Synthesis and evaluation of peptide and nucleic acid based Toll-like receptor ligands
Weterings, J.J.
Citation
Weterings, J. J. (2008, November 27). Synthesis and evaluation of peptide and nucleic acid based Toll-like receptor ligands. Bio-organic Synthesis, Leiden Institute of Chemistry, Faculty of Science, Leiden University. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/13284
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/13284
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
131 Dit proefschrift beschrijft het ontwerp, de synthese en de immunologische evaluatie van liganden en conjugaten gericht op de activatie van Toll-like receptoren 2, 7 en 9 (TLRs 2, 7 en 9). De rol van de TLRs in het menselijk immuunsysteem wordt besproken in de inleiding van Hoofdstuk 1. Speciale aandacht is er voor enkele natuurlijke en synthetische liganden, die op dit moment bestudeerd worden en activiteit vertonen voor een van de elf tot nu toe ontdekte TLRs in het menselijk lichaam. Hoofdstuk 1 beschrijft een selectie van bekende natuurlijke en synthetische TLR liganden met focus op chemisch gedefinieerde structuren. In Hoofdstuk 2 wordt het ontwerp en de bereiding van een serie van nieuwe 7-hydro-8-oxo-adenines en hun TLR agonistische eigenschappen besproken. Bekende verbinding 1, een potente TLR7 agonist, vormt de basis voor deze studies en aangetoond wordt dat de introductie van azide bevattende zijketens op de 2-positie van het purine substraat (als in 2, een representatief voorbeeld, Figuur 1) derivaten geeft, die weliswaar minder actief zijn dan de voorloper, maar nog aanzienlijke TLR7 agonistische eigenschappen bezitten. De azide functionaliteit in derivaat 2 en zijn homologen, maken de ontwikkeling van nieuwe potentiële TLR7 conjugaten mogelijk.
NH2
O NH HN
O AA
23
H2N
O N
N N
O N N
NH N
NH2
O
O O
AA
n = DEVSGLEQLESIINFEKLAAAAAK 3
O N N
NH N
NH2
O
O O
N3
O N N
NH N
NH2
O O
1 2
Figuur 1
Samenvatting
Hoofdstuk 3 beschrijft het verlengen van verbinding 2 met een oligopeptide door middel van een koper gekatalyseerde [2+3] cyclo-additie reactie tot een serie van peptide epitoop-TLR7 ligand conjugaten (zie voor een representatief voorbeeld construct 3). Het bleek dat de antigen presentatie van het antigene peptide SIINFEKL in deze conjugaten verbeterd is in vergelijking met een mengsel van de afzonderlijke TLR7-L en het peptide, maar dat de TLR7 afhankelijke cytokine productie nihil was. Meerdere factoren kunnen aan de basis liggen van deze uitkomst. De literatuur beschrijft dat de optimale lengte van de C2-spacer in de TLR7-L vier tot zes atomen is. Als het peptide wordt beschouwd als onderdeel van deze spacer dan wordt deze lengte aanzienlijk overschreden. Ten tweede, kan aggregatie van het peptide conjugaat er voor zorgen dat het ligand na opname niet langer aan TLR7 kan binden. Ten derde, kan de opname van het construct onvoldoende zijn en zorgen voor een concentratie van het TLR7-L die te laag is om TLR7 activatie te veroorzaken. Ten vierde kan de positie van de covalente binding tussen het TLR7-L en het antigen de activatie verhinderen. Tenslotte, kan de aangebrachte stabiele covalente binding tussen de TLR7-L ligand en het antigen in het conjugaat de oorzaak zijn. Daarom bieden conjugaten, welke over de capaciteit beschikken om een cel binnen te dringen en vervolgens te dissociëren in de afzonderlijke TLR-L en het antigen een mogelijke oplossing. Op grond van bovengenoemde factoren kunnen nieuwe conjugaten worden ontworpen die het inzicht in TLR-7 activatie verhogen en een antwoord kunnen geven op de vraag of het mogelijk is om gemodificeerde 7-hydro-8-oxo-adenines in covalente conjugaten te gebruiken voor toepassing als synthetische vaccins.
