Isotachoforesa
Citation for published version (APA):
Everaerts, F. M. (1973). Isotachoforesa. Chemicke Listy, 67, 9-18.
Document status and date: Published: 01/01/1973
Document Version:
Publisher’s PDF, also known as Version of Record (includes final page, issue and volume numbers)
Please check the document version of this publication:
• A submitted manuscript is the version of the article upon submission and before peer-review. There can be important differences between the submitted version and the official published version of record. People interested in the research are advised to contact the author for the final version of the publication, or visit the DOI to the publisher's website.
• The final author version and the galley proof are versions of the publication after peer review.
• The final published version features the final layout of the paper including the volume, issue and page numbers.
Link to publication
General rights
Copyright and moral rights for the publications made accessible in the public portal are retained by the authors and/or other copyright owners and it is a condition of accessing publications that users recognise and abide by the legal requirements associated with these rights. • Users may download and print one copy of any publication from the public portal for the purpose of private study or research. • You may not further distribute the material or use it for any profit-making activity or commercial gain
• You may freely distribute the URL identifying the publication in the public portal.
If the publication is distributed under the terms of Article 25fa of the Dutch Copyright Act, indicated by the “Taverne” license above, please follow below link for the End User Agreement:
www.tue.nl/taverne Take down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us at: openaccess@tue.nl
providing details and we will investigate your claim.
F. M. EVERAERTS
Department of Instrumental Analysis, University of Technology, Eindhoven, Holland
ISOTACHOFORESA
*
This article is devoted to a new modern analytical technique isotachophoresis which is an electrophoretic technique with free moving zone boundaries. During an isotachophoretic analysis the ionic components of the sample are separated in consequence of different effective or net mobilities. The result of the separation is an equilibrium state in which all ions move with the same speed, individually separated into a number of conseeutive zones of pure components in immediate contact with each other, and arranged in the order of their mobilities. In the article the instrumentation for the performanee of this technique in capillaries is described, as well as the detection by means of thermocouples. Using this instrumentation analyses of ionic com· ponents may be carried out very rapidly both in aqueous and in non-aqueous medium.
Podobne jako V chromatografii lze V e1ektroforese rozlisit tri zakladni techniky: Zondlni elektroforesa (zone electrophoresis) a ji pfibuzne techniky, ktere mohou bYt pl'irovmlv{my k elueni technice v chromatografii.
Volnd elektroforesa (Tiselius free boundary electrophoresis) je frontalni technika. Tato technika byla prvni d-ukladneji propracovanou technikou.
Isotachoforesa (isotachophoresis, displacement electrophoresis) m-uze bYt pri-rovnavlma k vytesnovaci technice.
Obr. 1. Schema elektroforeticke aparatury A anodovy prostor, B termostat,
C davkovaci kohout, D katodovy prostor,
E integralni termoclanek, F diferencni termocl{mek
PredloZemi prace pojednava 0 posledne zminene technice. Rovnez uvedena
instru-mentace byla vyvinuta pro isotachoforesu, i kdyz ji lze pouZit pro vsechny tIi jiZ zminene techniky.
Schema elektroforeticke aparatury je na ohr. 1. Zak1adem teto aparatury je tenko-stenna trubice 0 male svetlosti, kapihira, vyrobena ze skla, teflonu nebo jine vhodne '" Pl'edneseno na 3. mezinarodnfm symposium 0 vyuZit! plynove chromatografie a podobnych technik v ropnem pri'unyslu 19-21. 5. 1971 v Bratislave.
