lipopeptides
Cavalli, S.
Citation
Cavalli, S. (2007, January 25). Chemistry, structural insight and applications of β-sheet forming lipopeptides. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/9452
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/9452
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
Samenvatting
Het onderzoek beschreven in dit proefschrift, was gericht op het synthetiseren en het bepalen van de fysische eigenschappen van een nieuwe serie amfifiele lipopeptiden, ALPs (1a-c, Afbeelding 1). Deze moleculen zijn samengesteld uit een alternerende amfifiel oligopeptide keten, (Leu-Glu)n, gekoppeld via een succinyl groep aan het fosfolipide 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-fosfoethanolamine (DOPE).
Afbeelding 1. De structuur van de amfifiele lipopeptiden, ALPs (1a-c). Elk ALP bevat twee, drie of vier repeterende, Leu-Glu eenheden, aangeduid met respectievelijk tetra-, hexa- en octa-ALP.
De ALPs zijn zodanig ontworpen dat ze supramoleculaire assemblages kunnen vormen, door organisatie van het peptide gedeelte samengesteld uit “β-sheet” domeinen en hydrofobe interacties door het lipide gedeelte. De reeks van alternerende hydrofobe en hydrofiele aminozuren is gekozen om de juiste lengte van het peptide domein, welke nodig is voor een “β-sheet” secundaire structuur aan het lucht-water grensvlak te onderzoeken.
Vervolgens werd de toepassing van de ALP monolagen voor de nucleatie van calcium carbonaat gedemonstreerd en de zelf-assemblerende eigenschappen van de ALPs in waterige oplossing onderzocht.
In Hoofdstuk 1 worden de supramoleculaire assemblages van peptide en derivaten in het algemeen besproken. In Hoofdstuk 2 wordt een vaste-fase synthese strategie beschreven, gevolgd door een efficiënt zuiveringsprotocol voor de bereiding van zeer zuivere lipide-peptide conjugaten (tetra-ALP, hexa-ALP en octa-ALP). Structureel inzicht in de organisatie van de amfifiele lipopeptide monolagen op het lucht-water grensvlak werden verkregen middels oppervlaktespanning versus oppervlakte isothermen (π-A), Circular dichroism spectroscopie (CD), Fourier transformatie infrarood spectroscopie (FTIR) en Brewster angle microscopie (BAM) studies. In situ grazing-incidence röntgen diffractie (GIXD) metingen onthulden dat de lipopeptiden, met zes of acht aminozuur residuen, een nieuwe type twee-dimensionale zelf-organiserende monolagen vormden. Deze vertoonden β-sheet domeinen gedecoreerd met lipide staarten. De experimentele waarnemingen zijn
n
HN N H
NH2 O HO O
O O
O O O
O P O OH O
NH O
O 1 (a: n=2; b: n=3; c: n=4)
gerationaliseerd met in acht neming van het “hybride” karakter van het systeem. Zoals in de ontwerp fase was voorzien, werd het gedrag van de lipopeptide inderdaad sterk beïnvloed door de lengte van het oligopeptide deel, in het bijzonder bij film compressie. Het peptide domein van de tetra-ALP was te kort om een geordende structuur te vormen op het lucht- water grensvlak. Daarentegen vormden zowel hexa- als octa-ALPs stabiele β-sheet monolagen op het lucht-water grensvlak. Er waren geen verandering middels GIXD metingen in de β-sheet structuur van de hexa-ALP waargenomen tijdens de compressie van de monolaag. De organisatie van de octa-ALP veranderde wel als functie van de oppervlaktespanning (π); een afname van de afstand langs de β-streng lengterichting alsmede een uitgesproken verschil in de Bragg piek vorm, werd bij compressie waargenomen. Hieruit werd geconcludeerd dat octa-ALP beter deformeerbaar is dan het hexa-ALP. Het is mogelijk dat de β-sheet domeinen in de georganiseerde octa-ALPs, in vergelijking tot de hexa-ALPs, een hogere neiging hebben om te buigen of te verdraaien bij compressie. In het algemeen is het bekend uit de literatuur dat β-streng ketens een natuurlijke neiging hebben tot verwringen:
hoe langer het uitgelijnde peptide des te groter de structurele frustratie in de peptide ruggengraat. De octa-ALP monolaag breekt bij hoge oppervlaktespanning af en transformeert tot een geordende multi-laag structuur. Dit is het eerste systeem bestaande uit β-sheet assemblages, welke een duidelijk geordende multi-laag structuur vertoont. Waarschijnlijk wordt dit veroorzaakt door de stabiliserende bijdrage van de lipide staarten. De conclusies getrokken uit de experimentele bevindingen werden bevestigd door een representatief theoretisch model, gebaseerd op moleculaire dynamica (MD) simulaties van de octa-ALP op het vacuüm-water grensvlak. Hoofdstuk 3 beschrijft de toepassing van de ALP monolagen als goed gedefinieerde tweedimensionale moleculaire sjablonen voor de nucleatie van calciumcarbonaat. De invloed van de lengte van de peptide sequentie op de biomineralisatie werd onderzocht. Ter vergelijking werden de N-geacetyleerde peptide Ac-(Leu-Glu)4-NH2 en de fosfolipide 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Fosfoethanolamine (DOPE) ook bestudeerd. Er werd aangetoond dat hexa- en de octa-ALP stabiele monolagen vormden met anti-parallele β-sheet conformaties op een milli-Q water subfase, alsmede op Ca2+ waterige oplossingen. De introductie van het fosfolipide deel aan het octapeptide (Leu-Glu)4 motief versterkt het amfifiele gedrag van het molecuul en bovendien de flexibiliteit van de monolaag, zonder de
