Physiological Consequences of protein translocation stress in Bacillus subtilis Bernal-Cabas, M.
DOI:
10.33612/diss.143818857
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2020
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Bernal-Cabas, M. (2020). Physiological Consequences of protein translocation stress in Bacillus subtilis. https://doi.org/10.33612/diss.143818857
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Chapter 8
Nederlandse samenvatting
Samenvatting
Bacillus subtilis is een fascinerende en veelzijdige bacterie die gekarakteriseerd wordt door
zijn robuustheid, het gemak waarmee hij genetisch veranderd kan worden, de afwezigheid van toxines, uitstekende fermentatie-eigenschappen en de grote hoeveelheden eiwit die hij in het kweekmedium kan uitscheiden1,2. Al deze eigenschappen hebben er toe geleid dat
B. subtilis een hoofdrol is gaan spelen in de productie van enzymen voor de voedsel-,
wasmiddel-, leer- en papierindustrie3. Enzymen die met behulp van B. subtilis en verwante
bacillen geproduceerd zijn vertegenwoordigen tegenwoordig meer dan 60% van de enzymenmarkt4. Door dit onbetwiste succes is B. subtilis een aantrekkelijk organisme
geworden voor de ontwikkeling van nieuwe hoogwaardige producten, waaronder geneesmiddelen, biosensoren en vaccins5. Voor deze doeleinden is het echter ook van belang
om nieuwe generaties ‘super-secreterende’ B. subtilis stammen te ontwikkelen die in staat zijn om grote hoeveelheden van complexe soortvreemde eiwitten uit te scheiden. Deze heterologe eiwitsecretie vormt een grote uitdaging voor de bacteriecel, aangezien dit proces aanzienlijk en op meerdere niveaus met het normale functioneren van de cel kan interfereren. Het oplossen van de fysiologische knelpunten die hierdoor ontstaan vergt een multidisciplinaire benadering6, die allereerst nodig is om de exacte problemen te identificeren
en vervolgens mogelijkheden biedt om de geïdentificeerde knelpunten op te lossen. Eén van deze knelpunten is de zogenaamde secretiestress-response, waarbij de bacterie zich verweert tegen de ‘onnatuurlijke’ productie van soortvreemde eiwitten7. Andere productieproblemen
kunnen gerelateerd zijn aan het onvermogen van dergelijke heterologe eiwitten om de cytoplasmamembraan te passeren ten gevolge van een verkeerde vouwing of hun afbraak gedurende het transportproces8,9. Het is derhalve van belang om nieuwe productiestammen
dusdanig aan te passen, dat met name de integriteit van de cytoplasmamembraan gewaarborgd blijft, zodat een zo hoog mogelijke eiwitopbrengst bereikt kan worden zonder interferentie met de groei en levensvatbaarheid van de eiwitproducerende bacteriecel. In dit opzicht vormde met name het gebrekkige inzicht in processen die zich in de membraan afspelen een belangrijk kennishiaat, met name doordat membraaneiwitten erg waterafstotend zijn en veelal in geringe hoeveelheden voorkomen, waardoor ze moeilijk te bestuderen en te kwantificeren zijn.
Zoals beschreven in Hoofdstuk 1 van dit proefschrift maakt B. subtilis met name gebruik van twee verschillende routes voor eiwittransport over de cytoplasmamembraan. De zogenaamde Sec-secretieroute maakt gebruik van een eiwittransportkanaal in de membraan, terwijl de Tat-route voor eiwittransport gebruik maakt van lokale membraanverzwakking10,11.