umele hmoty. Svetlost kapilary volfme podle koncetraci pouZitjch elektrolytil, veIikosti uZivanych proudu a tepioty prostredi obklopujiciho kapilaru. Pn dale uvedenych experimentech byly pouZivany kapilary 0 vnitfuim priimeru 0,4-0,6 mm
a vnejsim prumeru 0,65-0,8 mm. Delku kapihiry urcuje vlastni separaeni problem, kde zakladnim po.zadavkem je d6lka dostatecna pro separaci dvojice nejobtimeji separovatelnyeh iontu. Pro deleni proteinu staCi na pfikiad 10 em, u slabych kyselin nebo kovu je potreba 0,5 -1 m, neni-li pouZito protiproudneho elektrolytu (counter-flow of electrolyte)1 a lisi-Ii se pohyblivosti delenych komponent asi 0 4% 2. Kapilara je pnpojena ke dvema nAdobkam, ktere funguji jako katodovY a anodovY prostor. Mezi anodovYm a katodovYm prostorem jsou umisteny dva Ctyrcestne kohouty, slouZici pro vmiseni vzorku v pripade analysy kationtu nebo aniontu. V pfipade, Ze se ma provAdet isotachoforesa aniontu, postupuje se nasledujicim zpusobem:
- AnodovY prostor a kapihira se naplni elektrolytem, jehoz anion je velmi pohyblivY a kation je soueasti pufru. Tento elektrolyt se nazY'va vedouci elektrolyt (leading electrolyte). Anion vedouciho elektrolytu must mit vetsi efektivni pohyblivost neZ maji vsechny ostatni anionty ve vzorku.
- KatodovY prostor obsahuje elektrolyt, jehoz anion ma efektivni pohyblivost mensi nez vsechny ostatni slozky analysovane smesi. Tento elektrolyt se nazY'va zakoncujici elektrolyt (terminating electrolyte) a jeho anion se nazY'va terminator. Hodnota pH zakoneujiciho elektrolytu musi by! 0 neco niZsi nez pH vedouciho
elek-trolytu, aby nepnspival navie k vodivosti iontu OH-. Hodnota pK aniontu slouZlcich jako terminator musi by! vetsi nez pK aniontu vzorku a vedouciho elektrolytu. Tim se zabraiiuje tomu, aby vznikaly stabilni smesne zony, anebo v horsich pfipadech, aby doeMzelo ike ztratam materiruu3
•
- Vzorek je vnesen davkovacim kohoutem mezi vedouci a zakoncujici elektrolyt. - Na anodu a katodu se vloZi napeti a systemem zaene procMzet elektricky proud. Vseehny ionty se pohybuji vlivem elektrickeho pole smerem k odpovidajieim elektro-dam. Elektroendoosmosu uvnitf kapilary vlivem potencia]u , Ize zanedbat. lako zabrana proti hydrodynamickemu toku slouZi membrana4
, jez bude zminena poz-deji.
JestliZe jsou separovany male ionty, neni treba uZivat polymeru nebo jineho stabi-lizaCniho materialu, nebot' kapilara samotna ma stabilisacni schopnosti. PrUbeh popsaneho proeesu je na obr. 2. Nahore, v prvni casti obrazku, je videt vedouci elektrolyt, vzorek a zakoncujici elektrolyt. Na svisle ose je udavana koncentrace a na vodorovne ose poloha uvnitr kapilary. Jednotlive casti obrazku smerem dolu zmi-zoriiuji stay separace v urcitych CasovYch intervalech. Na druM casti je videt, Ze zona vedouciho elektrolytu se posunula 0 neco smerem do kapilary. Koncentrace B se jiZ
upravila na hodnotu, ktera odpovida podle Kohlrauschova vztahu koncentraci vedouciho elektrolytu. Koncentraci B v teto zone lze spoCitat je-li znama koncentrace vedouci zony a hodnoty pohyblivosti a pK jak vedouci tak i zony B5. Smerem dozadu lze videt, Ze smesna zona B a C ma koncentraci jiz take upravenu vzhledem k zone, jez ji pi'edchazi. Koncentrace zon za vzorkem jsou upravene vzhledem ke
koncentraei vzorku samotneho. TIeti cast obnlzku ukazuje dalsi stav separace. Lze zretelne videt, Ze zona Ciste hitky B se zvetsila. Dale vznikla zona ciste Hitky C o koncentraei upravene na predchazejici smesnou zonu. Jak vypadaji tyto jevy pri detekei Ize videt na obr. 5. etvrta cast obrazku 2 predstavuje rovnovamy stay.