“β-sheet” structuur aan te tasten. Dit maakte het mogelijk om het effect van deze monolagen op de kristallisatie van calciumcarbonaat, alsmede de wisselwerking met de ontwikkelende minerale fase, te bestuderen. De formatie van een nieuwe morfologie van calciet werd waargenomen. Naast een kleine hoeveelheid eerder waargenomen piramidaal {01.l}
georiënteerde kristallen (l=1-2), kristalliseerde het merendeel van calcium carbonaat uit als
een nieuw type “indented” {10.0} georiënteerde calciet kristallen. De formatie van deze nieuwe morfologische vorm werd significant onderdrukt bij het gebruik van de N-geacetyleerde octapeptide. Tevens werden verschillende typen gemodificeerd calciet of slechts willekeurig groeiende kristallen onder de monolagen van het tetra-ALP en DOPE aangetoond. Een verklaring voor deze waarnemingen is dat met dit type ALPs de nucleatie van verschillende kristalvlakken kan worden bereikt, afhankelijk van het vermogen van het moleculaire sjabloon om zich aan te passen aan de structuur van de zicht ontwikkelende anorganische fase. Verder tonen deze resultaten aan, dat de rek van het moleculaire sjabloon in slechts één richting de heroriëntatie van de functionele groepen toestaat. Hierdoor kon de stabilisatie van verschillende kristalvlakken tot stand worden gebracht, zonder een epitaxiale relatie tussen de componenten. In Hoofdstuk 4 wordt het zelfassemblerende gedrag van de ALPs beschreven. In hoofdstuk 3 is aangetoond dat de monolagen van de ALPs als moleculaire sjabloon werken voor de mineralisatie van calciumcarbonaat. De bereiding van goed gedefineerde type aggregaten in oplossing zou kunnen leiden tot nieuwe sjablonen voor biomineralisatie in 3-D. Atomic Force Microscopie (AFM) studies toonden aan dat de octa-ALP multi-laag β-sheet achtige structuren op het lucht-water grensvlak vormden.
Vervolgens werd de zelfassemblage van octa-ALP in oplossing onderzocht. Tevens werden mengsels van octa-ALP en 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Fosfoethanolcholine (DOPC) in verschillende verhoudingen in waterige oplossingen bestudeerd. Vesiculaire aggregaten en vezel structuren werden gevonden in alle monsters. Met Circular Dichroism (CD) spectroscopie werd zichtbaar gemaakt dat deze aggregaten duidelijk een β-sheet structuur bevatten. Deze studie toont aan dat de vorming van goed gedefinieerde assemblages, met een eenduidige morfologie, moeilijk te bereiken was. Het amfifiele karakter en de neiging tot vorming van kristallijne β-sheet domeinen compliceerden waarschijnlijk het zelfassemblage proces. De complicaties die optraden bij de bereiding van lipide vesicles met β-sheet peptiden konden worden voorkomen door een gefunctionaliseerde lipide te gebruiken die reeds in voorgevormde liposomen was verwerkt en deze vervolgens direct op de oppervlakte te conjugeren met een (Leu-Glu)4 peptide motief. Een voorbeeld van deze aanpak is gegeven in Hoofdstuk 5. Een generieke methode voor de efficiënte in situ modificatie van liposomen, gebaseerd op koper(I)-gekatalyseerde [3+2] azide-alkyne cycloadditie (“klik” chemie) werd ontwikkeld. Fluorescentie Resonantie Energie Overdracht (FRET) studies met een model verbinding demonstreerde dat de reactie aan het oppervlak van een vesicle plaats heeft. Om dit te bereiken werden kleine unilamellaire lipide vesicles die eindstandige alkyne gemodificeerde lipiden bevatten zodanig geprepareerd dat de alkyne eindgroepen aan het oppervlak liggen. Ook werd een fluoricerende acceptor molecuul dat lissamine rhodamine
(LR) bevat gesynthetiseerd. Om het principe van de reactie aan te tonen werd een met azido- en fluorescerende groep gemodificeerd (N3-Lys(NBD)-NH2) gekoppeld aan het liposoom, gebruikmakend van een katalytische hoeveelheid CuBr. De donor 7-nitrobenzofurazan (NBD) werd via de “ klik” reactie gekoppeld in de nabijheid van de acceptor (DOPE-LR) gebracht waardoor energie overdracht (FRET) mogelijk werd. De alkyne groepen in het interne membraan van de liposomen namen niet deel aan de reactie.