Beide transport scenario’s vormen een serieuze uitdaging voor een levende cel, aangezien de integriteit van de membraan gewaarborgd moet blijven om het verlies van ionen, nutriënten en andere belangrijke bestanddelen van de cel tegen te gaan. Om schade aan de membraan en de daaromheen gelegen celwand te voorkomen maakt B. subtilis gebruik van meerdere veiligheidsmechanismes die geactiveerd worden onder omstandigheden die aanleiding geven tot secretiestress. Hiertoe behoren de zogenaamde CssRS en LiaRS twee-componenten genregulatiesystemen. Het CssRS-systeem controleert de aanmaak van een ‘schoonmaakploeg’ in de cytoplasmamembraan, aangezien het de synthese van de HtrA- en HtrB-eiwitten reguleert. Deze eiwitten kunnen er voor zorgen, dat andere verkeerd gevouwen eiwitten afgebroken of opnieuw gevouwen worden. Deze secretiestressreactie is nauw verbonden met het Sec-systeem voor eiwittransport, waarbij eiwitten in een ontvouwen toestand via het SecYEG-transportkanaal door de cytoplasmamembraan getransporteerd worden12–14. Het LiaRS-systeem verzorgt daarentegen de bescherming tegen lekkage van de
cytoplasmamembraan. Dit systeem controleert de integriteit van de membraan en zorgt voor de aanmaak van de LiaI- en LiaH-eiwitten die eventuele membraanschade kunnen beperken door een soort van plug te vormen. Het LiaRS-systeem is in het verleden al eens geassocieerd met het transport van heterologe eiwitten13.
Het promotieonderzoek dat in dit proefschrift beschreven is had tot doel om een beter begrip te krijgen van de effecten van verhoogd eiwittransport via de Tat- en Sec-routes op de fysiologie van B. subtilis. De achterliggende gedachte hierbij was, dat gedetailleerde inzichten in de respectievelijke secretiestressreacties en de daarop volgende cellulaire aanpassingen wellicht nieuwe mogelijkheden zouden kunnen bieden voor de constructie van nieuwe B.
subtilis stammen die nog beter geschikt zijn voor eiwitsecretie dan de tot dusver beschikbare
stammen. Dienovereenkomstig hadden de experimenten beschreven in Hoofdstukken 2, 3, en 4 tot doel om de effecten van eiwittransport via de Tat-route op de fysiologie van B. subtilis te beschrijven. De experimenten beschreven in Hoofdstuk 5 hadden daarentegen tot doel om een procedure voor absolute membraaneiwitkwantificatie op te zetten. De resulterende methodiek werd vervolgens toegepast in de studies beschreven in Hoofdstuk 6, die tot doel
hadden om membraaneiwitten te kwantificeren in B. subtilis cellen die het IsaA-eiwit van
Staphylococcus aureus in hoge mate produceren. Bij aanvang van dit promotieonderzoek
waren de stressreacties die gekoppeld zijn aan Tat-gemedieerde eiwitsecretie in B. subtilis nog niet goed gedefinieerd. Verder was nog niet bekend hoe de integriteit en stabiliteit van de membraan gewaarborgd kunnen worden, terwijl het transport van veelal gevouwen eiwitten via de Tat-route een grote opening in de membraan vereist. Daarnaast was het onbekend of er nog andere eiwitten geassocieerd zijn met de Tat-route van B. subtilis, die sowieso al beschouwd wordt als het meest minimale Tat-systeem dat tot dusver bekend is. Om antwoorden op deze vragen te krijgen werd het Tat-systeem tot overexpressie gebracht met behulp van het zogenaamde SURE expressiesysteem15, hetgeen aanleiding gaf tot de
experimenten beschreven in Hoofdstukken 2 en 3.
Voor de experimenten beschreven in Hoofdstuk 2 werd gebruik gemaakt van verschillende technieken, waaronder eiwitchromatografie en massaspectrometrie. Op deze manier kon bepaald worden welke eiwitten interacties aangaan met de Tat-route. De verkregen resultaten lieten zien dat het LiaRS-systeem actief controleert in welke mate de Tat-route aangemaakt wordt in B. subtilis en dat eiwitcomponenten van de Tat-route een directe en specifieke interactie met het LiaH eiwit aangaan. Hieruit bleek dat de Tat-route niet zo ‘minimaal’ is als eerder werd aangenomen. Tevens werd aangetoond dat het LiaH-eiwit een actieve rol speelt bij het Tat-afhankelijke eiwittransport en bepalend is voor de mate en de efficiëntie, waarmee eiwitten zoals EfeB en QcrA over de cytoplasmamembraan getransporteerd worden. Een laatste opmerkelijke waarneming was dat het LiaRS-systeem in extreme mate reageert op aanpassingen van verhoogde expressie van de Tat-route in de membraan.
