VU Research Portal
The When, What & How of Measuring Vitamin D Metabolism
Dirks, N.F.
2020
document version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Link to publication in VU Research Portal
citation for published version (APA)
Dirks, N. F. (2020). The When, What & How of Measuring Vitamin D Metabolism.
General rights
Copyright and moral rights for the publications made accessible in the public portal are retained by the authors and/or other copyright owners and it is a condition of accessing publications that users recognise and abide by the legal requirements associated with these rights. • Users may download and print one copy of any publication from the public portal for the purpose of private study or research. • You may not further distribute the material or use it for any profit-making activity or commercial gain
• You may freely distribute the URL identifying the publication in the public portal ? Take down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
E-mail address:
vuresearchportal.ub@vu.nl
142
Appendix II
De vloeistofchromatograaf gekoppeld aan een massaspectrometer (LC-MS/MS) heeft de afgelopen jaren de klinische laboratoria veroverd [1]. Vooral wat betreft steroïdhormonen betekende dit een substantiële verbetering ten opzichte van de traditioneel veel gebruikte immunoassays met een gebrekkige specificiteit. Derhalve maakt een toenemend deel van de ziekenhuislaboratoria nu gebruik van de LC-MS/ MS om de vitamine D status van patiënten te onderzoeken. Dit proefschrift focust op de meest belangrijke markers in het beoordelen van het vitamine D metabolisme: 25-hydroxyvitamine D (25(OH)D), 1,25-dihydroxyvitamine D (1,25(OH)2D), 24,25-dihydroxyvitamine D (24,25(OH)2D) en fibroblast groeifactor 23 (FGF23), met als doel het verbeteren van de methodologie voor de markers van het vitamine D metabolisme en het laten zien van hun nut in diagnostiek en wetenschappelijk onderzoek.
Deel II van dit proefschrift richt zich op de methodologie. De kwaliteit van de
bestaande methoden is onderzocht en nieuwe methoden die kunnen worden toegepast in het diagnostisch proces en in wetenschappelijk onderzoek zijn beschreven.
25(OH)D
25(OH)D wordt het meest gemeten om de vitamine D status van een patiënt te bepalen en is de beste indicator voor het aantonen van vitamine D deficiëntie. Veel laboratoria gebruiken tegenwoordig LC-MS/MS om 25(OH)D te meten. Alhoewel dit zeker een verbetering is ten opzichte van de immunoassay, is de spreiding in resultaten verkregen met de LC-MS/MS methoden die de verschillende laboratoria hebben opgezet nog groot. De focus ligt daarom nu op standaardisatie van methoden om het vergelijken van de resultaten verkregen met verschillende methoden te vergemakkelijken. In Hoofdstuk 2, hebben we de huidige stand van zaken met
betrekking tot de standaardisatie van methoden onderzocht in Nederland door ze onderling en met een referentiemethode te vergelijken. Alhoewel de methoden zeer verschillend waren, correleerden de verkregen resultaten in gezonde individuen (R > 0.993) en in verschillende patiëntgroepen (R > 0.989) zeer goed. We zagen wel
enkele kleine biases (<14%) in de vergelijkingen van twee methoden die zouden kunnen worden verholpen met het rekalibreren van de methoden. We concludeerden dan ook dat de Nederlandse 25(OH)D methoden, ondanks verschil in kalibratie procedures, goed gestandaardiseerd zijn. Desalniettemin laten internationale resultaten van rondzendingen zien dat de standaardisatie wereldwijd nog verre van ideaal is (ongepubliceerde resultaten). We zullen ons dus moeten blijven inzetten voor verdere standaardisatie van 25(OH)D LC-MS/MS methoden.
