Ontwikkeling van een bepalingsmethode voor residuen van de nitroimidazolen, dimetridazol, ronidazol en ipronidazol in vlees : uitscheidingsexperimenten bij slachtkuikens

Rapport 88.31 April 1988

ONTiviKKELING VAN EEN BEPALINGSMETRODE VOOR RESIDUEN VAN DE NITROHUDAZOLEN, DIMETRIDAZOL, RONIDAZOL EN IPRONIDAZOL IN VLEES.

UITSCHEIDINGSEXPERIMENTEN BIJ SLACHT-KUIKENS

G. Stoffels

Onderzoek in het kader van de Bijvakstudie Levensmiddelen-Chemie, Prof. Pilnik (LU Wageningen)

Uitscheidingsexperimenten in samen~~erking met COVP-Spelderholt (drs C.A. Kan).

Goedgekeurd door> drs M.M. L. Aertsl .

Rijks-Kwaliteitsinstituut voor land- en tuinbouwprodukten (RIKILT) Bornsesteeg 45, 6708 PO Wageningen

Postbus 230, 6700 AE \vageningen Telefoon 08370-19110

Telex 75180 RIKIL Telefax 08370-17717

VERZENDLIJST

INTERN: directeur sectorhoofden

projectleider (Aerts)

produktcoördinator Dierlijke Produkten (den Hartog) afdeling Diergeneesmiddelen (Sx) circulatie EXTERN: directie VKA directie VD directie

vz

directie DLO directie RVV CL-RVV

COVP-Spelderholt (drs C.A. Kan) (2x)

Vakgroep Levensmiddelenchemie, LU Wageningen (3x) RVV-kring 6 (dr J. Nou\olS)

secretaris ORA (drs H. Vertommen, GDP-Doorn)

Overname van de inhoud is toegestaan, mits met duidelijke bronvermelding.

womrowD

Mijn eerste afstudeervak ten behoeve van de studie Levensmiddelen-technologie is verricht op het RIKILT, afdeling Diergeneesmiddelen. Het besluit om het afstudeervak niet op de Vakgroep Levensmiddelen -chemie van de Landbouwuniversiteit uit te voeren heb ik als een goede keuze ervaren. Ik heb zowel ervaring opgedaan in het opzetten en uitvoeren van chemisch-analytisch onderzoek, als het algehele reilen en zeilen binnen de afdeling Diergeneesmiddelen. De samenwerking met de medewerkers van deze afdeling was goed.

Ik wil diegenen die mij hebben geholpen bij de voortzetting en uitvoering van het onderzoek bedanken. Met name wil ik noemen

drs M.M.L. Aerts (hoofd afdeling Diergeneesmiddelen RIKILT) voor de directe en algehele begeleiding vanuit het RIKILT en drs C.A. Kan voor de begeleiding van het dierexperimenteel onderzoek.

Tot slot gaat mijn dank uit naar de medewerk(st)ers van de typekamer van het RIKILT voor het typen van dit rapport.

I I

SANENVATTING

In de literatuur worden methoden beschreven voor de analyse van roni-dazol, dimetrironi-dazol, hun gemeenschappelijke hydroxymetaboliet en ipro-nidazol. De methoden zijn vaak bewerkelijk en slechts voor bepaling van êên van de genoemde nitro-imidazolen geschikt.

In dit bijvakonderzoek is een multimethode opgezet voor bepaling van residuen van deze nitro-imidazolen in kippevlees. De nitro-imidazolen worden met een acetonitril-methanol 1-l mengsel gelxtraheerd uit het vlees. Het supernatant wordt gezuiverd met aluminiumoxide. Een fractie van 10 ml wordt opgevangen en ingedampt tot circa 0,5 ml. Deze fractie wordt opgelost in HCl, uitgeschud met iso-octaan en vervolgens geneu-traliseerd met Na

2

co

3. Na het toevoegen van de interne standaard (sul-fadiazine) kan het gehalte nitro-imidazolen worden bepaald met HPLC-diode array-UV-detectie. De methode is geschikt voor de bepaling van ronidazol, dimetridazol, de gemeenschappelijke hydroxymetaboliet en ipronidazol vanaf circa 5-10 ~g/kg vlees.

De ontwikkelde methode is in de praktijk getest. Van slacl1tkuikens, die gedurende zeven dagen zijn gevoederd met dimetridazol of ronidazal gemedicineerd voeder is het gehalte nitro-imidazolen in het vlees, na verschillende dagen onthouding van dit voeder bepaald. Het blijkt dat dimetridazol snel wordt omgezet tot de hydroxymetaboliet. Dit is in veel mindere mate met ronidazal het geval. De gehaltes nitro-imidazo-len zijn na 2 dagen onthouding van het gemedicineerde voeder lager dan de detectiegrens van de methode.

VOORlolOORD

SAHENVATTING

1 INLEIDING

2 OPZET EN KORTE SAHENVATTING VAN DE HEUlODE-ONTWIKKELING

3 NITRO-H1IDAZOLEN 3.1 Inleiding 3.2 Hetabolisme

4 LITERATUURGEGEVENS HET BETREKKING TOT HONSTERVOOR-BElilliDING EN BEPALINGSHETHODEN TEN BEHOEVE VAN BEPALING VAN NITRO-IHIDAZOLEN

5 CHROHATOGRAFIE 5.1 Algemeen

5.2 Reversed phase vloeistof chromatografie (RP-HPLC) 5.2.1 Inleiding

5.2.2 Retentiemechanismen

5.3 Hanstervoorbereiding met behulp van HPLC-apparatuur 5.3.1 On-line chromatografie

5.3.2 Derivatisering

6 EIGENSCHAPPEN VAN EEN ANALYSEHETRODE

7 HETHODE-ONT\HKKELING 7.1 Inleiding

7.2 Hanstervoorbereiding I 7.2.1 Hethode

7.2.2 Resultaten en interpretatie

I I I 1 2 9 9 15 18 19 20 22 24 25 26 27 28

8 IV 7.3 Opconcentreren 7.3.1 Methode 7.3.2 Resultaten en interpretatie 7.4 Monstervoorbereiding ll 7.4.1 Methode 7.4.2 Resultaten en interpretatie 7.4.3 Lineariteit en recovery

7.5 Monstervoorbereiding (zonder opconcentreren) lil 7.5.1 Methode

7.5.2 Resultaten en interpretatie 7.5.3 Lineariteit en recovery

DIEREXPERIMENTEEL ONDERZOEK 8.1 Inleiding

8.2 Opzet van het onderzoek 8.3 Analyse

8.4 Reeover i es

8.5 resultaten van het dierexperiment 8.6 Conclusies

8.6.1 Toepasbaarheid van de methode

8.6.2 Verbanden tussen de tijd van onthouding van de toegediende nitro-imidazolen en de aanwezigheid van residuen in borstvlees en lever van slachtkuikens

9 CONCLUSIES

LITERATUUR

BIJLAGEN

A CHROHATOGRAMHEN VERKREGEN HET DE HETHODE, GENOE~1D IN H 7. 4. 3 B CHROMATOGRAHHEN VERKREGEN MET DE HETHODE, GENOEHD IN H 7.5.3 C ANALYSEVOORSCHRIFT

D REKENVOORBEELD TER BEPALING VAN DE REGOVERlES NITRO-IHIDAZOLEN TIJDENS HET DIEREXPERH1ENT IN VLEES EN LEVER

E RESULTATEN DIEREXPERIMENT IN GRAFIEKEN I~EERGEGEVEN

32 34 36 38 42 46 46

48

52 57 58 58 60 62 63 64 66

F REKENVOORBEELD TER BEPALING VAN DE CONCENTRATIE NITRO-IHIDAZOLEN IN LEVER EN VLEES

1 INLEIDING

Dit bijvakonderzoek is uitgevoerd bij het RIKILT, afdeling Diergenees-middelen. Het RIKILT - Rijks-KHaliteitsinstituut voor land- en tuin-bouHprodukten - is het analytisch chemisch onderzoeksinstituut van het Ministerie van LandbouH en Visserij.

Het RIKILT verricht zoHel onderzoek naar positieve k\~aliteitsaspecten (smaak, voedings\~aarde) als naar negatieve kwaliteitsaspecten (residu-en) van landbouHprodukten. Dit houdt in dat er naast analytisch-che-misch onderzoek ook onderzoek plaatsvindt op het gebied van microbio

-logie, microscopie en sensoriek.

Het instituut onderzoekt onder meer monsters die door de Algemene In-spectiedienst van het Ministerie van Landbouw en Visserij Horden ge-zonden voor controle. Voor de Rijksdienst voor de keuring van Vee en Vlees (RVV) treedt het instituut op als ontHikkelings- en referentie-laboratorium. Daarnaast Hordt onderzoek verricht in samenHerking met o.a. Universiteiten, Keuringsdiensten van Waren, TNO-instituten en an-dere landbouHinstituten in binnen- en buitenland.

De afdeling Diergeneesmiddelen houdt zich bezig met dossierbeoordeling ter registratie van diergeneesmiddelen, toegepast onderzoek en metho-denontwikkeling. Betreffende methodenontwikkeling wordt gezocht naar methoden voor het bepalen van residuen van diergeneesmiddelen en hun metabolieten in dierlijke produkten en methoden voor het bepalen van diergeneesmiddelen in veevoeders.