Dbr. 2. Priiooh separace behem isotachoforeticke analysy
Kazdou zonu uvnitr kapilary tvon jediny druh iontfi a koncentrace v teehto zonact jsou v rovnovaze s koneentraci vedouciho eIektroIytu. PH konstantnim prfimeru kapilary a slozeni vedouciho elektrolytu se delky jednotlivyeh zon jiz dale nemeni.
Pfi praktiekem provadeni analysy muze doehazet k naruseni zon nekterymi mene vyznamnymi faktory, napr. zmenami pH v dfisledku membranovych neb elektrodo-vjeh reakci, zmenami teploty, pronikanim CO2 teflonovou stenou kapilary, elektro-endoosmosou a hydrodynamickjm tokem (zejmena u protiproudnych experimentd).
Po dosaZeni rovnovameho stavu a pH konstantnim elektriekem proudu se vsechny zony pohybuji stejnou rychlosti. Tomu odpovida nazev isotachoforesa, coz znamena elektroforesa, pH niZ se vsechny zony pohybuji stejnou rychlosti. V zone zakoncuji-ciho elektrolytu se za predpokladu idealnich podminek koncentrace nemeni. Souhr-nem Ize nei, Ze isotachoforesa je frontalni technika s volne pohyblivjmi hranicemi zon, jejimz vJsledkem je rovnovamy stay, kdy vseehny zony se pohybuji stejnou rychlosti. Zony m'isleduji tesne jedna druhou, nebol za vsech podminek musi by! spI-nena podminka elektroneutrality. Pohyb opacne nabitych iontu smerem k odpovi-dajici elektrode je nutno kompensovat elektricky.
VzhIedem k tomu, Ze vsechny zony se pohybuji stejnou rychlosti a zarovenjednotli-ve druhy iontu maji rfiZne efektivni pohyblivosti, ma kazda zona svfij vIastni
ciruni gradient, ktery ji udiIi stejnou ryehlost. Potenciruni gradient v kazde jednotlive zone je konstantni, ale vzrusta do jedne zony ke druM. Pri'lbeh potencialu pri pohybu zon iontu Ai a Az je znazornen na obr. 3. Vseehny zony jsou serazeny podle svych
efektivnieh pohyblivosti. Prirustek potencialniho gradientu v sobe automatieky zahr-nuje sniZeni koncentraee prislusneho druhu iontu v uvazovane zone. Tuto koneen-traci Ize, jak jii bylo reCeno di'ive, vypocitat. Hranice zon pfi teto teehniee jsou podi-vuhodne ostr6. Jestlize napr. ion A z proniknedo zony A1, bude se v teto zone
pohy-v
c m _
Obr. 3. Prubeh potenchllu na hranici dvou zon V kapiUirni trubici, kde ion A2 vytesD.uje ion A! rozhrani 23,4 23,2
.
li~ o -2····-'---~J-···f
em Obr. 4. Koncentracni a teplotni profil na hranici zony.A koncentracni profil, B teoreticky teplotni profil, C skutecny teplotni profil
bovat pomaleji, neboe potenciruni spad uvnitr zony At je mensi nei v zone A2. To znamena, Ze ryehlost A2 je potom mensi nei ryehlost zon a ion A2 se automatieky vraH do sve viastni zony. Na druM strane, jestliie se ion At dostane difusi do zony A2 , bude vracen do sve vlastni zony vyssim poteneirunim gradientem.
Je-Ii behem analysy udrZovan konstantni proud, potom v dusledku riiznyeh poteneirunieh gradientu maji jednotlive zony ruzne tepioty. Je-li na kapilaru upevnen termoclanek z tenkyeh dnitu6
, signruy poskytovane timto termoclankem eharak-terizuji zony. Tento pripad lze videt na obr. 4. Derivovanim teehto signruu elektro-nieky nebo uZitim diferencniho termoclanku6 mohou byt takto velmi lehce urcovAny hranice jednotlivyeh zon. I kdyi isotachoforegram vypada podobne jako chromato-gram, jeho interpretace je zcela odlisna. Vysky vln jsou zde zdrojem informaci o druhu iontn (kvalitativni informaee), zatimco vzdalenost mezi vlnami udava delku zony a tim i informaci 0 mnoistvi daneho iontu v systemu (kvantitativni informace).
