tegenstelling tot JEB, lijkt exon skipping therapie niet geschikt voor EB simplex (EBS) veroorzaakt door mutaties in het KRT5 gen. Dit wordt beschreven aan de hand van een casus van een patiënt met de ernstig gegeneraliseerde vorm van EBS in Hoofdstuk 8. De EBS wordt veroorzaakt door een heterozygote 30 bp lange deletie in intron 6 van het KRT5 gen (c.1218+2_1218+31del). Deze intronische deletie omvat essentiële splice sequenties van intron 6. Als gevolg hiervan wordt exon 6 met omliggende intronen uit het mRNA gespliced, oftewel geskipt. De meeste vormen van EBS erven dominant over. Er is dan sprake van een sterk dominant negatief effect van het mutante allel. Hoewel
Samenvatting
216
er ook recessieve vormen van EBS zijn, zijn deze ernstiger dan dominante EBS. Zoals dit hoofdstuk laat zien, leidt het heterozygoot skippen van KRT5 exon 6 leiden tot de ernstig gegeneraliseerde vorm van EBS. Exon skipping als therapie voor EBS zal niet leiden tot 100 % efficiëntie en daarom altijd tot een heterozygote mix van geskipt, mutant en wild-type eiwit. Daarom zal exon skipping voor EBS, om dezelfde reden als voor dominante DEB, hoogstwaarschijnlijk geen uitkomst kunnen bieden.
Om nadruk te leggen op het belang van kennis van fysiologische splicing hebben we een casus beschreven van een patiënt met JEB, veroorzaakt door een intronische deletie in PLEC. In Hoofdstuk 9 beschrijven we een nieuw geïdentificeerde isoform van plectine. Deze isoform kent zijn oorsprong door een alternatieve splice donor site in intron 8. Deze opmerkelijke bevinding leidde in de gepresenteerde casus tot residuele expressie van plectine. Een homozygote deletie in intron 8 (c.906+19_40del) werd geïdentificeerd in de patiënt. Deze grote deletie leidde tot intron 8 retentie, een frameshift en prematuur stop codon. Opmerkelijk was een additioneel PCR product dat structureel gevonden werd bij de patiënt en 5 gezonde controles. Dit alternatieve transcript bleek het resultaat van een splice donor site 12 bp upstream van de splice donor site van intron 8 en werd ook geobserveerd in dwarsgestreept spierweefsel en myocardium weefsel. Deze isoform is fysiologisch en blijkbaar, omdat het het enige plectine eiwit is dat bij de patiënt gevormd wordt, functioneel. Volledige afwezigheid van plectine zorgt in muismodellen voor neonataal sterven en bij de mens tot een zeer ernstig fenotype, in tegenstelling tot de gepresenteerde casus. Deze bevindingen illustreren het belang van kennis over fysiologische en alternatieve splicing om te kunnen anticiperen op het effect van mutaties. In het kader van exon skipping therapie laat het zien dat er nog onbekende gebieden zijn die moeten worden onderzocht om het splicing mechanisme volledig te begrijpen en er gebruik van te maken in therapeutische setting.
Samenvattend is exon skipping therapie voor DEB veelbelovend en moet verder worden onderzocht. Er staan nog obstakels op de weg van de bench to bedside. Deze worden in
Hoofdstuk 10 uitgebreid bediscussieerd om een volledig toekomstperspectief van exon
217
Dankwoord
219
D
Dankwoord
Veel mensen hebben bijgedragen aan dit proefschrift, inhoudelijk of buiten het werk om. Ik zou iedereen graag willen bedanken daarvoor! Het zijn te veel mensen om allemaal te noemen maar een aantal mensen wil ik hieronder toch kort persoonlijk bedanken. Allereerst wil ik Marcel bedanken. Bedankt voor de kans die je me hebt gegeven om te promoveren bij jouw afdeling Dermatologie. Promoveren is niet mogelijk zonder een professor die achter je staat en zo heb ik het vanaf het eerste moment ervaren. Je scherpe kritische blik heeft mij altijd uitgedaagd en van mij een gedreven onderzoeker gemaakt. Ik hoop dat onze samenwerking en de samenwerking tussen dermatologie en genetica nog vele mooie vruchten oplevert. Bedankt voor alles!
Marjon, zonder jouw E-RARE subsidie waarin de samenwerking met Freiburg, Salzburg en Leiden is opgezet, zou dit proefschrift er nu niet liggen. Ik kwam bij de afdeling dermatologie voor een afstudeerstage voor mijn opleiding tot biotechnoloog waarna ik kon blijven als research analist. Onze samenwerking is altijd erg goed geweest en ik heb mij altijd op mijn gemak gevoeld. Als dat niet zo zou zijn, had ik waarschijnlijk niet hebben durven vragen of je het zag zitten om mij als promovendus aan te nemen op het project. Daar twijfelde je niet lang over; twee dagen later lag er een getekend contract. We hebben mooie trips kunnen maken in het kader van onderzoek. Daarnaast hebben we een mooie road-trip gemaakt door de westkust van Amerika. Dat kan natuurlijk alleen als er een goede klik is. Heel erg bedankt, ik hoop dat we nog veel kunnen doen samen in de toekomst. Oh, en als Dobby nog een keer uit moet.. ik heb nog een sleutel.