Het hier beschreven bijvakonderzoek is gericht op de bepaling van residuen van de nitro-imidazolen dimetridazol, ronidazol, hun gemeen

-schappelijke hydroxymetaboliet en ipronidazol in vlees. Dit zijn dier-geneesmiddelen die Horden toegepast ter bestrijding van bacteriäle en parasitaire infecties, zoals varkensdysenterie en histomoniasis.

De nitro-imidiazolen zijn verdacht mutageen en carcinogeen. Hierom, en omdat de nitro-imidazolen in het lichaam worden gemetaboliseerd en af

-gebroken tot kleine verbindingen (o.a.

co

2) is het noodzakelijk om zich te richten op de analyse via moederverbindingen tot gehalten in het zeer lage concentratiegebied 1-20 ~g/kg vlees.

-2-In de literatuur staan een aantal methoden beschreven voor de bepaling van residuen van nitro-imidiazolen in voeder, vlees of eieren. Deze methoden zijn over het algemeen gericht op êên van de nitro-imidiazo-len. Het werkt efficienter in tijd en geld wanneer deze verbindingen met êên bepalingsmetbode tegelijk aantoonbaar zijn. De methoden zijn daarnaast meestal erg bewerkelijk.

In het hier beschreven onderzoek is getracht aan bovengenoemde proble-men tegemoet te komen door een poging te doen om een snelle en gemak-kelijk uitvoerbare bepalingsmetbode te ontwikkelen voor dimetridazol, ronidazol, hun gemeenschappelijke hydroxymetaboliet en ipronidazol. Een verdere eis welke aan de te ontwikkelen methode is gesteld is in de eerste plaats dat de methode binnen een range van 1-100 ~g/kg vlees de nitro-imidiazolen betromvbaar en reproduceerbaar kan aantonen. Door uit te gaan van een zo universeel mogelijke extractie van deze verbin-dingen uit het vlees, is het mogelijk ook direct andere verbindingen, waarop men zou willen controleren te extraheren. Verdere bewerkingen zijn dan specifiek voor een bepaalde verbinding of een groep van ver-bindingen.

Het onderzoek valt uiteen in twee delen.

In de eerste plaats het ontwikkelen van een bepalingsmetbode voor re-siduen van de nitro-imidiazolen in vlees. Dit analytisch-chemisch on-derzoek heeft plaatsgevonden op de afdeling Diergeneesmiddelen van het RIKILT. In de tweede plaats een dierexperimenteel onderzoek om na te gaan in hoeverre de ontwikkelde methode geschikt is om in de praktijk toe te passen en eveneens na te gaan in hoeverre reisuden van nitro-i-midazolen achterblijven in het vlees van kippen. Het dierexperimenteel onderzoek is uitgevoerd in samenwerking met het Centrum voor Onderzoek en Voorlichting voor de Pluimveehouderij (COVP) "Het Spelderholt" te Beekbergen.

2 OPZET EN KORTE SM1ENVATTING VAN DE HETHODE-QNTIHKKELING

Bij de opzet van dit bijvakonderzoek uit uitgegaan van de volgende doelstelling: "Ont,vikkel een betromvbare en snel uitvoerbare bepa -lingsmetbode voor residuen van de nitro-imidazolen dimetridazol, roni -dazol, hun gemeenschappelijke hydroxymetaboliet en ipronidazol in het concentratiegebied 1-100 ~g/kg vlees".

Uitgangspunten van dit onderzoek zijn twee reeds ontwikkelde bepa -lingsmethoden. Deze zijn een bepalingsmethode voor residuen van

nitro-imidiazolen in kippe-eieren (Egberink, 1987) en een bepalingsmethode

voor residuen van carbadox (1) in vlees (Beek, 1988).

De eerstgenoemde methode is een multimethode waarbij gebruik wordt

ge-maakt van een waterige extractie gevolgd door opzuiverlog via Extr e-R

lut kolo~nen. Detectie vindt plaats via RP-HPLC met UV of Diode

Array-UV/vis detectie. Bij de ontwikkeling van deze methode zijn

optimale condities voor detectie met HPLC bepaald. Hiervan is in dit

bijvakonderzoek gebruik gemaakt .

De tweede methode beschrijft de bepaling van residuen van carbadox,

waarbij geb~uik wordt gemaakt van een organische extractie, gevolgd

door zuivering met aluminiumoxide en monsterconcentrering d.m.v.

co-lumn-switching HPLC. Carbadox wordt na de HPLC-scheiding

gederivati-seerd met NaOH, waarna UV-detectie plaats vindt. Aangezien carbadox

enkele structuurovereenkomsten met de nitro-umidazolen vertoont is in

dit bijvakonderzoek uitgegaan van deze monstervoorbereiding en de d e-rivatisering met NaOH.

De combinatie van deze methoden is het startpunt geweest van dit

bij-vakonderzoek. De methode is weergegeven in figuur 1.

Bij de analyse van carbadox was gebleken dat door derivatisering met

NaOH de optimale golflengte van carbadox naar een hogere golflengte

verschoof. Een dergelijke verschuiving bleek tot een sterke afname van

-4-In dit onderzoek werd vastgesteld dat geen derivatisering van de

nitro-imidazolen plaatsvond, zodanig dat de optimale absorptie

verschoof naar een hogere golflengte.

Door kleine veranderingen in de monstervoorbereiding aan te brengen

werd een optimale monstervoorbereiding bepaald, waarbij het minste

verlies van de nitro-imidazolen en het meeste verlies van de

stoorcom-ponenten optrad. Deze omstandigheden waren nog verre van ideaal; de

detectiegrens van de nitro-imidazolen was hoog en veel

stoorcomponen-ten gaven een signaal in het chromatagram op de plaats van de nitro

-imidazolen.

In dit stadium van het onderzoek is het gebruik van een

column-switching systeem gelntroduceerd. Met behulp van een

opconcentrerings-kolom was het mogelijk het injectievolume te verhogen en zo de detec

-tiegrens te verlagen. Daarnaast vond extra zuivering plaats.

Monstervoorbereiding

10 g gemalen vlees

~

extractie met 40 ml acetonitril/MeOH 1/1

~ 0 centrifugeren 10 min 2000 rpm, 10 C ~ supernatant over Al 2

o

3-kolom

w

opvangen fracties

indampen tot 0.5 ml in waterbad 40°C onder N2-stroom

~

aanvullen ~t H

2

o

tot 1 ml

toevoegen 2 ml iso-octaan

,

y

schudden met behulp van vibrofix

~

waterfase over acrodiosc

~

derivatiseren met NaOH

~

HPLC Analysekolom Lichrosorb RP18 (3 x 200) Chrompack art. 28397 Voorkolom Bondapak

c

18 (3,9 x 20 mm) 37-50 1.1 Waters art. 27248 Injectievolume 100 1.11 Eluenssnelheid 0,7 ml/min Detectie UV-313 nm Recordersnelheid 5 mm/min Eluens 0, 25 H KH 2

Po

4 - acetonitril 800-200 Figuur 1. Hethode waarmee is gestart

-6-Het gebruik van een opconcentreringskolom bleek wel te voldoen om de detectiegrens van de nitro-imidazolen te verlagen, maar niet om stoor-signalen uit het chromatagram te verwijderen.

In eerste instantie werd nu nagegaan waar de stoorcomponenten vandaan kwamen. Het bleek dat de aluminiumoxide en het vlees verantwoordelijk waren. De stoorcomponenten afkomstig van de aluminiumoxide waren

ge-makkelijk te verwijderen. Voor de vleescomponenten was dit een groter

probleem.

Door bij hogere golflengtes te meten werd geprobeerd de optimale ver-houding tussen het signaal van de nitro-imidazolen (hoog) en het

sig-naal van de stoorcomponenten (laag) te bepalen. Bij 328 nm was de ab-sorptie van de stoorpieken beduidend minder. Echter, de nitro-imidazo-len gaven eveneens een wat lagere absorptie. In het vervolg werden de bepalingen zo,~el bij een golflengte van 313 als 328 nm uitgevoerd. Ter ver,~ijdering van de stoorcomponenten uit het vleesmonster werden opnieuw vele veranderingen in de monstervoorbereiding uitgeprobeerd. Uiteindelijk bleek het door enkele wijzigingen in de monstervoorberei

-ding mogelijk te zijn de meeste stoorcomponenten te verwijderen. Een

korte weergave van de in dat stadium ontwikkelde methode is

weergege-ven in figuur 2.