Voor het onderzoek beschreven in Hoofdstuk 3 werd gebruik gemaakt van de mogelijkheid om B. subtilis eiwitten te labelen met zware, niet-radioactieve isotopen die via massaspectrometrie gedetecteerd kunnen worden. Op grond hiervan kunnen de relatieve hoeveelheden van de gelabelde eiwitten onder verschillende omstandigheden gekwantificeerd worden. Deze methodiek werd vervolgens toegepast om de verschillende reacties van B. subtilis op verhoogde aanmaak van de Tat-route in kaart te brengen. De resultaten laten zien, dat overexpressie van de Tat-route zeer verschillende effecten heeft op de samenstelling van het cytoplasma, de cytoplasmamembraan en de eiwitsecretie. Deze effecten zijn bovendien heterogeen van aard, hetgeen suggereert dat de onderzochte B.
subtilis cultures verschillende bacteriële subpopulaties bevatten die zich toegelegd hebben
op verschillende processen16. Een belangrijke fysiologische consequentie van
Tat-overexpressie was de verhoogde aanmaak van de genregulator AbrB die bepalend is voor de overgang van de exponentiële naar de stationaire groeifase van de bacteriën. Het verhoogde niveau van AbrB kon inderdaad geassocieerd worden met een verlate stationaire groeifase en de daarmee gepaard gaande verlaagde niveaus van eiwitten die betrokken zijn bij groeifase-afhankelijke processen, zoals de vorming van biofilms, competentie en sporulatie. Daarnaast resulteerde overexpressie van de Tat-route in de activatie van het SigD-regulon, gekenmerkt door verhoogde niveaus van eiwitten betrokken bij de bacteriële motiliteit en chemotaxis. Met name de laatste waarneming suggereert dat cellen die de Tat-route tot overexpressie brengen meer energie consumeren en actief op zoek zijn naar nutriënten om in hun groei- en energiebehoeftes te voorzien. Dit idee werd ondersteund door de waarneming, dat de synthese van het aminozuur arginine in deze cellen verhoogd was en door experimenten die lieten zien dat de cellen met verhoogde Tat-niveaus betere groei vertoonden als arginine aan het kweekmedium werd toegevoegd. Dit impliceert dat de bacteriën arginine als koolstof- en energiebron benutten, maar het is ook denkbaar, dat dit aminozuur een andere rol vervult. Het zou namelijk ook kunnen zijn, dat arginine de eiwitvouwing voorafgaand aan de Tat-afhankelijke eiwitsecretie stimuleert. Deze laatste mogelijkheid dient in de toekomst verder onderzocht te worden. Verder is het van belang te vermelden dat de metabole labeling van
B. subtilis met zware isotopen liet zien dat overexpressie van de Tat-route niet alleen
resulteert in verhoogde aanmaak van het LiaH-eiwit, maar ook in verhoogde aanmaak van andere eiwitten die tot het LiaRS-regulon behoren, waaronder LiaR, LiaS and LiaF. In feite is gebleken, dat LiaRS-activatie één van de meest sterke fysiologische reacties op Tat-gemedieerd eiwittransport in B. subtilis vertegenwoordigt.