Zodoende kon de energie overdracht alleen met de acceptor moleculen, beschikbaar aan de buitenste oppervlakte, plaatsvinden Gebaseerd op de waarneming dat er na dialyse een kleurverandering had plaatsgevonden, werd tevens een colorimetrische analyse ontwikkeld ten behoeve van het monitoren van de reactie. De reactie vond plaats bij kamertemperatuur en was binnen 4 uur voltooid. Het generieke karakter van deze werkwijze maakt het mogelijk om elke azido-gefunctionaliseerde peptide op eenvoudige wijze te conjugeren aan de buitenzijde van liposomen, gebruikmakend van een gelijksoortig protocol. Daarnaast kan NBD makkelijk worden geïntroduceerd om de reactie te volgen middels een colorimetrische analyse. In een ander voorbeeld werd de random coil tot β-sheet transitie voor het (Leu-Glu)4 motief geobserveerd via conjugatie aan de buitenzijde van de liposomen, gebruikmakend van het
“klik” chemie protocol. De efficiënte reactie tussen het peptide N3-(Leu-Glu)4-NH2 en het liposoom had geen invloed op de gemiddelde diameter van de vesicles. Hiermee werd de mogelijkheid aangetoond om het buitenste membraan van de liposoom te functionaliseren met oligopeptide ketens. Bovendien maakte de transitie van random coil naar β-sheet, het in situ volgen van de reactie met CD spectroscopie mogelijk. De vorming van het produkt was reeds na 15 minuten zichtbaar door de verandering in het CD signaal. De reactie verliep bij kamertemperatuur en bereikte reeds na 15 minuten een goede omzetting en was binnen 2 uur voltooid. Tenslotte werd de veelzijdigheid van deze benadering verder aangetoond door de bereiding van potentiele immunogene liposomen.. Toll-like receptor liganden (TLR7Ls) werden geconjugeerd aan het buitenste membraan van liposomen en de immunogeniteit werd bestudeerd. Initiële biologische testen toonden aan dat de immunogeniteit van één van de liganden (TLR7-L2) na conjugatie toenam. Deze resultaten duiden op een mogelijke verdere optimalisatie van de ligand eigenschappen (b.v. spacer lengte), welke zouden kunnen leiden tot de bereiding van krachtige synthetische liposoom-gebaseerde vaccins, gebruikmakend van het in dit hoofdstuk ontwikkelde “klik”chemie protocol. Ten slotte wordt in Hoofdstuk 6 de synthese van een gelipideerde Gramicidine S analoog via koper(I)-katalyseerde [3+2] azide-alkyne cycloadditie beschreven en werd de vorming van dit amfifiele molecuul om stabiele monolagen op het lucht-water grensvlak onderzocht. De lipidatie van het GS derivaat resulteerde inderdaad in een stabielere monolaag. Desondanks toonden
Grazing-incidence Röntgen Diffractie (GIXD) metingen van de monolaag op het lucht-water grensvlak aan dat gelipideerd GS geen geordende kristallijne domeinen vormde. In dit geval interfereerde de lipidatie van een amfifiele peptide wel de vorming van een georganiseerde monolaag. Dit in tegenstelling tot het niet gelipideerde GS derivaat, welke kristallijne structuren vormde op een waterige 0.14 mM NaCl oplossing. Monolagen van het gelipideerde GS analoog zouden als potentiële antimicrobiële oppervlakten kunnen fungeren. Hiertoe werd onderzocht of lipide gemodificeerde GS aan glas oppervlak hecht. De verkregen resultaten vormen een vooronderzoek naar de bereiding van gecoate oppervlakten met antimicrobiele werking.