Monstervoorbereiding

10 g gemalen vlees .j,

extractie met 40 ml acetonitril/MeOH 1/1

..V

centrifugeren 10 min 2000 rpm, 10oC ~

supernatant over 6 g Al

2

o

3 ~ecleaned met HeOH)

opgevangen fractie 10-20 ml

..y

indampen tot 1,0-1,5 ml in waterbad 40oC onder N2-gasstroom

-!1

aanvullen tot 2, 5 ml met 1% tlAc-oplossing ~ toevoegen 2,5 ml iso-octaan -V vibrofix J, centrifugeren 5 min 2000 rpm -.1t

zure fase door een acrodiosc J,

HPLC

Analysekolom Lichrosorb RP 18 (3x200 mm) Voorkolom Bondapak

c

18 (39x20 mm) Injectievolume 1 ml

Eluenssnelheid 0,7 ml/min Detectie UV-313 nm

Recordersnelheid 5 mm/min

Concentreringskolom SEP-PAK

c

18 (3x600 mm)

Spoelvloeistof water

Pompsnelheid spoelvloeistof 1 ml/min

Switchtijd 2-5 min (oftewel: er wordt slechts 1 minuut gespoeld) Eluens 0, 25 H KH

2Po 4 - acetonitril 850-150

Figuur 2. Ontwikkelde methode in de loop van het onderzoek

Gezien het nadeel van extra verdunning van de concentratie

nitro-imi-dazolen door oplossing in 4 ml eindoplossing om 1 ml te kunnen injec-teren, h1am de vraag naar voren of het gebruik van een

opconcentre-ringskolom wel zinvol '~as. Zonder opconcentreringskolom hoefde slechts

200 ~1 gelnjecteerd te worden. Met gebruik van een automatisch

injec-tiesysteem zou dit betekenen dat slechts circa 0,8 ml eindvolume

vereist zou zijn. Andere voordelen van het verwijderen van het column-switching systeem waren dat geen verlies meer op kon treden van

nitro-imidazolen tijdens het spoelen en gebruik van een minder 'ingewikkeld' systeem (niet altijd is een column-s,~itching systeem voorhanden). Besloten werd de opconcentreringskolom te verwijderen uit het HPLC

-systeem. Het bleek dat de detectiegrens zonder opconcentreringskolom voldoende laag '~as door het geringe eindvolume dat aam~ezig diende te zijn. Daarnaast waren zonder opconcentreringskolom vrijwel geen stoor-componenten in het chromatagram aanwezig. De ontwikkelde methode is

-

8-Monstervoorbereiding

10 g gemalen vlees

~

extractie met 40 m\~acetonit ril/HeOH

supernatant over 6 g Al 2

o

3 kolom

"'

opgevangen 10-20 ml indampen tot 0,5 ml

-J.

aanvullen tot 2 ml iso-octaan ~ ultrasone, 1 minuut

f

aanvullen met ~0,25 ml 3 N HCl vibrofix

-!t

centrifugeren 5 min 2000 rpm -lt

zure fase door

10,45 ~m acrodiosc 'I'

1/1

aanvullen met 1~0 J . .il Na

2

co

3 2. 5 H

toevoegen: een interne-.,Vstandaard (sulfadiazine)

injectie 200 1ll HPLC Analysekolom Lichrosorb RP18 (3x200) Voorkolom Bondapak

c

18 (3,9x20 mm) Injectievolume 200 ~1 Eluenssnelheid 0,7 ml/min Detectie UV

=

313 nm Recordersnelheid 5 mm/min Eluens 0,25 H KH 2

Po

4 - acetonitril 850-150

Figuur 3. Ontwikkelde methode aan het einde van het onderzoek

Bij het bepalen van de recovery bleek deze niet in alle concentraties

van nitro-imidazolen in de monsters gelijk te zijn. Dit vond zijn

oor-zaak waarschijnlijk in de onnauwkeurige indampstap tot 0,5 ml. Daarom was het beter een interne standaard aan het eindvolume toe te voegen. In hoofdstuk 7 zijn de verschillende stappen die tijdens de methode

3 NITRO-IMIDAZOLEN 3.1 Inleiding

Nitro-imidazolen worden zowel humaan als veterinair toegepast ter b

e-strijding van bacteriële en parasitaire infecties. In de veterinaire

sector wordt voornamelijk gebruik gemaakt van dimetridazol, en in mid

-nerde mate van ronidazal en ipronidazol. De nitro-imidazolen worden in

het lichaam omgezet tot meerdere metabolieten. De metabolieten brengen

een verandering teweeg in het DNA-patroon van anaerobe

ziekteverwek-kende organismen, waardoor deze niet meer levensvatbaar zijn (de Roy

en de Vries, 1980).

Dimetridazol heeft een specifieke werking tegen flagellaten (Histomo

-nas, Trichomonas), ciliaten (Balantidum coli) en anaerobe bacteriën.

De verbinding wordt daarom toegepast ter voorkoming en genezing van histomoniasis bij pluimvee en varkensdysenterie en trichomoniasis bij

het rund (repertorium diergneesmiddelen, 1986). Een lage dosis in het

voeder heeft bovendien een groeibevorderend effect (Mattern en van

Gend , 198 7) •

Ronidazal en ipronidazol vertonen een vergelijkbare histomonale

acti-viteit bij pluimvee als dimetridazol. Wat betreft de toediening van de

nitro-imidazolen via het voeder worden de volgende gehaltes aangehou

-den:

dimetridazol 125-150 mg/kg voeder (Buizer and Severynen, 1975)

ronidazal 60-90 mg/kg voeder (Cala et al, 1976)

ipronidazol 40-80 mg/kg voeder (AMC, 1983)

3. 2 Het a bolisme

Studies naar het metabolisme van dimetridazol (1) in varkens (National Institute of Health, 1974) hebben uitgewezen dat dimetridazol in het

lichaam wordt geoxideerd tot onder meer 2-hydroxy-methyl-1-methyl-5

-nitro-imidazol. Dit bleek ook uit het dierexperimenteel onderzoek van

Egberink (1987). Zij analyseerde in eieren en plasma van kippen die

eenmalig waren toegediend met 75 mg dimetridazol zowel dimetridazol

als de hydroxymetaboliet. Deze alcoholmetaboliet is een zeer belan

g-rijke metaboliet en kan verder worden geoxideerd tot 1-methyl-5

-nitroimidazol-3-carboxylzuur (3) of worden geconjugeerd tot 1-methyl

-10-Na verloop van tijd vindt blodegradatie plaats van dimetridazol en/of

de metabolieten die een imidazolring bevatten. De ontstane

afbraakpro-dukten (o.a. co

2) worden gelncorporeerd in natuurlijke verbindingen,

zoals aminozuren, lipiden en eiwitten.

Door Rosenblum et al (1972) is onderzoek verricht naar het metabolisme

van ronidazol. Ronidazol ondergaat een veel snellere blodegradatie dan

de overige nitro-imidazolen. Er worden vrijwel geen metabolieten

ge-vormd die een imidazolring bevatten. Bij het dierexperimenteel

onder-zoek van Egberink (1987) bij kippen kon slechts een geringe hoeveel

-heid van de hydroxymetaboliet in eieren en plasma worden geanalyseerd

na eenmalige toediening van ronidazol. Vrijwel meteen na opname van

ronidazal vindt ringopening plaats (5). In deze figuur is de No

2-groep

van ronidazol geschreven als R, aangezien deze groep niet als zodanig

in het lichaam aanwezig is, maar als NH

2, OH of H. De ringopening kan

in theorie langs 3 routes plaatsvinden. De gevormde C0

2 wordt via

bio-synthese ingebouwd in bijvoorbeeld aminozuren (citroenzuurcyclus)

(Rosenblum et al, 1972).

Volgens Mac Donald et al (1971) vindt metabolisatie van ipronidazol

(6) dusdanig snel plaats, dat in bloed, spieren, huid en vet van

kal-koenen voornamelijk metabolieten worden teruggevonden. De

belangrijk-ste metaboliet is 1-a,a-trimethyl-5-nitroimidazol-2-methanol (7).

Zo-wel ipronidazol als de genoemde metaboliet zijn instabiel onder basi

-sche omstandigheden; door basische hydrolyse kan nitriet worden

ge-vormd. Een andere metaboliet die wordt gevormd is

1-methyl-2-isopro-panol-4-hydroxy-5-nitroimidazol (8). Deze metaboliet en een (niet

ge-indentificeerde) polaire metaboliet werden bij het experiment van

Eg-berink (1987) geanalyseerd in eieren en plasma na eenmalige toediening

van 75 mg ipronidazol.

Enige fysische en chemische parameters van dimetridazol, ronidazol en

1. dimetridazol

o,_

rv

-

Q

~

-

c

H

₃

t~3,

2. 2-hydroxymethyl-1-methyl-5-nitro-imidazol (hydroxymetaboliet)

-12-4. 1-methyl-5-nitroimidazol-2-ylmethylhydrogeenfosfaat

/1

-

f\1

O;}J

.-:

'-..

N )

-

C

\-1

10~3

tl

Uh

5. ronidazal 6.

~

~

CH:f

\'Jk

-C-C

il

20

\

~

~

'\\

c

~

~

-

tJ~2.

~Cd-\

j;

c

\-h

..

0

\

-

1

C

l-I

20

J;

CCXJ

H

.JJ

C02..-t

-

H~

...

o

7. ipronidazol

8. 1-a, a-trimethyl-5-nitroimidazol-2-methanol

ij'

C

-

N

C

H

3

ow

-c

\\

_.c

'

··

-

o

H

2.