In tegenstelling tot de experimenten beschreven in Hoofdstukken 2 en 3, waarbij de Tat-route tot overexpressie werd gebracht, beschrijft Hoofdstuk 4 experimenten met B. subtilis cellen, waarin geen functionele Tat-route aanwezig was. Deze experimenten hadden tot doel om een beter begrip van de fysiologische rol van Tat-afhankelijk eiwittransport te verkrijgen. Eerder onderzoek had laten zien, dat bij afwezigheid van een functionele Tat-route, de export van het EfeB-eiwit resulteerde in een groeistop en de dood van de meeste bacteriecellen in een populatie17,18. De exacte oorzaken van de waargenomen celdood en het daaropvolgende
Hoofdstuk 4 laten zien dat de afwezigheid van het EfeB-eiwit onder deze condities leidt tot
een enorm sterke oxidatieve stressreactie. Dit kon met name ook geconcludeerd worden uit een sterke toename in de eiwitten die behoren tot de PerR- en SigB-regulons en die schade door oxidatieve stress tegengaan. Dit nieuwe inzicht sluit nauw aan bij de eerdere vondst, dat het EfeB-enzym Fe2+ omzet in Fe3+ ten koste van het schadelijke waterstofperoxide. Het ziet
er derhalve naar uit, dat de activiteit van EfeB aan de extra cytoplasmatische kant van de membraan van cruciaal belang is voor de levensvatbaarheid van de cel onder specifieke omstandigheden. De experimenten beschreven in Hoofdstuk 4 laten ook voor het eerst zien, dat de B. subtilis bacteriën zonder een functionele Tat-route aan het verhongeren zijn. Dit is zeer waarschijnlijk een negatieve consequentie van de zware oxidatieve stress die de Tat-deficiënte bacteriën ondergaan door hun onvermogen om EfeB uit te scheiden. Een onverwacht resultaat was dat EfeB in de herstelfase onafhankelijk van Tat uitgescheiden werd, waarschijnlijk via de Sec-route. In dit opzicht is het vermeldenswaardig dat de transcriptoom analyse van cellen in de herstelfase een verlaagde expressie van de genen voor haem-biosynthese liet zien. Het is daarom aannemelijk dat haem-deficiëntie een vertraagde vouwing van het EfeB-eiwit voorafgaand aan de membraantranslocatie veroorzaakt, waardoor dit eiwit een geschikt substraat is voor secretie via de Sec-route. Daarnaast lieten de resultaten zien dat het LiaH-eiwit in geringe mate geïnduceerd was in de herstelfase van de Tat-deficiënte bacteriën, hetgeen suggereert dat de afwezigheid van EfeB aanleiding gaf tot membraanschade die herkend werd door het LiaRS-systeem en gerepareerd werd met behulp van LiaH. Deze waarneming onderstreept het belang van het LiaRS-systeem voor de bescherming van de bacteriën tegen de schadelijke gevolgen van eiwitsecretie-stress, zoals beschreven in Hoofdstukken 2 en 3.
Een ander opmerkelijk resultaat beschreven in Hoofdstuk 4 was dat de Tat-deficiënte bacteriën arginine consumeren gedurende de lysis-fase. Daarentegen werden genen voor argininesynthese en opname sterk aangeschakeld gedurende de herstelfase. Zoals ook beschreven in Hoofdstuk 3 leidde de toevoeging van arginine aan het kweekmedium van de Tat-deficiënte bacteriën tot verbeterde groei en zelfs tot het voorkomen van de lysis-fase. Deze resultaten laten nog duidelijker zien hoe belangrijk arginine is voor de Tat-gemedieerde eiwitsecretie.