133
CCATGACGTTCCTGACGT 5'
O 3'
P O S
O-
O N NH
O
O O
P O
S O- O
HO N
O
O P S -O
O 4
H
N DEVSG LEQLES IINFE S
N O
O
O HN
NH
O H N
O H O O
O
NH2+ SO3- SO3- H2N
COOH
O
O C15H31 O O C15H31
O S
N H
O C15H31
O
H N S KKKK
HN
O O H
N DEVSG LEQLES IINFEK L-OH S
N
O
O NH
O N N F B
F -
+
5
O C15H31 O O C15H31
O S
N H
O 2
C15H31 O
H N R'
6 1
O C15H31 O O C15H31
O S
N H
O 2
C15H31 O
H N R' 1
R S
7 6
5
Figuur 2
Hoofdstukken 4 en 5 beschrijven de synthese en evaluatie van verscheidene peptide-TLR-L conjugaten gebaseerd op het TLR9 ligand CpG (zie voor representatief voorbeeld, fluorescent derivaat 4, Figuur 2) en het TLR2 ligand Pam3Cys (representatief voorbeeld, structuur 5,).
Met deze constructen was het mogelijk de opname, de localisatie in de cel alsmede de effectiviteit van de antigen presentatie in combinatie met cytokine productie van deze conjugaten nader te bestuderen. Een belangrijke structuur-activiteit relatie wordt in meer detail in Hoofdstuk 5 besproken. De invloed van de stereochemie van het chirale glycerol koolstofatoom in Pam3Cys op de TLR2 binding en activatie werd onder de loep genomen.
Met behulp van verbindingen 6 en 7 (met R’ als het antigene peptide) werd aangetoond dat de niet-natuurlijke S-configuratie in construct 7 resulteerde in ongeveer dezelfde mate van antigen presentatie maar een minder effectieve cytokine productie dan verbinding 6.
Samenvatting
De resultaten besproken in Hoofdstuk 4 en 5 laten zien dat de opname, de TLR binding en de intracellulaire verwerking van deze conjugaten belangrijk zijn voor optimale cytokine productie en antigen presentatie. Met behulp van synthetische conjugaten zoals beschreven in dit proefschrift is het inzicht in deze processen verhoogd en is de basis gelegd voor het ontwerp en de synthese van meer geavanceerde conjugaten, die nodig zijn om fundamentele vragen ten aanzien van de betrokken immunologische processen te beantwoorden.
Samengevat, de gesynthetiseerde constructen, gericht op TLR2, 7 en 9 beschreven in dit proefschrift zijn een eerste stap naar de ontwikkeling van goed gedefinieerde vaccins die een gecontroleerde immuun respons opwekken door gebruik te maken van Toll like receptoren.
Vooraleer zulke vaccins toegepast kunnen worden zal nog veel onderzoek nodig zijn. De ontdekking van de TLR familie en zijn rol in de immuniteit, de mogelijkheid om goed gedefinieerde bioconjugaten te formuleren welke gericht zijn op TLRs en de voortdurende ontwikkeling van de synthetische methodologie maakt het denkbaar dat volledig synthetische vaccins in de nabije toekomst werkelijkheid worden. Verder onderzoek zal laten blijken of TLR2, 7 of 9 de juiste TLRs zijn om te gebruiken of dat andere familieleden onder de TLRs betere keuzes zijn, of dat combinaties van verschillende TLRs het meest effectief zijn.
Hetzelfde geldt natuurlijk ook voor de gekozen TLR liganden. De resultaten zoals besproken in dit proefschrift en voortkomend uit diverse literatuurbronnen laten zien dat een juist gekozen, covalente binding tussen een TLR-L en een antigeen peptide resulteert in een toename van zowel cytokine productie als antigen presentatie, de twee meest gewenste kenmerken in een synthetisch vaccin van dit type. Het is niet onwaarschijnlijk, dat toekomstige synthetische vaccins deze eigenschappen zullen delen.