"'-

~

c

I

I

C

\

-

~

C

H

3

9. 1-methyl-2-isopropanol-4-hydroxy-5-nitroimidazol

~

-

N

o

NJ

2

N

/

~

-14

-Tabel l: Ni tro-imidaWlen.

Di.Jre t rl dazo l _{.---t...,..:.:=::-:} Ronidarol

*

1~thyl-5-nitro-imidazol-*

L-2~thyl-5-nltro­

lmida.zol

-+-=lp=.:ronidazol

*

1~thyl--=-2--(:-:-l_-me_ thyl-chemische na<111

Merl<naan

Brutofonwle

Structwr

Re lat leve lll)lecuul-massa ~ltJUlt Uiterlijk Oplosbaarheld 141,1 138-14l°C wit/bruin/geel

kristallijn poeder slecht oplosbaar in

~ooater en ether, redelijk tot goed oplosbaar in

chlorofonn en ethanol

goed oplosbaar in minerale zuren

? niet in literatuur vermeld.

2~thanol carb<Jnaat

*

1 ""'trethyl-2 [ carb.:m:>yloxy) methyl]-5-nlt~imidazol

*

(l-methyl -5-nltro-lmida.zol-2-yl) methyl-carbamaat

*

carbamaatzuur (l~thyl -5- nitro-imddazol-2-yl)methyl-ester. 200,2 167-169°C lichtgele kristallen

oplosbaar in zure oplos-middelen, acetoo, methanol, ethanol, chloroform en ethyl-acetaat. ethyl)-5-nltro-imidazol.

*

2-isopropyl-1-methyl-5-ni t ro-imidazol. Ipropran C]HUNJÜ2 169,2 60°C witte plaatjes ?

instabiel in basische oplos- ontleedt o.l.v. lN-Ucht

singen; pKa:al,2 oplosbaarheid in en is instablel in basische \eter bij (ii = 6,5:!:: 2,9 1Jg/ml oplossingen

4 LITERATUURGEGEVENS MET BETREKKING TOT HONSTERVOORBE\mRKING EN BE-PALINGSHETHODEN TEN BEHOEVE VAN DE BEPALING VAN NITRO-IMIDAZOLEN

In de literatuur worden vele monstervoorbewerkingen en

bepalingsmetho-den - polarografisch, spectrofotometrisch, gaschromatografisch, hoge druk vloeistof chromatografisch - bescl1reven. Hieronder worden enkele methoden beschreven om een beeld te geven op welke verschillende

ma-nieren nitro-imidazolen aangetoond kunnen worden in voeder, vlees of

eieren.

Voor de bepaling van ronidazal in voeders zijn verschillende methoden

voorhanden. Aangezien in voeders 60-90 mg/kg voeder ronidazal aanwezig

kan zijn is een detectielimiet van 50 mg/kg voldoende.

Szalkowski en Kanora (1969) maken gebruik van spectrofotometrie. Door alkalische hydrolyse wordt de nitrogroep van ronidazal gesplitst. Het gevormde vrije nitrietion reageert met 4-aminobenzoeenzuur. Tot slot

wordt door koppeling met N-2-aminoethyl-1-naphthylamine een gekleurd

complex gevormd, welke spectrafotometrisch aangetoond kan worden. Het grote nadeel van deze methode is dat de methode niet specifiek is; voeders die gras of verbindingen met nitrogroepen (bv nitrofurazon)

bevatten geven een valshoge absorptie.

Een betere methode voor de bepaling van ronidazal in voeders is

be-schreven door Harris et al (1977). Er wordt gebruik gemaakt van

gas-chromatografie. Ronidazal wordt, in aanwezigheid van trisodiumortho

-fosfaat, geäxtraheerd uit het voeder met ethylacetaat. Het extract

wordt na indampen tot 30 ml gezuiverd door

vloeistof-vloeistofextrac-tie met HAc. De zure fase ~o~ordt gebufferd met NaOH tot pH=lO.

Daar-naast wordt NaCl toegevoegd tot verzadiging optreedt. Hierna \o~ordt een

vloeistof-vloeistofextractie met ethylacetaat uitgevoerd, 1o1aarbij

ro-nidazol in de ethylacetaatfase overgaat. Het ethylacetaat wordt inge

-dampt, waarna een interne standaard wordt toegvoegd. Aan de nu ontsta-ne oplossing wordt BSA (NO-Bis (tri-methylsilyl) acetamidesilylderi-vaat) toegevoegd. Na verhitten reageert het BSA met ronidazal ,.,aardoor een vluchtig derivaat ontstaat. Het behulp van gaschromatografie

(ko-lom 5% OV-17), mobiele fase: N0

2) kan 20 mg/kg voeder aangetoond

wor-den.

In een intern analysevoorschrift van het RIKILT (Beek en Buizer, 1981) staat een analysemethode beschreven, waarbij gebruik wordt gemaakt van

-16-60 mg ronidazal per kg voeder. Na extractie met methanol wordt het

su-pernatant gezuiverd met aluminiumoxide en florisil. Twee ml eluaat

wordt opgevangen, na toevoegen van 20 ml tetrachloorkoolstof en 18 ml

demiwater wordt de oplossing geschud en gecentrifugeerd. De waterige

fase is de te injecteren oplossing op het HPLC-systeem (200 ~1, kolom

Bondapak

c

18, eluens: water-methanol 85-15).

Voor de bepaling van dimetridazol in voeders wordt een

spectrafotome-trische bepaling beschreven door Stone en Hobson (1973). Dimetridazol

wordt, in aanwezigheid van trisodiumfosfaat geëxtraheerd uit het

voe-der met chloroform. Het extract wordt gezuiverd door

vloeistof-vloei-stofextractie met HCl. De zure fase wordt gebufferd met NaOH. Hierna

wordt een vloeistof-vloeistofextractie uitgevoerd met benzeen, waarbij

dimetridazol in de benzeenfase overgaat. Met behulp van UV-detectie

bij 320 nm wordt bepaling van het dimetridazolgehalte in de be

nzeenfa-se plaats. De methode is geschikt om minder dan 0,0003% dimetridazol

in voeders aan te tonen (dat wil zeggen< 300 mg/kg).

Wanneer residuen van nitro-imidazolen in vlees aangetoond moeten

wor-den is een lage detectielimiet van groot belang, onder andere door

snelle metabolisaties en blodegradaties tot vaak onbekende of

niet-he-paalbare verbindingen. Vamo~ege de beperkte specificiteit,

nauwkeurig-heid en lage gevoeligheid van microbiologische, polaragrafische en

ca-lorimetrische bepalingsmetheden heeft de hoge druk

vloeistofchromato-grafie (HPLC) een steeds belangrijkere rol ingenoemen wanneer de

ni-tro-imidazolen tot een niveau van ~g/kg in vlees aangetoond dienen te

worden. Daarom worden hier t'o~ee bepalingsmetheden beschreven die uit

-gaan van een HPLC-systeem.

Door Hobson-Frohock en Reader (1983) is een HPLC-methode ontwikkeld

voor de bepaling van dimetridazol in vlees. Dimetridazol wordt

geëx-traheerd uit het vlees met dichloormethaan. Het extract wordt

gezui-verd door vloeistof-vloeistofextractie met HCl. Op zure fase wordt

ge-neutraliseerd. Hierna vindt vloeistof-vloeistofextractie plaats, met

dichloormethaan, waarbij dimetridazol in de dichloormethaanfase

over-gaat. Deze fase \o~ordt ingedampt tot 100 ~1. Na het toeveegen van een

interne standaard (metronidazol) wordt 20 ~1 gelnjecteerd op een

HPLC--systeem (kolom Spherisorb ODS, eluens 0,01 M KH

2Po4-methanol

bepaling van ipronidazol in gehakt is een HPLC-methode ontwikkeld

welke geschikt is binnen een range van 10-500 ~g/kg (ppb-niveau) (Van

Bruchem en Buizer, 1983). De recovery is

>

70%. lpronidazol wordt

geextraheerd uit het gehakt met ethylacetaat. Het extract wordt

gezuiverd door vloeistof-vloeistofextractie met HCl. De zure fase

wordt geneutraliseerd met NaOH. Hierna wordt een

vloeistof-vloeistofextractie uitgevoerd met ethylacetaat, waarbij ipronidazol in de ethylacetaatfase overgaat. Na indampen vindt

oplossing in eluens plaats en kan het monster gelnjecteerd worden op

een HPLC-systeem (kolom: Bondapak C18, eluens: water-methanol-ijsazijn

700-300-10).