1,25(OH)
2D
1,25(OH)2D is het actieve metaboliet van vitamine D, het zorgt voor adequate calcium opname. Het is over het algemeen onzinnig om 1,25(OH)2D te meten voor het bepalen van de vitamine D status van een patiënt. Daarvoor is 25(OH)D veel nuttiger. In enkele specifieke gevallen kan het echter van diagnostisch nut zijn om 1,25(OH)2D te bepalen. Hoofdstuk 3 beschrijft een LC-MS/MS methode voor het
bepalen van 1,25(OH)2D. Het betreft een uitvoerig gevalideerde methode die is vergeleken met een commerciële immunoassay, een andere gepubliceerde LC-MS/ MS methode van de Katholieke Universiteit (KU) in Leuven, en de resultaten van de vitamine D internationale rondzending (DEQAS). De LC-MS/MS methode van de KU Leuven gaf 21% hogere resultaten, die naar later bleek werden veroorzaakt door de aanwezigheid van 1β,25(OH)2D3, een interferentie die onze LC-MS/MS methode niet beïnvloedt [2]. Na aanpassingen van de KU Leuven methode werd het verschil verkleint naar 14%. Waar het overgebleven verschil vandaan komt is onbekend, maar geeft wel aan dat er nog stappen gedaan moeten worden met betrekking tot standaardisatie van de methoden voor 1,25(OH)2D.
We hebben met onze methode referentiewaarden bepaald in 96 gezonde vrijwilligers, mannen en vrouwen, tussen de 20 en 70 jaar oud. Voor 1,25(OH)2D3 heeft dit geresulteerd in een interval van 59 tot 159 pmol/L. Zonder een referentiemethode en daaropvolgende standaardisatie kunnen deze waarden niet zomaar worden overgenomen voor andere LC-MS/MS methoden..
144
Appendix II
24,25(OH)
2D
24,25(OH)2D is het inactieve metaboliet van 25(OH)D. Wanneer er geen deactivatie kan plaatsvinden van actief vitamine D, hoopt het zich op en zorgt voor excessieve calciumconcentraties in het bloed. Het kan dan van meerwaarde zijn de ratio tussen 25(OH)D en 24,25(OH)2D te meten om te achterhalen of er nog wel adequate deactivatie plaatsvindt. Net zoals 1,25(OH)2D wordt 24,25(OH)2D alleen sporadisch gemeten en is standaardisatie nog geen feit. Echter bestaat er voor dit metaboliet al wel een referentiemethode. Deze is gebruikt om referentiemateriaal (SRM 972a) te meten [3,4]. Een recente publicatie die zes verschillende 25,25(OH)2D methoden heeft vergeleken laat zien dat er wel degelijk behoefte is aan standaardisatie [5]. Hoofdstuk 4 beschrijft onze LC-MS/MS methode voor
het meten van 24,25(OH)2D en 25(OH)D. De validatie is uitgevoerd met behulp van de richtlijnen van de FDA en EMA. Daarnaast is de methode gekalibreerd met eerder genoemd referentiemateriaal. Referentiewaarden zijn vastgesteld door 24,25(OH)2D concentraties te bepalen in 92 gezonde vrijwilligers, mannen en vrouwen, tussen de 20 en 70 jaar oud. Dit resulteerde in een referentie-interval van 0,4 tot 8,9 nmol/L en een interval van 10 tot 33 voor de 25(OH)D/24,25(OH)2D ratio. Aangezien het hier een gestandaardiseerde methode betreft kunnen de referentiewaarden als universeel worden gezien.
Hopelijk zal de internationale rondzending voor vitamine D (DEQAS) zijn monsters snel van een richtwaarde gaan voorzien om zo de standaardisatie van alle 24,25(OH)2D methoden te bevorderen.
fgf23
FFGF23 remt de activatie en stimuleert de deactivatie van 25(OH)D en speelt daarmee een belangrijke rol in de vitamine D huishouding. Het is geen steroïdhormoon, maar een eiwithormoon. Het opzetten van LC-MS/MS bepalingen voor eiwitten is een stuk moeilijker en er is nog niemand in geslaagd er een op te zetten voor FGF23. In Hoofdstuk 5 hebben we daarom de huidige immunoassays
voor FGF23 bestudeerd en dan met name de veronderstelde pre-analytische instabiliteit van FGF23 wanneer gebruikt wordt gemaakt van deze assays [6]. Door
bestaande recente literatuur aan te vullen met nieuwe experimenten hebben we laten zien dat het toevoegen van proteaseremmers, zoals eerder werd aanbevolen, onnodig is bij gebruik van alle huidige immunoassays voor FGF23. Het is echter nog altijd aanbevolen om monsters snel te centrifugeren om problemen te voorkomen die optreden wanneer er te lang wordt gewacht met het opwerken van de monsters.