In tegenstelling tot de studies beschreven in Hoofdstukken 2-4, waarbij voornamelijk biochemische technieken, transcriptoomanalyses en methodes voor relatieve
eiwitkwantificatie toegepast werden, waren de studies beschreven in Hoofdstukken 5 en 6 gericht op de absolute kwantificatie van membraaneiwitten. In Hoofdstuk 5 wordt voor het eerst de absolute kwantificatie van membraaneiwitten in een levend organisme beschreven. Hiertoe werd een speciale proteoomanalyse gebruikt, waarbij bekende hoeveelheden van de zogenaamde UPS2-controle-eiwitten aan de monsters werden toegevoegd. Verder bevatten de monsters eiwitten die met behulp van een label, de zogenaamde SNAP-tag, reeds voor de analyse gekwantificeerd waren. Deze aanpak maakte het mogelijk om de absolute hoeveelheden van alle andere detecteerbare eiwitten in de monsters te bepalen. Daarnaast werd veel aandacht besteed aan de beste methodes om zo veel mogelijk membraaneiwitten in een optimale conditie voor de proteoomanalyse in handen te krijgen. Een belangrijke bevinding bij de evaluatie van deze nieuwe methode voor membraaneiwitkwantificatie was dat er geen voorkeur voor detectie en kwantificatie van membraaneiwitten met veel of weinig transmembraaneiwitten bleek te zijn. Bovendien bleek de methode te leiden tot de identificatie van veel meer membraaneiwitten dan tot dusver mogelijk was. Desondanks werd naar schatting slechts ~40% van het membraanproteoom geïdentificeerd. Dit betekent dat er nog verder aan de nieuwe methode gewerkt moet worden om de gevoeligheid te verhogen. Ondanks deze beperking kan de nieuwe methode voor membraaneiwitkwantificatie zoals beschreven in Hoofdstuk 5 helpen om een beter inzicht te krijgen in de veranderingen in het membraanproteoom die bijvoorbeeld plaats vinden als bacteriën eiwitsecretiestress ondervinden. Dit is geïllustreerd aan de hand van de experimenten beschreven in Hoofdstuk
6, waarbij de effecten van eiwitsecretiestress geanalyseerd werden in B. subtilis cellen die het
gesecreteerde stafylokkken-eiwit IsaA tot overexpressie brengen. Deze experimenten werden overigens niet met een normale B. subtilis stam uitgevoerd, maar met de gemodificeerde B.
subtilis stam IIG-Bs27-27-24, die ook wel de ‘midiBacillus’ genoemd omdat zijn genoom met
meer dan 30% is gereduceerd. Uit de resultaten kan geconcludeerd worden dat met de nieuwe methode meer dan 50% van het membraanproteoom van de midiBacillus detecteerbaar was. Daarnaast werden bepaalde membraaneiwitten in zeer geringe hoeveelheden gedetecteerd, hetgeen suggereert dat deze eiwitten slechts in een deel van de bacteriepopulatie aangemaakt werden. Deze waarneming, tezamen met de resultaten beschreven in Hoofdstukken 3 en 4, ondersteunen het idee dat verhoogde eiwitsecretie of de afwezigheid van een functionele eiwitsecretieroute kan leiden tot heterogeniteit in een bacteriepopulatie, waarbij verschillende cellen geheel verschillende eiwitrepertoires tot
expressie brengen19. Toekomstig onderzoek zou gericht moeten zijn op de identificatie en
analyse van de factoren die aanleiding geven tot een dergelijke heterogeniteit door de gedetailleerde karakterisering van de verschillen tussen IsaA-producerende en niet-producerende subpopulaties van de bacteriën. De verkregen inzichten zouden vervolgens benut kunnen worden om verbeterde productiestammen te construeren die minder expressieheterogeniteit vertonen.