Egberink (1987) is met behulp van een hogedruk vloeistofchromatograf-ische methode in staat residuen van dimetridazol, ronidazol, hun ge-meenschappelijke hydroxymetaboliet en ipronidazol in eieren tot 10 ppb

aan te tonen. Aan gehomogeniseerd ei wordt een zure verzadigde

na-triumchloride-oplossing toegevoegd en gemengd. Aan een deel van dit

mengsel wordt extrelutmateriaal toegevoegd. Dit ei-extrelutmengsel

~~ordt overgebracht in een extrelut-plastic huls, waarna elutie met

dichtoormethaan plaatsvindt (solidphase extractie). Het eluaat wordt

ingedampt tot droog. Na toevoeging van iso-octaan en HCl wordt na

mengen gecentrifugeerd. De waterige fase wordt gefiltreerd door een

0,45 ~m filter en wordt geneutraliseerd met natriumcarbonaat. Van deze

oplossing wordt 100 ~1 gelnjecteerd op een Bondapak C18 (3,9x20 mm)

37-50 ~· Het gebruikte eluens is 0,25 M KH

2

Po

4-acetonitril 800-200

voor de bepaling van ipronidazol en dimetridazol (+metaboliet). Het

gebruikte eluens is 0,25 M KH

2

Po

4-acetonitril-methanol 900-40-60 pH=4

voor de bepaling van ronidazal (+metaboliet).

Uit genoemde voorbeelden van bepalingsmetheden komt naar voren dat er

vaak gebruik wordt gemaakt van vloeistof-vloeistofextracties. In alle

gevallen dient de altijd aanwezige zure fase gebufferd te wroden. Dit is een groot nadeel, omdat vooral ronidazal en ipronidazol instabiel

zijn onder basische omstandigheden. Deze stap in de opwerking moet dan

ook snel worden doorlopen.

Een ander punt is dat de beschreven methoden voor slechts één

verbin-ding toepasbaar zijn. Er staat soms zelfs bij de methode beschreven

-18-5 CHROHATOGRAFIE

5.1 Algemeen

Chromatografie kan omschreven worden als een scheidingsmethode die

ge-bruik maakt van verschillen in verdeling van een stof over twee fasen,

waarbij de ene fase - de mobiele fase - langs het oppervlak van de

an-dere fase - de stationaire fase - wordt gevoerd. Elke stof zal zich in

een karakteristieke verhouding over de zure fase verdelen, zodat

ver-schillende stoffen met verschillende snelheid worden meegevoerd door

de mobiele fase.

De mobiele fase kan zowel gas zijn (gaschromatografie) als vloeistof

(vloeistofchromatografie). Een belangrijke beperking bij

gaschromato-grafie is dat de te analyseren stof verdampt moet worden, wat bij

vloeistofchromatografie niet nodig is. Sinds 1970 is de ontwikkeling

van de vloeistofchromatografie als alternatief voor gaschromatografie

op gang gekomen. Hierbij speelt de HPLC-invoering de belangrijkste

rol. Aanvankelijk betekende HP High Pressure, later is men echter gaan

spreken van High Performance, wgens de hoge schotelgetallen die

be-perkt konden worden (het schotelgetal geeft het scheidend vermogen via

kolom weer: n = L/h, L = lengte van de kolom, h = een stukje kolom, in

de lengterichting genomen, overeenkomend met êên instelling van het

verdelingsevenwicht volgens Nernst.) (Sanders, 1985).

Een HPLC-opstelling ziet er in zijn algemene vorm als volgt uit:

Hierbij is:

1. Habiele fase

Eisen die gesteld worden aan deze fase zijn dat deze niet visceus is

(een hoge viscositeit heeft tot gevolg dat de massa-overdracht en de

drukval in negatieve zin worden beinvloed) en niet reageert met stof

2. Pomp

De pomp moet een constante hoge druk kunnen leveren om de tegendruk

die altijd ontstaat, te overwinnen.

3. Injector

4. Quard kolom

Een quard kolom voorkomt dat de eigenlijke kolom verontreinigd en be

-schadigd wordt.

5. Kolom

De kwaliteit van de kolom wordt niet alleen bepaald door het type pak

-kingsmateriaal, maar ook door de wijze van pakken. Wanneer de pakking

niet goed is verlopen, is de pakking langs de wand minder uniform dan

in de centrale kern van de wand. Dit heeft tot gevolg dat de snelheid

van monstermoleculen langs de wand toeneemt wat piekverbreding tot

ge-volg heeft.

6. Thermostaat

Bij verandering van temperatuur kan de specificiteit en de

nauwkeurig-heid gaan variëren. Het is daarom van belang een constante temperatuur

te handhaven.

7. Detector: meestal een UV-detector of fluoriscentiedetector.

8. Recorder

(Aerts, 1979, Sanders, 1985)

5.2 Reversed phase vloeistof chromatografie (RP-HPLC)

5.2.1 Inleiding

Als gebruik wordt gemaakt van een apolaire stationaire fase en een po

-laire mobiele fase wordt gesproken van reversed phase vloeistof

chro-matografie.

Voor de bereiding van de stationaire fase wordt over het algemeen ge

-

20-Er vindt een oppervlaktereactie plaats tussen de drager en een geschikte organochlorosilaan (of organo-alkoxy) modifier;

CH 3 Si - OH

+

Cl-Si CH 3 CH₃ Si - 0 - Si - R + HCl CH₃

De bezettingsgraad van de bindingsreactie ligt voor

c

8

-

c

18 alkylgroe-pen tussen 40 en 50% (cursus chromatografie, 1987). Er blijven dus veel Si-OH groepen op het oppervlak aanwezig. Deze groepen kunnen de reproduceerbaarbeid en kolomstabiliteit negatief beïnvloeden, bijvoor

-beeld door interactie met basische of zure componenten in het eluens. Daarom wordt vaak een tweede silylering uitgevoerd met een klein sily-leringsreagens, zoals trimethylchlorosilaan (TMS). Dit proces wordt endcapping genoemd, en dient dus ter vermindering van het aantal po-laire interacties.

5.2.2 Retentiemechanismen

Het mechanisme van de retentie bij gebruik van een RP-HPLC-systeem is uitgebreid bestudeerd, maar nog niet geheel begrepen. De retentie wordt voornamelijk beïnvloed door de samenstelling van de mobiele fase en (in mindere mate) de aard en fysische chemische eigenschappen van stationaire fase (alkylketenlengte, endcapping e.a.).

De mobiele fase

l~at betreft de mobiele fase speelt in de eerste plaats de polariteit van het eluens een rol. Loop-vloeistoffen worden ingedeeld naar elu-tiesterkte, dit is het vermogen om een verbinding snel door de kolom te sturen. Hoe polairder een loopvloeistof, des te kleiner is de elu-tiesterkte. In het scheidingsproces tussen componenten speelt de mo-biele fase overigens een actieve rol. Aangezien de interacties tussen watermoleculen van het eluens en de opgeloste component van het

monster geringer zijn dan de interacties tussen watermoleculen onder

Niet alleen de polariteit van het eluens heeft invloed op de retentie-tijd van componenten. Door als eluens een mengsel van water met een

organische modifier (acetonitril, methanol) te gebruiken kan de op-pervlaktespanning van het eleuens veranderd worden. De retentietijd van een component zal bij gebruik van een hogere concentratie van deze modifier afnemen door verlaging van de oppervlaktespanning.

Wanneer ionogene verbindingen aangetoond dienen te worden is het van belang dat de verbinding geneutraliseerd wordt, omdat bij volledige ionisatie door vele interacties met de mobiele fase de retentietijd drastisch omlaag gaat.

Het toevoegen van zout aan de mobiele fase heeft eveneens invloed op

de retentietijd. Door statische interacties tussen het zout in het

eluens en de opgeloste component zal bij een lage concentratie zout de retentietijd afnemen.

Het gebruik van een hoge concentratie zout geeft door verhoging van de

oppervlaktespanning van het water een toename in de retentietijd.

De stationaire fase

Wat betreft de stationaire fase speelt de alkylketen de grootste rol.

Over het algemeen varieert de alkylketen van

c

1 tot

c

18• Bij toename

van de ketenlengte en het koolstofgcltalte neemt de retentietijd toe.

Er is echter een kritieke ketenlengte waarboven de retentietijd niet

meer toeneemt. Bij maximale interactie tussen de opgeloste component

en de alkylketen is verdere verlenging van de alkylketen zinloss. Door

een verschillende mate van interactie van componenten (onder andere

bepaald door lengte van de alkylketen en grootte van de componenten)

komen de componenten met verschillende retentietijden uit de kolom. (Aerts, 1979, cursus chromatografie, 1987).

5.3 Monstervoorbereiding met behulp van HPLC-apparatuur

Monstervoorbereiding is noodzakelijk om het monster geschikt te maken voor injectie op het HPLC-systeem (o.a. vaste monsters oplossen) en om het monster te zuiveren en/of te concentreren. De belangrijkste

mon-stervoorbehandelingstechnieken zijn extractie, chromatografische

tech-nieken en derivatisering. In dit hoofdstuk wordt ingegaan op de mon

-22-5.3.1 On-line chromatografie

Er wordt gesproken van een on-line chromatografische monstervoorberei-ding wanneer de kolom die hiervoor wordt gebruikt deel uitmaakt van het HPLC-systeem. Bij een off-line procedure vindt onafhankelijk van het HPLC-systeem zuivering of concentrering van een monster over een kolom plaats. Nu vindt na verdere opwerkingsstappen zoals indampen in-jectie van de eindoplossing op het HPLC-systeem plaats. Als nadelen van een off-line procedure kunnen genoemd worden het verlies van mon-stercomponenten tijdens de opwerking (o.a. tijdens de indampstap),

kans op contaminatie door de vele bewerkingen die vaak uitgevoerd dienen te worden, relatief hoge kosten door eenmalig gebruik van de kolommen, en de vele manuele handelingen die nodig zijn.