Detekce termoclAnkem je metodou universalni, ale jeji rozlisovaci schopnost je mala, coz vypl9va ze srovnani koncentracniho a teplotniho profilu na hranici zony, viz obr. 4. Avsak nehlede na to, pokud nejsou mnozstvi ve vzorku priIis mala,je detekce
termochinkem dostacujici, abycbom mohli dany system studovat. Kbmponenty pntomne ve vzorku musi byt radove Jlg. Na obr. 5 je skutecny elektroforegram sepa-race dusicnanu, mravencanu a octanu. Vedoucim elektrolytem je Tris-jodid a jako terminator je uzit fosforecnan. Prvni detekce byla provedena po 15 cm, druha potom
Obr. 5. Isotachoforegram smesi dusicnanit, mravenc;anu a octanu. Vedoucim elektrolytem je Tris-jodid, termimitorem je fosforec;nan
signiJI 1
~
.C{"!
.. Er J" iObr. 6. Isotachoforegram smesi halidil Kyselina mravenc;i byla pridanajako referentni latka
po 30 cm od startu. DifereneiaIni zaznam byl proveden diferencnim termoclankem, ktery je upevnen 30 em od startu. Cas analysy byl 30 minut a bodnota stabilisovanebo proudu 70 JlA. Na tomto obrazku je jasne videt, jak smesna zona detegovana po 15 em bebem daBieb 15 em zmizi. Na obr. 6. je separace balidu, k nimz byla pridana kyselina mravenci jako referentni latka. Z yYsky vIn teto zname latky a z vysek ostatnicb vin lze potom identifikovat ostatni pritomne ionty.
Obr. 7. Zavislost pohyblivosti nekterych kyselin na pH
70
~
pH {) Nekdy byvfi diference v efektivnieb pobyblivostecb analysovanycb lfitek pnlis mala, aby se upine rozdelily na dane 1 m dloub6 kapilare. Neni-Ii k disposiei zafizeni s protiproudnym systemem je pro separaci nutne vybrat jiny pufrovaci system. Na obr. 7. jsou pobyblivosti nekterycb kyselin jako funkce pH. Hodnoty v zavorkficb
udavaji pH zon. Pfi neutraInim pH se fosforecnan bude pohybovat peed mIecnanem a obe kyseliny Ire lehce separovat. Pfi pH v rozmezi 4-6 bude mIecnan putovat pfed fosforecnanem. Pri pH
=
4 Ire ocekavat stabiIni smesnou zonu. Pri pH niz~imObr. 8. Vztah mezi vyskami vIn a teoretickymi vodivostmi
signal
I
Obr. 10. Isotachoforegram smesi kationtii (viz obr. 9) v prostl'edi methanolu
Na+
- e - - -cas
Obr. 9. Isotachoforegram smesi kationtii ve vodnem prostredi
signal
f
Obr. 11. Isotachoforegram smesi obsahujici OH- v prostfedi methanolu
nez 4 bude fosforeenan putovat opet pfed mlecnanem. Na obr. 8 je zavislost mezi vyskou vin a teoretickou vodivosti. Vysky vIn byly urceny experimentalne z integral· nich krivek, teoreticke vodivosti byly pocitany z hodnot pK a pohyblivosti. Korekce podle Onsagerova vztahu a na tepiotu byly pri yYpoCtech zanedbany. Ziskane
losti 1ze unt pro stanoveni pohyblivosti hitek, jejichi vy§ku vlny namenme za stejnych podminek. Presnost stanoveni pohyblivosti je asi 2%.