Een interessant resultaat van de studies beschreven in Hoofdstuk 6 was dat het mogelijk bleek om de secretie van het IsaA-eiwit in het kweekmedium te kwantificeren. Dit liet zien dat de midiBacillus gemiddeld 2.41 moleculen IsaA per minuut via de Sec-route secreteert. Het bleek echter dat een aanzienlijke hoeveelheid IsaA zich in de membraan ophoopte (72 moleculen per cel), hetgeen suggereert dat de Sec-route mogelijk een beperkende factor is in de secretie van IsaA, net zoals in Hoofdstuk 2 aangetoond werd voor de Tat-route. Een alternatieve verklaring zou kunnen zijn dat het signaalpeptidaseniveau in de cellen te laag was om de grote hoeveelheid geproduceerd IsaA van de membraan los te maken. Het verdient daarom aanbeveling om te onderzoeken of overexpressie van de Sec-route en signaalpeptidases benut kan worden om de secretie van IsaA verder te verbeteren. Een andere waarneming die verder onderzoek verdient is dat de secretiestress-response van de cellen ten gevolge van IsaA-productie gekenmerkt werd door de aanmaak van veel eiwitten met een tot dusver onbekende functie. Het lijkt daarom zeer zinvol om de functies van deze eiwitten en hun mogelijke toepassing voor verdere stamverbetering nader te onderzoeken. Overigens werd ook in de IsaA-overproducerende cellen een extra aanmaak van het LiaH-eiwit waargenomen, hetgeen het belang van het LiaRS-systeem voor B. subtilis onder secretiestresscondities nog eens onderstreept.
Concluderende opmerkingen
De resultaten beschreven in dit proefschrift verschaffen nieuwe inzichten in de fysiologische reacties van de Bacillus subtilis bacterie op de aanmaak van heterologe eiwitten in grote hoeveelheden. In de eerste plaats werd aangetoond dat de Tat-route voor eiwitsecretie een directe interactie aangaat met het stresseiwit LiaH. Het LiaH-eiwit bleek bovendien van belang te zijn voor de Tat-gemedieerde eiwitsecretie. Waarschijnlijk heeft dit te maken met de noodzaak om de membraan te stabiliseren, zodat de Tat-machinerie in staat is om volledig gevouwen eiwitten de membraan te laten passeren zonder nadelige gevolgen voor de cel. De
opgehelderd te worden. Waarschijnlijk kan de waargenomen interactie tussen LiaH en het Tat-systeem ook benut worden in toekomstig onderzoek dat gericht is op een beter begrip van de verschillende stappen in het Tat-gemedieerde eiwittransport. Verder laten de resultaten van het onderzoek duidelijk zien hoe belangrijk het Tat-systeem is voor het voorkomen van oxidatieve membraanschade. Een grote verrassing was dat het aminozuur arginine een belangrijke rol bij Tat-gemedieerde eiwitsecretie blijkt te spelen, hetgeen verwijst naar een mogelijk belangrijk verband tussen het cellulaire metabolisme en eiwittransport. Wellicht kan deze waarneming ook helpen bij het vinden van een manier om heterologe eiwitsecretie via de Tat-route van B. subtilis mogelijk te maken. In dit opzicht zou de beschikbaarheid van arginine wel eens een beperkende factor in de Tat-gemedieerde eiwitsecretie kunnen zijn. Tenslotte heeft het onderzoek beschreven in dit proefschrift geleid tot een nieuwe methode voor de absolute kwantificatie van het membraanproteoom van B.
subtilis. Deze mijlpaal in het onderzoek maakte verschillende consequenties van
Sec-gemedieerde secretie van een heteroloog eiwit voor de fysiologie van de B. subtilis membraan zichtbaar. De nieuwe methode kan nu ook ingezet worden om beter inzicht te krijgen in de verschillende aspecten van de eiwitsecretiestress-response in de B. subtilis bacterie. Met de verkregen kwantitatieve data is het wellicht mogelijk om in de toekomst voorspellende wiskundige modellen op te stellen die toegepast kunnen worden om contraproductieve stressreacties van de bacterie tegen te gaan20.
Referenties
1. Harwood, C. R. Bacillus subtilis and its relatives: molecular biological and industrial workhorses. Trends Biotechnol. 10, 247–256 (1992).
2. van Dijl, J. M. & Hecker, M. Bacillus subtilis: from soil bacterium to super-secreting cell factory. Microb. Cell Fact. 12, 3 (2013).
3. Schallmey, M., Singh, A. & Ward, O. P. Developments in the use of Bacillus species for industrial production. Can. J. Microbiol. 50, 1–17 (2004).