Het principe van een on-line monstervoorbereiding is weergegeven in figuur 4.

In situatie A wordt de injectieloop gevuld met het monster. Op dit mo-ment loopt door de opconcentreringskolom een spoeloplossing, waarin de

te analyseren componenten slecht oplossen. Door de analytische kolom loopt het eluens, waarin de te analyseren componenten goed oplossen. In situatie B heeft een zodanige schakeling plaatsgevonden dat de op-concentreringskolom met de loop wordt verbonden. De te analyseren com-ponenten concentreren zich bij de juiste keuze van het pakkingsmateri-aal van de kolom en de spoeloplossing op de opconcentreringskolom. De spoeloplossing elueert storende componenten mee naar een afvalvat.

Nadat lang genoeg is gespoeld om de componenten op de kolom te concen-treren en stoorcomponenten te verwijderen wordt er opnieu'~ geschakeld. Deze schakeling is weergegeven in situatie C. Door de schakeling wor-den de analytische kolom en de opconcentreringskolom met elkaar ver -bonden. Er stroomt eluens over de kolommen. Bij juiste keuze van de analytische condities zullen de te analyseren componenten met het elu-ens mee elueren van de opconcentreringskolom naar de analytische ko-lom. Na enige tijd zijn alle componenten aan de analytische kolom ge-absorbeerd en wordt weer teruggeschakeld naar situatie A.

De functies van dit column-switching systeem kunnen zijn:

- concentrering van de te analyseren componenten (er kunnen grote vo-lumina (tot 1 liter) geïnjecteerd worden)

- bescherming van de analytische kolom (er wordt een minder vuil

mon-ster op deze kolom gebracht)

- opslag (bijvoorbeeld voor transport van monsters)

S.ruaton A LOM! Looo

PREa:tK:OORA TI~

S.tuaton B LOM! CC

Figuur 4. On-line monstervoorbereiding

-24-De effici~ntie van een column-switching systeem kan worden bepaald

door het doorbraakvolume van de componenten te meten. Het doorbraakvo

-lume geeft weer hoe lang het duurt voordat de te analyseren component

met de spoeloplossing mee-elueert. Een klein doorbraakvolume betekent

een lage efficiëntie van het column-s\vitching systeem. Hierbij spelen

vele factoren een rol, zoals aard der componenten, elutiesterkte van

de spoeloplossing,het pakkingsmateriaal van de opconcentreringskolom

en snelheid waarmee het monster over de kolom geleid wordt.

Het pakkingsmateriaal van een opconcentreringskolom is meestal

c

₈

-c

₁₈-materiaal, met een deeltjesgrootte van 5-50 ~m. Steeds vaker

wordt gebruik gemaakt van cartridges. Cartridges zijn kolommetjes met

pakkingsmateriaal bestaande uit 3 ~m deeltjes. Voordelen van het

gebruik van cartridges ten opzichte van andere kolonunen zijn o.a. dat

ze minder bandverbreding van de pieken in het chromatagram geven,

uit-wisselbaar zijn en eenvoudig opnieuw te pakken (cartridges worden niet

alleen als opconcentreringskolom steeds vaker gebruikt, maar ook als

analyse kolom). De dimensies van deze kolonunen zijn meestal 4, 6 x 20 mm

ID x Lof 2,0 x 10 mm ID x L (ID

=

Interne Dichtheid, L

=

lengte)

(cursus chromatografie, 1987).

5.3.2 Derivatisering

Derivatisering van de te analyseren component wordt meestal uitgevoerd

ter verlaging van de detectiegrens en/of verhoging van de

specifici-teit. Er kan zowel postkolom als prekolom derivatisering uitgevoerd

worden. Wanneer de derivatisering v66r de kolom plaatsvindt is het

mo-gelijk het retentiegedrag van de te analyseren component te

beïnvloe-den. Door derivatisering kunnen componenten specifieke eigenschappen

krijgen, waardoor ze met een meer specifieke detector kunnen worden

aangetoond (bv fluoriscentiedetector). Soms wordt een derivatisering

uitgevoerd om de componenten te stabiliseren. Daarnaast kan worden

voorkomen dat reactieve groepen van componenten interacteren met de

6 EIGENSCHAPPEN VAN EEN ANALYSEHETRODE

Tijdens het literatuuronderzoek is gebleken dat de inhoud van

ver-schillende kwaliteitskenmerken van een analysemethode soms

verschil-lend wordt opgevat. Daarom worden hier de verschilverschil-lende termen op een rijtje gezet, zoals ze zijn opgesteld door de Commissie van Europese

Gemeenschappen (commission of decision, 1987). Ze zijn opgesteld voor

het bepalen van residuen van stoffen met hormonale of thyrostatische

eigenschappen. Voor de bepaling van residuen van nitro-imidazolen zul-len de definities niet anders zijn.

Specificiteit ( "specificity")

Specificiteit is de mate waarin een methode onderscheid kan maken

tus-sen de te analyseren component en andere (stoor)componenten. Bij

ver-wante stoffen moet altijd getest worden of ze storen.

Nam.;rkeurigheid ( "accura~cy")

Hieronder wordt verstaan in hoeverre de concentratie van een component

die met een analysemethode wordt bepaald, overeenkomt met de concen-tratie die er \olerkelijk inzit. De nauwkeurigheid \.;rordt beïnvloed door systematische fouten en niet-systematische fouten.

Precisie ("precision")

Deze term geeft weer in hoeverre de resultaten van een analysemethode

reproduceerbaar zijn onder standaardconclusies binnen één laboratorium

en tussen laboratoria.

Detectielimiet ("limit of detection")

De detectielimiet is de laagst mogelijke meetbare concentratie van een

component die onder redelijk statistische omstandigheden met de analy-semethode aangetoond kan worden.

Gevoeligheid ( "sensit i vity")

Gevoeligheid is omschreven als de mate waarin een methode kan discri

-mineren tussen kleine veranderingen in de concentratie van de te

ana-lyseren component.

Voor de formules ter bepaling van bovenstaande kenmerken verwijs ik naar de literatuur (commission of decision, 1987).

-26-7 METHODE-ONTIHKKELING

7.1 Inleiding

Aan de hand van het verslag van Egberink (1987) is het volgende HPLC-systeem voor de bepaling van nitro-imidazolen opgezet. Het eluens is een 800-200 mengsel van 0,25 t-1 KH

2Po4 en acetonitriL Voor de

schei-ding van de hydroxymetaboliet en ronidazal is het eluens 900-40-60 mengsel van 0,25 M KH

2

ro

4, acetonitril en methanol, met pH=4 vereist. Hierbij kan ipronidazol niet bepaald worden. Omdat tijdens de opstart van het bijvakonderzoek de hydroxymetaboliet en ronidazal niet in

de-zelfde monsters aanwezig zijn kan in eerste instantie worden volstaan

met het eluens 800-200,

De voorkolom is een Bondapak

c

18 (3,9x20 nun) 37-50 1-1• De analysekolom

is een Lichrosorb RP18 (3x200 mm).

De pompsnelheid van de pomp waarmee het eluens over de kolommen wordt

gepompt bedraagt 0,7 ml/min.

Detectie vindt plaats met een UV-detector, 313 nm. Bij deze golflengte

is de gemiddelde absorptie van de nitro-imidazolen optimaal. Aangezien

bij hoge golflengte stoorpieken vaak minder absorptie vertonen is

na-gegaan of de nitro-imidazolen analoog aan carbadox (Beek, 1988) door

derviatisering met natronloog bij een hogere golflengte absorptie

ver-tonen. Dit bleek helaas niet het geval, zodat bij À=313 nm verder ge

-meten werd.

Aan de hand van het voorschrift voor bepaling van carbadox in vlees (Beek, 1988) wordt (in zijn eenvoudigste vorm weergegeven) de volgende monstervoorbereiding toegepast. Met behulp van een staroaeher vindt

ex-tractie van het vlees met een methanol-acetonitril 1-1 mengsel plaats.

Na centrifugeren wordt het supernatant gezuiverd door het te leiden

over een aluminiumoxide (Al

2

o

5) kolom. Een gedeelte van het eluaat

wordt ingedampt en opgelost in een oplosmiddel dat geschikt is voor

injectie op het HPLC-systeem.

De methode-ontwikkeling valt in de volgende delen uiteen. In hoofdstuk

7.2 wordt beschreven hoe, door wijzigingen in voornamelijk de

monster-voorbewerking het signaal van de stoorcomponenten in het chromatagram

onevenredig sterk kan worden verlaagd in vergelijking met het signaal

opconcentreringskolom gelntroduceerd. In hoofdstuk 7.4 is beschreven waar de stoorcomponenten vandaan komen en hoe deze, door combinatie van de opconcentreringskolom en verdere verbeteringen van de monster-voorbewerking uit het chromatagram verwijderd kunnen worden. In hoofdstuk 7.5 wordt beschreven hoe de reeoverles van de

nitro-imidazolen en de hydroxymetaboliet, die in hoofdstuk 7.4 erg

laag bleken te zijn verhoogd kunnen worden. In hoofdstuk 7.6 wordt hier verder op ingegaan, maar dan weer zonder opconcentreringskolom. In dit deel van dit hoofdstuk wordt de methode die het best voldoet besproken en getest op lineariteit en recovery.