Jak jii bylo zmineno, lze separaci analysovanych latek ovliviiovat zmenami pH. Avsak nekdy jsou fysikalni vlastnosti a hodnoty pK analysovanych latek tak podobne,
ie jejich separace je zdanlive nemoina. Pfikladem mule b9t analysa smesi kationtu obsahujicich K+ a NH;t, viz obr. 9. V takovem pnpade je nutne hledat rekni pro-bl6mu zmenami jinych parametru systemu. Tim je napr. vyber jineho rozpoustedla. V pnpade K + a NHt je vhodn)'m prostfedim methanol, coz dokazuje llspesna ana-lysa zminene smesi, viz obr. 10. Diference v chovani K + a NHt v methanolickem prostredi je skutecne pozoruhodml? Tento jev potvrzuje duleZitost vlivu solvatace iontu na separaci. Obecne lze nci, ze separaci iontu kovU Ize mnohem snadneji provadet v methanolu nei ve vode. Z tohoto hlediska je velmi zajimavjm isotacho-foregram na obr. 11. Zatimco ve vode je OH- velmi pohyblivy, v methanolu je iontem pohybujicim semezi zonou dusicnanu a mravencanu.
Obr. 12. Vztah mezi vzdAlenosti dvou po sobe nAsledujicich pikii a koncentraci pi'isluSne komponenty v piivodnim vzorku 1 kys. 2-keto-l-gulonova, 2 kys. tartronova, 3 kys. mravenci, 4 kys.levulova,
5 kys. gJukonovA, 6 kys. glykolova
Jak jiZ bylo rereno dnve, v rovnovaznem stavu se vsechny zony pohybuji stejnou rychlosti. Koncentrace v techto zOll<lch odpovidaji koncentraci vedouciho elektro-lytu podle Kohlrauschova vztahu. Jestlize je do systemu vneseno vice iontu jednoho druhu, vzdalenost mezi dvema pnslusnymi nasledujicimi maximy vzrilsta neboi vnesenim vice iontu se prodluzuje d6lka zony. A tedy, vicemene naopak k plynove chromatogram, vzda1enost mezi dvema misledujicimi pfky je informaci 0 mnoZstvi
nastfiknute latky. Kvalitativni informace podava vyska vlny integraIniho zazoamu. Na obr. 12. jsou zavislosti mezi koncentraci jednotlivjch druhu iontil a vzdaIenosti nalezenou mezi pnslusnymi dvema piky isotachoforegramu. Vliv terminatoru je zanedbatelnY. Nastrikovany byly konstantni objemy vzorkil davkovacim kohou-tern. Pokud neni davkovano pnlis velke mnozstvi daneho iontu a je-Ii kapilara dosta-tecne dlouha pro dosazeni rovnovazneho stavu, jsou zminene zavislosti primkove. Tyto pnmky Ize take vypocitat.
1
Blokove schema zafizeni je na obr. 13., protielektroda s membnlnou, ktera eli· minuje hydrodynamicky tok mezi elektrodovymi prostory (8) je na obr. 14. a na
~:
Obr. 13. Blokove schema zarizeni
1 zapisovace, 2 elektronicky derivacni chinek, 3 operacni zesilovace, 4 regulator toku protiproudneho elektrolytu,
5 zal'izeni pro protiproud, 6 ukazatel hladiny, 7 davkovaci blok, 8 protielektroda,
9 termoclanky, 10 hlinikovy blok s kapilarou, 11 platinove cidlo pro termostatovani hlinikoveho bloku, 12 topny odpor, 13 regulator tepioly hlinikoveho bloku, 14 termostatovana voda, 15 ventil vylozeny tefionem, uzivany pro odpojovani kapilary od zasobniku s elektrolytem a od zasobniku s vodou na vyplaehovani kapilary, 16 zdroj stabilizovaneho proudu, 17 zasobniky naplnene vedoucim e1ektrolytem a vyplachovaci vodou,
18 magneticke ventily, 19 manometr,
10 regulator tlaku, 21 vzduch (2 atm.)