Peter, wij kennen elkaar sinds ik voor het eerst voet zette in het UMCG. Bij de afdeling Genetica is de eerste echte vonk voor onderzoek overgesprongen. We hebben samen patiënten met DEB gegenotypeerd en gezocht naar een genotype-fenotype correlatie. Daar begon mijn interesse in DEB en toen je aan het einde van mijn stage samen met Marjon het exon skipping project ging opzetten bij de afdeling dermatologie, vroeg ik of ik daar mijn afstuderen kon doen, de rest is geschiedenis. Ik benijd jouw capaciteit om vragen te stellen, je stelt net zo lang vragen totdat er geen antwoord meer komt. Daar heb ik veel van geleerd en ik hoop dat ik ooit in de buurt kom. Nu werken we weer samen bij de afdeling Genetica en is de cirkel rond. Maar laten we er een dubbelstrengs cirkel van maken, want we zijn nog lang niet klaar. Ik hoop dat wij nog vele jaren samen kunnen werken aan EB en mooie projecten kunnen opzetten. Peter, bedankt!
Dankwoord
220
hulp bij het tot stand brengen van dit proefschrift en promotie. Wat hebben wij veel gelachen... Ik hoop dat wij altijd zo nuchter blijven en nog vele jaren gaan pilzen, bowlen en ouwehoeren. Bedankt, jongens! Joost, wat wordt onze nieuwe challenge?
Hendri, ontzettend bedankt voor de mogelijkheden en vrijheid die je mij gaf op het lab. Als hoofd van het lab wist je soms dat iets niet zou werken en toch zei je: “probeer het maar”. Je hebt altijd mijn nieuwsgierigheid gestimuleerd. De passie die jij hebt over fundamentele vraagstukken en het geduld wat jij uitstraalt, zijn een inspiratie voor velen. Bedankt voor alles, en bedankt voor de gezelligheid tijdens onze borrels.
Miranda, bedankt voor het werk en de tijd die je hebt gestoken in mij om mij in te werken bij de afdeling dermatologie. En natuurlijk mij vertellen dat ik mijn zooi moest opruimen. Je bent een fantastisch persoon en ik heb veel van je geleerd. Bedankt voor alles! Maar je bent nog niet van mij af, hoor! Ik zal nog vaak op het lab komen en we zullen nog vele cellen kweken. Ik zal beloven mijn troep op te ruimen.. en wie weet gaan we nog een keer samen duiken. Zeker gaan we nog een keer whisky en huisgebrouwen bier drinken. Daryll, bedankt voor al het werk dat jij hebt gestoken in transfecties en exon 73 van Col7a1. Bedankt voor jouw geduld! Het was een mooie tijd en ik hoop dat je een toffe tijd hebt als microchirurg!
Janny, Gonnie, Duco, Laura, Nynke en Marije, ontzettend bedankt voor de leuke tijd op het lab! Janny, bedankt voor het snijden en het mij leren snijden van coupes. Gonnie, bedankt voor de controle coupes als ik daar weer eens om vroeg. Duco, bedankt voor het uitstekende werk wat je hebt gedaan voor de EM. Laura, bedankt voor het leren western blotten en Marije, bedankt voor de gezelligheid! Nynke, het was kort maar krachtig! Bedankt.
AIOS, bedankt voor de gezellige tijd! Van slapen op een boot, tot speurtochten in de duinen, tot hossen in de kroeg. Het was altijd beregezellig!
José, bedankt voor al je hulp met de patiënten. Ik kom vast nog eens bij je met de vraag of je contact kunt opnemen met een familie. Bedankt.
Annemieke, heel erg bedankt voor jouw input voor het exon skipping project. Jouw advies over AON design en opzet van experimenten (en welke Pokémon te vangen waren) was van onschatbare waarde voor het project. Ook ontzettend bedankt voor de gezelligheid en humor die jij overal mee naartoe neemt. Hopelijk hebben we nog lang contact en werken we nog een keer samen aan een project. Bedankt!
221
D
Jackie, thank you for shaping my English into readable sentences.
Lieve ouders, pap en mam, bedankt voor de vrijheid en mogelijkheden die jullie mij hebben gegeven om mij te ontwikkelen tot de persoon die ik ben. Als ik naar jullie kijk zie ik een voorbeeld. Bedankt voor alles.
Lieve Inge, bedankt voor het zijn wie je bent. Jij hebt mij geleerd om… Nee. Jij probeert mij nog steeds te leren om iets kort en bondig uit te leggen, zonder “onnozele details”. Hopelijk gaat dat ooit nog lukken... Adventure is out there!
in Diever. Na de middelbare school aan de Regionale Scholengemeenschap Stad en Esch in Diever volgde hij aan het Van Hall Larenstein de opleiding Biotechnologie met de majors Biomedisch Onderzoek en Plant Biotechnologie. Tijdens deze opleiding heeft Jeroen onderzoek gedaan bij de afdeling plantenfysiologie van de biologie faculteit aan de Rijksuniversiteit Groningen. Hier heeft hij samen met dr. Frank Lanfermeijer onderzoek verricht aan de flagellin-receptor in Arabidopsis thaliana. Vervolgens heeft hij met dr. Peter van den Akker onderzoek gedaan bij de afdeling Genetica bij het Universitair Medisch Centrum Groningen, waar hij patiënten heeft gegenotypeerd en heeft gezocht naar een genotype-fenotype correlatie tussen het MMP1 gen en dystrofische epidermolysis bullosa. Jeroen studeerde af bij de afdeling Dermatologie van het Universitair Medisch Centrum Groningen, waar hij het exon skipping project heeft opgezet samen met dr. ir Marjon Pasmooij en dr. Peter van den Akker. Vervolgens heeft hij gewerkt aan dit project als research analist voordat hij begon als promovendus in 2013 bij prof. dr. Marcel Jonkman aan de Graduate School of Medical Sciences van de Rijksunversiteit Groningen. Na succesvolle afronding van zijn promotie, werkt Jeroen verder aan RNA-therapieën samen met dr. Peter van den akker bij de afdeling Genetica van het Universiteit Medisch Centerum Groningen.