Vooralsnog lijken de FGF23 immunoassays dus adequaat te presteren. Desalniettemin zal een mogelijke LC-MS/MS methode ons in theorie veel meer informatie kunnen verschaffen dan een immunoassay. Posttranslationele modificaties, verschillende eiwitfragmenten en mutaties resulteren allen in een andere massa en kunnen dus worden onderscheiden met behulp van LC-MS/MS. Het ontwikkelen van een dergelijke methode wordt echter bemoeilijkt door de behoefte aan een uitvoerige monstervoorbewerking en door de gevoeligheid van onze huidige massaspectrometers. Het blijft de vraag of de LC-MS/MS ook voor de eiwithormonen langzamerhand de immunoassays zal vervangen.
De studies in deel II van dit proefschrift dragen bij aan de kwaliteit en kennis van
de methodologie voor de beoordeling van de vitamine D status. De verschillende vitamine D metabolieten en FGF23 bevinden zich ieder in verschillende fases van methodeverbetering (Figuur 1), en vragen dus om een andere aanpak. Dit heeft geresulteerd in de diverse set publicaties in deel II van dit proefschrift. De
optimalisatie gaat door en LC-MS/MS methoden zullen steeds breder toepasbaar zijn in meer verschillende matrices, zoals gedroogde bloedspots of weefsels. Versimpelde en op termijn geautomatiseerde LC-MS/MS systemen zullen meer en meer laboratoria in staat stellen de techniek toe te gaan passen, en zullen de noodzaak van specialistische analisten verminderen. Hopelijk zal deze trend van versimpeling en automatisering niet leiden tot achteruitgang op het gebied van accuraatheid en specificiteit.
Deel III van dit proefschrift beschrijft de klinische en wetenschappelijke
toepassingen van de LC-MS/MS methode voor het bepalen van 24,25(OH)2D en 25(OH)D.
146
Appendix II
In onderzoek wordt steeds vaker gebruikt gemaakt van LC-MS/MS methoden. Het is nu zaak deze technologische vooruitgang te gebruiken om de rol van vitamine D bij gezondheid en ziekte te verduidelijken. Nieuwere generaties van meer gevoelige LC-MS/MS instrumenten zullen ons in staat stellen om nog specifieker bepaalde verstoringen in het vitamine D metabolisme te bestuderen. Daarmee kunnen we wellicht een stap zetten in het ophelderen van de daadwerkelijke positieve effecten van vitamine D. De eindeloze hoeveelheid studies die een relatie tussen verlaagde 25(OH)D concentraties in het bloed en een verhoogde kans op ziekte aan zeggen te tonen zijn merendeel gebaseerd op metingen met een immunoassay. Dit heeft geleid tot een voortdurende ophoging van de 25(OH)D concentratie die wij gezond achten. Door een 25(OH)D concentratie van >50 nmol/L of zelf >75 nmol/L aan te houden voor vitamine D sufficiëntie, zien wij een groot deel van de “gezonde” wereldbevolking als ziek. We moeten wellicht de mogelijkheid overwegen dat ons concept van vitamine D sufficiëntie en de daarbij behorende 25(OH)D concentratie zijn vertroebeld door gebruik te maken van ongeschikte en ongestandaardiseerde
Fase 1: Ontwikkeling Fase 2: Vergelijken Fase 3: Harmonizatie Phase 4: Standardisatie 25(OH)D Eerste LC-MS/MS methode Meerdere LC-MS/MS methoden Monitoren periodieke kwaliteit Referentie methode Fase 1 Fase 2 Fase 3 Fase 4 1,25(OH)2D Fase 1 Fase 2 Fase 3 Fase 4 24,25(OH)2D Fase 1 Fase 2 Fase 3 Fase 4 FGF23 Eerste LC-MS/MS methode Eerste LC-MS/MS methode Eerste LC-MS/MS methode Meerdere LC-MS/MS methoden Meerdere LC-MS/MS methoden Referentie methode Referentie methode Referentie methode Meerdere LC-MS/MS methoden Monitoren periodieke kwaliteit Monitoren periodieke kwaliteit Monitoren periodieke kwaliteit
Figuur 1. De verschillende fases van methodeverbetering voor 25(OH)D, 1,25(OH)2D, 24,25(OH)2D en FGF23.
