University of Groningen
Nature-inspired molecules containing multiple electrophilic positions
Dockerty, Paul Jacques
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2018
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Dockerty, P. J. (2018). Nature-inspired molecules containing multiple electrophilic positions: Synthesis and application as activity-based probes and inhibitors. University of Groningen.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Technieken in het veld van de chemische biologie maken het mogelijk om biologische processen op moleculair niveau te begrijpen. Een veel gebruikte techniek zijn chemische probes. Dit zogenaamde moleculaire gereedschap maakt het mogelijk om een specifiek biomolecuul in de context van een cel of een organisme te visualiseren. Voor de ontwikkeling van deze probes wordt vaak inspiratie gezocht in secundaire metabolieten, aangezien dergelijke verbindingen meestal specifieke interacties aangaan met biomoleculen. Brabantamides, een groep verbindingen die voor het eerst werd geïsoleerd uit Pseudomonas fluorescens extracten, trok onze aandacht. Brabantamide A en versimpelde (semi)synthetische derivaten1 remmen het
enzym lipoproteïne geassocieerd phospholipase A2 (Lp-PLA2), een categorie
VII phospholipase A2 dat behoort tot de serine hydrolases familie.
Brabantamide A remt ook de groei van bacteriën en (water)schimmels en verhoogt phospholipase D activiteit in oömyceten.1-7 Deze interessante
eigenschappen en het feit dat Brabantamides twee reactieve centra (een carbamaat en een α,β onverzadigde amide) bevat, motiveerde ons om de interacties tussen deze verbindingen en eiwitten te bestuderen. Gezien de structuur is het aannemelijk dat Brabantamides covalent binden aan eiwitten en daarom hebben we chemische probes ontworpen die gebruikt kunnen worden om eiwitten die binden aan Brabantamides te identificeren en te visualiseren.
In hoofdstuk 2 staat de synthese van een aantal enol carbamaten met een gevarieerd substitutiepatroon beschreven. Het effect van het substitutiepatroon op de antibacteriële eigenschappen tegen Bacillus subtilis en Streptococcus pneumoniae werd bestudeerd. Zowel de bicyclische structuur als de dodecylstaart bleken essentieel te zijn voor de antibacteriële eigenschappen. Verder wezen deze studies uit dat de verbindingen bacteriën lyseren door de peptidoglycaan synthese te remmen. Met behulp van een competitie experiment met het fluorescent penicilline derivaat, Bocillin-FL werd aangetoond dat penicilline-bindend eiwit 4 een van de eiwitten in Bacillus subtilis is die geremd wordt door enol carbamaten. Doordat het mechanisme van deze antibacteriële verbindingen nu beter wordt begrepen, kan de activiteit van de verbinding verbeterd worden.
Hoofdstuk 3 beschrijft de synthese van een eerste groep chemische probes
gebaseerd op het brabantamide molecuul. Met deze moleculen werden de eiwitten die binden aan enol carbamaten gekarakteriseerd in A549 cellen. Er werd aangetoond dat de probes PJD2d en PJD224 binden aan een reactief cysteïne residu in de aldehyde dehydrogenase 1A1 (ALDH1A1, ook bekend als RALDH1) en 3A1 (ALDH1A3). Deze enzymen behoren tot de aldehyde
dehydrogenase familie. Competitie experimenten met bekende remmers (disulfiram en iodoacetamide) bevestigden dat de probes een cysteïne modificeren. Zowel in de A549 kanker cellijn als in HEK cellen die RALDH1, RALDH2 en RALDH3 tot overexpressie brengen vertoonden de verbindingen selectiviteit voor RALDH1. Verhoogde expressie van RALDH1 hangt vaak samen met een verslechterde prognose in kanker. Bovendien speelt RALDH1 een rol in resistentie tegen kanker geneesmiddelen. Het breekt bijvoorbeeld cyclophosphamide en oxaphosphorines af. De chemische probes beschreven in dit hoofdstuk kunnen daarom dienen als hulpmiddel om deze enzymen te bestuderen en in de verre toekomst eventueel ook zorgen voor/helpen bij de ontwikkeling van medicijnen en nieuwe diagnostische technieken in kankeronderzoek. In hoofdstuk 4 werd onderzocht of serine hydrolases ook reageren met de enol cyclocarbamaat. Gezuiverde enzymen (Lp-PLA2 en Bacillus subtilis
esterase) en cellysaten van Bacillus subtilis en A549 werden gereageerd met de verbindingen die beschreven zijn in hoofdstuk 2 en 3. Deze studies toonde aan dat gezuiverde serine hydrolases binden aan deze PJD120 en
PJD224. PJD224 bleek een geschikt hulpmiddel te zijn om de remming van
Lp-PLA2 door carbamaat bevattende moleculen te bestuderen. De verkregen
resultaten tonen aan dat een hydrofobe onvertakte alkaanstaart essentieel is om het enzym (Lp-PLA2) efficiënt te remmen. Uit competitie experimenten
met Fp-rhodamine en Fp-biotin, chemische probes die een breed spectrum aan serine hydrolases binden, bleek dat enol carbamaten ook in cellysaten binden aan serine hydrolases. Met behulp van Fp-biotin werden de eiwitten die binden aan de verbindingen beschreven in hoofdstuk 2 geidentificeerd.