N.B. Overal waar in dit hoofdstuk nitro-imidazolen als verzamelgroep wordt genoemd, worden ronidazol, dimetridazol, hun gemeenschappelijke

hydroxymetaboliet en ipronidazol bedoeld.

7.2 Monstervoorbewerking

7.2.1 Hethode

De HPLC-condities in hoofdstuk 7.1 genoemd, zijn specifiek uitgezocht voor de nitro-imidazolen. De monstervoorbewerking daarentegen is ge

-richt op de analyse van carbadox. Daarom is geprobeerd de monstervoor-bewerking te optimaliseren voor de nitro-imidazolen. De veranderingen

die aan de monstervoorbereiding zijn verricht staan weergegeven in ta

-bel 2.

Tabel 2. Veranderingen in de monstervoorbewerking

Verandering 1 hoeveelheid Al

2

o

1 2 hoeveelheid florlsil

3 fractie eluaat

4

hoeveelheid iso-octaan

5 oplosmiddel (van ingedampte

fractie) 6 injectievolume 7 eluens Type 2 g, 4 g, 8 g 0 g' 2 g 0-2 ml, 2-4 ml, 4-6 ml, 6-8 ml, 10-20 ml, 0-10 ml, 0-20 ml - ml, 2 ml

millipore-water, 1% HAc-opl., tot 1, 0 ml, 1, 5 ml

100 )11, 200 IJl KH₂Po

6, 0,25 H-acetonitril 800-200,

-28-De volgende werk\o~ijze is betracht:

- 10 g gemalen vlees spiken met een kleine hoeveelheid standaardoplos-sing van êên van de nitro-imidazolen (pg/ml water)

- extraheren (m.b.v. stomacher) met 40 ml acetonitril-methanol 1-1

0 - centrifugeren 10 minuten, 2000 rpm, 10 C

- supernatant elueren over Al

2

o

3-florisil-kolom

0

- opgevangen fracties indampen (waterbad 40 C, N

2-gas) tot circa 0,8 ml in een puntbuis

- aanvullen tot 1,0 ml (evt. uitschudden met iso-octaan) -waterige fase filteren met een 0,45 pm acrodisc

-injectie op het HPLC-systeem, genoemd in H7.1.

NB

- bij bepaling van verlies van stoormatrix wordt niet gespiked - bij bepaling van het gedrag van de nitro-imidazolen tijdens de

op-werking wordt geen vlees geäxtraheerd

Dit houdt dus in dat aan 40 ml acetonitelt-methanol 1-1 alleen een standaardoplossing van êên van de nitro-imidazolen wordt toegevoegd.

7.2.2 Resultaten en interpretatie

ad 1 verandering in hoeveelheid AL 2

o

3

Bij het gebruik van 2g, 4g en 8g AL

2

o

3 zijn de piekhoogtes van de

ni-tro-imidazolen en de metaboliet gelijk. De verbindingen elueren dus ongehinderd door de Al

2

o

3-kolom. Ervan uitgaande dat de AL2

o

3 wel vleesmatrix remt (zichtbaar op de kolom, ervaring RIKILT-medewerkers) wordt gekozen voor het gebruik van 8g Al

2

o

3. Wanneer meer AL2

o

3 wordt

gebruikt duurt de elutie te lang en treedt teveel verlies van eluaat op.

ad 2 verandering in hoeveelheid florisil

Wanneer naast 8g AL

2

o

3 nog 2g florisil aan de AL2

o

3-kolom wordt toege-voegd, treedt geen verlies van nitro-imidazolen of de metaboliet op.

Ervan uitgaande dat florisil wel vleesmatrix remt (zichtbaar op de

ko-lom, ervaring RIKILT-medewerkers) wordt in het vervolg 2g florisil

ad 3 opgevangen fractie

Aangezien bij 1 al bleek dat Al

2

o

3 en florisil de nitro-imidazolen niet remmen maakt het voor de opbrengst niet uit \oielke fractie wordt opgevangen. Voor een zo laag mogelijke detectiegrens echter, moet het eluaat zo groot mogelijk zijn (dan immers hogere eindconcentratie in

de eindoplossing). Hierbij is 10 ml eluaat het maximale volume in

verband met indampsnelheid en de hoeveelheid water die in het eluaat

(van het vlees afkomstig) aanwezig is.

Bij vleesmonsters die niet waren gespiked bleek de eluaatfractie 10-20 ml minder stoorpieken te geven dan 0-10 ml. Uiteraard gaf 2 ml eluaat nog minder stoorpieken aangezien de concentratie stoorcomponen-ten in 10 ml ingedampte fractie hoger is dan in 2 ml logedampte

fractie.

De eindconcentratie van de nitro-imidazolen is dan echter te laag, om tot gehaltes in ~g/kg vlees aan te kunnen tonen. In het vervolg wordt van het eluaat de fractie 10-20 ml ingedampt.

ad 4 verandering in hoeveelheid iso-octaan

Het gebruik van iso-octaan is erg belangrijk voor verwijdering van een

aantal stoorpieken (apolaire bestanddelen uit het vlees). Het blijkt

echter wel zo te zijn dat er een klein verlies van het apolaire ipro-nidazol optreedt. Om de betrouwbaarheid van de methode te verhogen (dat wil zeggen minder stoorpieken, dus minder kans dat deze onder de nitro-imidazolen vallen) wordt in het vervolg steeds uitgeschud met 2 ml iso-octaan.

ad 5 verandering in oplosmiddel

Wanneer in plaats van millipare water de tot 0,8 ml ingedampte

oplos-sing wordt opgelost in een 1% HAC-oplossing is, bij gebruik van

iso-octaan, de recovery van ipronidazol hoger.

Verder heeft het gebruik van de zure oplossing weinig effect op de

stoorpieken; deze geven een wat lager signaal, maar zijn nog steeds

allemaal aanwezig. Ter verhoging van de opbrengst van vooral

ipronida-zol wordt de zure oplossing gebruikt voor oplossing van het ingedampte

eluaat. Wanneer in plaats van tot 1,0 ml wordt opgelost tot 1,5 ml is

de scheiding tussen iso-octaan en de waterige fase beter. In het ver-volg wordt daarom tot 1,5 ml opgelost.

-30-In figuur 5 en 6 is het effect van het gebruik van iso-octaan en HAc

weergegeven. ' l j

I

u

L .

.

Figuur 5

gespiked vleesmonster met

ca 60 ppb metaboliet

fractie 0-10 rul, A=0,01

opgelost in 1% HAC,

uitgeschud met iso-octaan

inj. volume 100 ml

...

""'

·~

2

~ V ;t .• : 'l: ' Figuur 6

gespiked vleesmonster met

n 60 ppb metaboliet

fractie 0-10 ml, A=O,Ol

opgelost in water

ad 6 verandering van het injectievolume

Zolang er nog teveel stoorpieken zijn is de detectiegrens van de

ni-tro-imidazolen niet goed te bepalen. vergroten van het injectievolume

heeft geen zin; stoorpieken geven een evenredig hoger signaal.

ad 7 verandering van het eluens

Wanneer het eluens polairder wordt gemaakt krijgen zowel de stoorpie

-ken als de signalen van de nitro-imidazolen een langere retentietijd.

Door wijziging van het eluens kunnen de stoorpieken en de signalen van de nitro-imidazolen niet gescheiden worden. In het vervolg zal daarom

nog steeds het eluens 800-200 worden gebruikt.

Algemene opmerkingen

Indampen tot droog heeft verlaging van de opbrengst nitro-imidazolen tot gevolg en moet voorkomen worden. De puntbuizen zijn niet allemaal gelijk, zodat oplossen tot precies 1,5 ml bij gebruik van deze buizen

niet goed mogelijk is.

De temperatuur van het waterbad moet ten hoogste 40 i 45°C zijn, bij hogere temperaturen is de opbrengst nitro-imidazolen lager.

Wanneer alle wijzigingen hier genoemd bij de monstervoorbewerking wor

-den toegepast blijkt de methode nog niet geschikt te zijn voor de

ana-lyse van lage gehalten nitro-imidazolen. De twee grootste nadelen aan deze methode zijn:

- In het chramatogram zijn nog teveel stoorpieken aanwezig, die vooral

ronidazol, de hydroxymetaboliet en dimetridazol storen. De

stoorpie-ken zijn vooral in het begin van het chromatagram (tot tR = 6 minu-ten) aanwezig. De verbindingen die deze stoorsignalen geven zijn dus

vrij polair.

- De detectiegrens dat wil zeggen de laagste concentratie waarbij de nitro-imidazolen nog analyseerbaar zijn, is te hoog (circa 100 ppb).