immunoassays. Nu de kosten van het implementeren van een LC-MS/MS omlaag zijn gegaan en resultaten sneller kunnen worden gegenereerd, is het gebruik ervan in grote studies ook mogelijk, zoals hoofdstukken 6 en 7 laten zien.
Hoofdstuk 6 beschrijft een studie in patiënten met acute lymfoblastische leukemie.
Het toont een relatie aan tussen de daling in 25(OH)D3 concentraties gedurende methotrexaat behandeling en het ontstaan van ernstige orale mucositis. 25(OH) D3 concentraties voor methotrexaat behandeling werden niet geassocieerd met het ontwikkelen van ernstige orale mucositis. Of de daling in 25(OH)D3 concentraties een effect of een oorzaak is van het ontwikkelen van ernstige orale mucositis blijft onduidelijk.
Hoofdstuk 7 laat zien dat de 25(OH)D/24,25(OH)2D ratio geen meerwaarde heeft in het voorspellen van de individuele respons op vitamine D suppletie in vergelijking met 25(OH)D alleen.
Dit proefschrift biedt de beschrijvingen van drie nieuwe LC-MS/MS methoden voor het bepalen van de voorname vitamine D metabolieten 25-hydroxyvitamine D, 1,25-dihydroxyvitamine D en 24,25-dihydroxyvitamine D. De methoden, zoals hier beschreven, kunnen in combinatie met de vastgestelde referentie intervallen worden gebruikt voor het vaststellen van ontregelingen in het vitamine D metabolisme. Daarnaast bieden de methoden de mogelijkheid nog beter en gerichter onderzoek te doen. Verder hebben we aangetoond dat het toevoegen van proteaseremmers niet langer nodig is bij het gebruik van de huidige immunoassays voor intact FGF23. Als geheel draagt dit proefschrift bij aan een verbetering in het meten, en het interpreteren, van het vitamine D metabolisme en FGF23.
referenties
1. Annesley, T.M., R.G. Cooks, et al., Clinical Mass Spectrometry-Achieving Prominence in Laboratory Medicine. Clin Chem, 2016. 62(1): p. 1-3.
2. Pauwels, S., I. Jans, et al., 1beta,25-Dihydroxyvitamin D3: A new vitamin D
metabolite in human serum. J Steroid Biochem Mol Biol, 2017. 173: p. 341-348.
3. Tai, S.S. and M.A. Nelson, Candidate
Reference Measurement Procedure for the Determination of (24R),25-Dihydroxyvitamin D3 in Human Serum Using
148
Appendix II
Isotope-Dilution Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Anal
Chem, 2015. 87(15): p. 7964-70.
4. Tai, S.S., M.A. Nelson, et al., Development of Standard Reference Material (SRM) 2973 Vitamin D Metabolites in Frozen Human Serum (High Level). J AOAC Int, 2017. 100(5): p. 1294-1303.
5. Wise, S.A., S.S. Tai, et al., Interlaboratory Comparison for the Determination of 24,25-Dihydroxyvitamin D(3) in Human Serum Using Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry. J AOAC Int, 2017. 100(5): p. 1308-1317.
6. Smith, E.R., M.L. Ford, et al., Instability of fibroblast growth factor-23 (FGF-23): implications for clinical studies. Clin Chim Acta, 2011. 412(11-12): p. 1008-11.