Hoofdstuk 5 beschrijft een NMR studie naar de reactiviteit van de twee elektrofiele centra (het carbamaat en de Michael acceptor) van enol carbamaten. Deze studie onderstreept de veelzijdigheid van deze klasse van verbindingen. De NMR experimenten met het model substraat bevestigde dat thiolen, amines en alcoholen op verschillende manieren reageren met het molecuul. Thiolen reageren met de Michael acceptor. Na de 1,4 additie reactie kan ofwel CO2 ofwel het thiol vertrekken via een retro Michael
reactie. Dit leidt respectievelijk tot het gedecarboxyleerde thiofenol product en tot isomerisatie van de dubbele binding. Alcoholen en amines blijken te reageren met de carbamaat groep. Aanval van het nucleofiel wordt gevolgd door ringopening, waarbij afhankelijk van het nucleofiel een urea of een nieuw carbamaat ontstaan. Het initiële product van de amine additie reactie bleek verder te reageren tijdens het opwerken van de reactie tot het bicyclische urea product. De studie toonde de reactiviteit van enol
carbamaten aan. Deze informatie werd vervolgens gebruikt voor het ontwerpen van nieuwe verbindingen met een aangepaste reactiviteit, zoals de vinyl sulfon bevattende probes VDG30 en VDG33, esters PJD243 en
PJD252 en de monocyclische derivaten PJD251 en PJD253. VDG30 en VDG33 reageert voornamelijk met RALDH1. Ester probe PJD253 bindt niet
aan RALDH1. Daarentegen reageert deze verbinding redelijk selectief met twee andere eiwitten, vermoedelijk serine hydrolases, en de identificatie van deze twee doelwitten zou nieuwe toepassingen van deze verbinding kunnen betekenen.
Het onderzoek in dit proefschrift laat zien dat enol carbamaten in eiwitten reageren met zowel cysteine als serine residuen en dat het substitutiepatroon de selectiviteit bepaalt. Het onderzoek vormt de basis voor de ontwikkeling van nieuwe derivaten met een verbeterde biologische eigenschappen.
References
(1) Pinto, I. L.; Boyd, H. F.; Hickey, D. M. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2000, 10 (17), 2015.
(2) Schmidt, Y.; van der Voort, M.; Crüsemann, M.; Piel, J.; Josten, M.; Sahl, H.-G.; Miess, H.; Raaijmakers, J. M.; Gross, H. ChemBioChem 2014, 15 (2), 259.
(3) Schmidt, Y. 2013, Ph.D. thesis, University of Bonn.
(4) Reder-Christ, K.; Schmidt, Y.; Dörr, M.; Sahl, H.-G.; Josten, M.; Raaijmakers, J. M.; Gross, H.; Bendas, G. BBA - Biomembranes 2012, 1818 (3), 566.
(5) Thirkettle, J.; Alvarez, E.; Boyd, H.; Brown, M.; Diez, E.; Hueso, J.; Elson, S.; Fulston, M.; Gershater, C.; Morata, M. L.; Perez, P.; Ready, S.; Sanchez-Puelles, J. M.; Sheridan, R.; Stefanska, A.; Warr, S. The Journal of Antibiotics 2000, 53 (7), 664.
(6) Busby, D. J.; Copley, R. C. B.; Hueso, J. A.; Readshaw, S. A.; Rivera, A. The Journal of
Antibiotics 2000, 53 (7), 670.