Omdat de stoorsignalen niet altijd even hoog zijn is de piekhoogte

van de nitro-imidazolen onbetrouwbaar. Het is onbekend in hoeverre die piekhoogte op de plaats van bijvoorbeeld ronidazal wordt veroor

I

I

\

Figuur 7

I

~

-32-blanco vleesmonster fractie 10-20 ml A=O,OOS, inj. volume 100 ml opge-lost in 1%HAC, uitgeschud met iso-octaan.

7.3 Opconcentreren

7.3.1 Methode

Om tegemoet te komen aan de nadelen van de methode genoemd in 7.2 is het gebruik van een opconcentreringskolom geïntroduceerd (H 4.4 : on-line monstervoorbereiding). In dit bijvakonderzoek heeft de opconcen-treringskolom de volgende functies:

- extra zuivering van het monster

De koloo~en die zijn getest staan weergegeven in tabel 3. In tabel 4 zijn de geteste spoeloplossingen weergegeven.

Tabel 3 Geteste kolommen

Naam van de kolom Kenmerken

1. Partisil ODS-3 deeltjesgrootte= 53 ~~ ID= 2,1 mm, L= 10 mm

2. Bond a pak C18-Corasil deeltjesgrootte= 37-50 ~~ ID= 2,1 mm, L= 10 nun

3. XAD-4 deeltjesgroot te= 50-100 ~~ ID= 2,1 mm, L= 10 mm

4. PRP ID= 2,1 mm, L= 10 mm

5. Bondapak C18-Corasil deeltjesgrootte= 37-50 ~~ ID= 3 mm, L= 600

6. SEPPAK C18 afgedicht met 20 ~ frits, ID= 3 mm, L= 600

Tabel 4 Geteste spoeloplossingen

Spoeloplossing 1. millipore-water 2. zoutoplossing (1%, 10%) 3. \olaterige oplossing, pH 4 4. \olaterige oplossing, pH 8 5. 0,25 M KH 2

Po

4-oplossing

Van de kolommen is met verschillende spoeloplossingen het doorbraakvo-lume bepaald. Dit is gedaan door de spoeloplossing direct naar de de

-tectiekolom te sturen en na te gaan wanneer de nitro-imidazolen waar

-van 2 rul wordt geïnjecteerd op het HPLC-systeem, met de spoeloplossing mee-elueren. Daarnaast is nagegaan in hoeverre stoorcomponenten sn el-ler mee-elueren met de spoeloplossing. Op deze wijze kan de optimale spoeltijd met de meest geschikte kolom en spoeloplossing worden be-paald.

mm mm

-34

-7.3.2 Resultaten en interpretatie

In eerste instantie zijn de kleine opconcentreringskolommetjes (nr. 1,

2, 3 en 4 in tabel 3) getest met millipare water als spoeloplossing.

Het doorbraakvolume van Partisil ODS-3 was heel erg kort; de nitro-i

-midazolen elueerden vrijwel direct met het water mee. Bij gebruik van de Bondapak C18 en XAD-4 kolom duurde het langer voordat de nitro

-imi-dazolen mee-elueerden, maar toch te kort om te kunnen spoelen. Van de-ze vier kolommen was de PRP wat betreft het doorslagvolume van de ni

-tro-imidazolen het beste. Echter, de kolom bleek erg aspecifiek te

zijn; de stoorcomponenten werden eveneens geabsorbeerd. Het gebruik van andere spoeloplossingen had geen effect.

Wanneer het switchsysteem werd opgezet (dat wil zeggen eerst

spoel-oplossing over de opconcentreringskolom naar afvalvat, dan eluens over de opconcentreringskolom naar analysekolom) bleken de stoorcomponenten onveranderd aanwezig te zijn. Hieruit is geconcludeerd dat het gebruik van fifin van bovengenoemde opconcentreringskolommen geen zin heeft.

Omdat het injectievolume erg groot is (2 ml) is nagegaan of de kolom

-metjes wel genoeg capaciteit hadden. Bij gebruik van een grotere Bon-dapak C18 Corasil-kolom is het doorbraakvolume inderdaad groter. In

het vervolg is een injectievolume van 1 ml gehanteerd.

Bij gebruik van een SEPPAK C18 kolom bleek het doorbraakvolume erg

groot te zijn (figuur 8). Helaas was deze kolom ook niet erg

speci-fiek. Gebruik van andere spoeloplossingen dan millipare water had een kleiner doorbraakvolume tot gevolg (figuur 9).

Uiteindelijk zijn aan de hand van bovengenoemde resultaten de volgende conclusies getrokken.

Van de geteste kolommen voldoet de SEPPAK C18 kolom het beste. Om-dat deze kolom niet zo specifiek is voor de nitro-imidazolen, heeft

het gebruik van deze kolom als belangrijkste functie opconcentre-ren.

Wanneer 1 ml wordt geïnjecteerd en er 6 minuten spoeloplossing over de opconcentreringskolom naar het afvalvat (speelduur bij pompsnel-heid van spoeloplossing 0,5 ml/minuut is 4 minuten) wordt gezonden en vervolgens 3 minuten eluens over de opconcentreringskolom naar de analysekolom wordt gezonden (switch 6-9) treedt geen groot ver

-lies op van de nitro-imidazolen. In het vervolg wordt deze switch

Door introdutie van de opconcentreringskolom zijn de stoorpieken

nog steeds niet uit het chromatogram verdwenen. Deze zullen door

wijzigingen in de monstervoorbewerking uit de te injecteren

oplossing verwijderd moeten worden.

Figuur 8: Doorbraakvolume voor ronidazol (0,05 ~g/ml)

inj. vol: 1 ml opconcentreringskolom: SEPPAK

c

18 3x600 ·f> _!,lC.Ve.t-Sf.>Oetcrp/_ .

t

':>t(A~ ~ ~roe !.opL : ~.":,~Ie K. ""~ rz.

eH

,;:_

T

1

Figuur 9. Doorbraakvolumes voor metaboliet (0,007 ~g/ml)

inj. vol: 1 rnl opconcentreringskolorn: Bondapak

c

18 3x600

f

~tc~'<e..t ~ (X .:e LC:'(J L . ·~· C..ft~ lv:•,lL-epi.

I

.

I

I

-36-7.4 Monstervoorbereiding II 7.4.1 Methode

Aangezien de stoorcomponenten zo hardnekkig aanwezig bleven in het

chromatogram, is eerst nagegaan waar deze stoorcomponenten vandaan

kwamen. Door te beginnen met injectie van een 1% HAc-oplossing en

steeds een stap terug in de opwerking erbij uit te voeren is gekeken

bij welke stappen in de monsteropwerking meer stoorplekken in het

chromatogram ontstonden. De twee verantwoordelijke componenten in de opwerking bleken Al

2

o

3 en het vlees te zijn.

Hanneer de chromatogrammen van de fractie 0-10 ml en 10-20 ml van

alleen chemicaliën worden vergeleken is de fractie 10-20 ml schoner.

Door de Al

2

o

3 eerst te cleanen met 300 ml methanol geeft de fractie

0-10 ml hetzelfde chromatogram als de fractie 10-20 rol (figuur 10)

(cleanen: elutie van 300 ml methanol over de Al

2

o

3 kolom, de Al2

o

3

drogen bij 110°C).

Fractie 0-10 ml Fractie 10-20 ml

Figuur 10. Blanco chemicaliën, 8 g Al

2

o

3

+

2 g florisil,

extractie-middel MeOH-acetonitril 1-1

Opconc. kolom: SEPPAK

c

18, 4 minuten spoelen met water, inj. volume 1 ml

Het verwijderen van stoorcomponenten afkomstig uit het vlees gaf gro-tere problemen. Door veranderingen in de monstervoorbewerking en ana-lysecondities is getracht deze stoorcomponenten te verwijderen uit het chromatogram. Zie tabel 5.

Tabel 5 Veranderingen in de methode verandering in

1. type Al 0

2.

hoeveel~efd

_{Al 20f} 3. hoeveelheid Flox sil 4. extractie 5. golflengte 6. uitschudoplossing 7. hoeveelheid iso-octaan 8. volume eindoplossing 9. centrifugeren voor scheiding waterige fase-lso-octaanfase 10.eluens 11.spoeltijd type

neutraal, basisch, zuur 4 g, 8 g 1 g, 2 g acetonitril-methanol 1-1 mengsel 0.25 ~1 KH 2Po4-oplossing dichloormethaan 310 nm - 350 nm iso-octaan, tolueen 2 ml, 2,5 ml 2,0 ml, 2,5 ml 5 minuten 2000 rpm, 10 minuten 2000 rpm KH 2Po6 0,25 M - acetonitril 800-200, 820-180, 850-150 1 minuut - 5 minuten

De volgende werkwijze is betracht: - 10 g gemalen vlees spiken

- extraheren met 40 ml acetonitril-methanol 1-1 - centrifugeren 10 minuten (2000 rpm, 10°C) - supernatant elueren over Al

2

o

3-Florisil kolom

- de fractie 10-20 ml opvangen, indampen in puntbuis tot circa 0,8 ml

( water b d a 40°C, N )

2-gas

- aanvullen tot 2 ml met 1% HAC-oplossing - uitschudden met iso-octaan

- waterige fase filtreren met een 0,45 ~m acrodisc - injectie 1 ml