4. Westers, L., Westers, H. & Quax, W. J. Bacillus subtilis as cell factory for pharmaceutical proteins: A biotechnological approach to optimize the host organism. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1694, 299–310 (2004).
5. Gu, Y. et al. Advances and prospects of Bacillus subtilis cellular factories: From rational design to industrial applications. Metab. Eng. 50, 109–121 (2018).
6. Liu, Y., Li, J., Du, G., Chen, J. & Liu, L. Metabolic engineering of Bacillus subtilis fueled by systems biology: Recent advances and future directions. Biotechnol. Adv. 35, 20–30 (2017).
7. Bolhuis, A. et al. Evaluation of bottlenecks in the late stages of protein secretion in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 65, 2934–2941 (1999).
8. Molière N, Turgay K. General and regulatory protein in Bacillus subtilis. in Regulated Proteolysis in Microorganisms (ed. Dougan, D.). 66, 73–104 (Springer, 2013).
9. Li, W., Zhou, X. & Lu, P. Bottlenecks in the expression and secretion of heterologous proteins in Bacillus subtilis. Res. Microbiol. 155, 605–610 (2004).
10. Tsirigotaki, A., De Geyter, J., Šoštarić, N., Economou, A. & Karamanou, S. Protein export through the bacterial Sec pathway. Nat. Rev. Microbiol. 15, 21–36 (2017).
11. Hou, B., Heidrich, E. S., Mehner-Breitfeld, D. & Brüser, T. The TatA component of the twin-arginine translocation system locally weakens the cytoplasmic membrane of Escherichia coli upon protein substrate binding. J. Biol. Chem. 293, 7592–7605 (2018).
12. Lulko, A. T. et al. Production and secretion stress caused by overexpression of heterologous α-amylase leads to inhibition of sporulation and a prolonged motile phase in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5354–5362 (2007).
13. Hyyryläinen, H. L., Sarvas, M. & Kontinen, V. P. Transcriptome analysis of the secretion stress response of Bacillus subtilis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 67, 389–396 (2005).
14. Hyyryläinen, H. L. et al. A novel two-component regulatory system in Bacillus subtilis for the survival of severe secretion stress. Mol. Microbiol. 41, 1159–1172 (2001).
15. Bongers, R. S., Veening, J.-W., Van Wieringen, M., Kuipers, O. P. & Kleerebezem, M. Development and Characterization of a Subtilin-Regulated Expression System in Bacillus subtilis: Strict Control of Gene Expression by Addition of Subtilin. Appl. Environ. Microbiol. 71, 8818–8824 (2005).
16. McDonald, C., Jovanovic, G., Ces, O. & Buck, M. Membrane stored curvature elastic stress modulates recruitment of maintenance proteins PspA and VIPP1. MBio 6, 1–10 (2015).
3083–3094 (2005).
18. Miethke, M., Monteferrante, C. G., Marahiel, M. A. & van Dijl, J. M. The Bacillus subtilis EfeUOB transporter is essential for high-affinity acquisition of ferrous and ferric iron. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1833, 2267–2278 (2013).
19. van der Ploeg, R. et al. High-salinity growth conditions promote tat-independent secretion of tat substrates in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7733–7744 (2012).
20. Dubnau, D. & Losick, R. Bistability in bacteria. Mol. Microbiol. 61, 564–572 (2006).
21. Veening, J. et al. Transient heterogeneity in extracellular protease production by Bacillus subtilis. Mol. Syst. Biol. 4, 184 (2008).
22. Ploss, T. N. et al. Homogeneity and heterogeneity in amylase production by Bacillus subtilis under different growth conditions. Microb. Cell Fact. 15, 57 (2016).
23. Westers, H. et al. The Bacillus secretion stress response is an indicator for α-amylase production levels. Lett. Appl. Microbiol. 39, 65–73 (2004).