16 21 5 em
"
3 2 1 0Obr. 14. Schema protielektrody
1 tefionova trubice spojena se zasobnikem vody, 2 tefionova trubice spojena se zasobnikem elektrolytu, 3 teflonova trubice spojem\. s odpadem, 4 a 5 spojovaci mezikusy z plexiskla, 6 viko elektrodove komur ky,
7 elektrodova komfuka, 8 membrana, 9 plexisklovy spojovaci mezikus,
10 tefionova trubice spojena se zasobnikem elektrolytu, 11 dno elektrodove komurky,
12 plexisklovy mezikus pro pi'ipojeni kapilary 13 sroub pro upevneni kapilary,
14 kapilara, 15 platinove elektrody, 16 plexisklovy spojovaci mezikus, 17 teflon ova trubice pi'ipojena k zasobniku protiproudneho elektrolytu
Obr. 16. MultikapilarnI aparatura
obr. 15. je dlwkovaci biok a elektrodovakomfirka naplnena zakoncujicim elektroly-tem.
Na obr. 16. je elektroforetiekii. multikapilarni aparatura, na niZ se mohou soucasne prova.det
m
nezavisIe analysy. K tomu slouZi tn kapilary uruistene na hlinikovem termostatu, v niem je elektricky proud udrfovan konstantni, navzajem nezavisle, pomoci fotoodporfi9, i kdyz je mit jenom jeden zdroj. Jako detekcni zafizeni slouZisada termoclankfi. Pouziti plochych membran a arnitu (nizkotepelny polymer kys. tereftalove) misto plexiskla umoznuje pouiiti nevodnych rozpoustedel.
O:'-r. 15. Davkovaci blok a elektrodova komfuka
1 illJckcni blok, 2 matice pro utdeni septa, 3 septum, 4 plexisklovy mezikus pro pi'ipojeni kaf.,:Jary, 6 sroub pro pl'ipojeni kapilary, 7 kapilara, 9 kabel vysok6ho napetl, 10 niexisklovy mezikus pro upevneni kabelu vysuk6ho napeti, 11 vicko elektrodove komfuky, 12 elektrodova komfuka, 13 spojka mezi elektrodovou komfukou
a komfukou pistu, 14 pripojka odpadu, 15 pist pokryty teflonem
Predlozena prace pojednava 0 souCasnem stavu vYvoje isotachoforesy se zvlastnim zretelem na instrumentacni aspekty provadeni teto techniky V kapilanich. Prace neni
kompletnim prehledem praci V danem oborn. Uvedena technika umoznuje provadet snadno analysy slabych kyselin a kovfi. Bez velkych obtin lze take analysovat slabe base. Velmi perspektivni je miti isotachoforesy pro analysy aminokyselin a proteinfi, eemui je v soucasne dobe venovano mnoho pozornosti na materskem pracovisti autora prace. Analysovat lze rovnez iontove sloueeniny nerozpustne ve vode, pomitim nevodnych rozpoustedel. Perspektivnim polem stale zustava vyvoj vhodnych detek-toru, ktere by umoinovaly detekci zon kratsich nei 0,3 mm a tim i provadeni analys mnohaslozkovych smes!.
Literatura
1. F. M. Everaerts, J. Vacik, Th. P. E. M. Verheggen, J. Zuska: J. Chromatog.49, 262 (1970).
2. F. M. Everaerts, J. Vacik, Th. P. E. M. Verheggen, J. Zuska: J. Chromatog. 60, 397 (1971).
3. A. J. P. Martin, F. M. Everaerts: Proc. Roy. Soc. (London) A 316, 493 (1970).
4. F. M. Everaerts, Th. P. E. M. Verheggen: J. Chromatog. 53, 315 (1970).
5. F. M. Everaerts, R. J. Routs: J. Chromatog. 58, 181 (1971).
6. F. M. Everaerts: Thesis, Eindhoven University of Technology, Eindhoven, Holland 1968. 7. J. L. Beckers, F. M. Everaerts: J. Chromatog. 51, 339 (1970).
8. F. M. Everaerts, Th. P. E. M. Verheggen, Sci. Tools 17, 17 (1970).
9. L. M. Everaerts, Th. P. E. M. Verheggen, J. Chromatog., in press.
Pi'eloZil: Petr Borek
