Het voltamperometrisch gedrag van oestrogenen

(1)

Afd. Additieven 1981-12-23

VERSLAG 82.4 pr.nr. 505.0620

Onderwerp: Het voltamperometrisch gedrag van oestrogenen.

Verzendlijst: direkteur, direktie VKA, sektorhoofd (3x), afdeling Additieven (10x), afd. Normalisatie (Humme), projekt-beheer, afd. Contaminanten, afd. Diergeneesmiddelen

(2)

VERSLAG 82.4

Project: Ont1dkkeling methoden voor het aantonen en bepalen van hormonen.

Onderwerp: Het voltamperometrtsch gedrag van oestrogenen.

Doel:

Het bepalen van het voltamperometrisch gedrag van dienestrol diace-taat, diethylstilbestrol, oestron, oestriol, oestradiol-17B en hexe-strol.

Samenvatting:

Voor bovengenoemde stoffen werden vol tamperagrammen samengesteld uit me-tingen bij diskrete spanningen, dit om het voltamperometrisch gedrag in vloeistofstromen zoals gebruikelijk bij LC-EC vast te leggen.

De metingen werden uitgevoerd m.b.v. een opstelling bestaande uit een HPLC-vloeistofleveringssysteem, een amperometrische doorstroomcel, een voedings en meetapparaat en een 10 V recorder.

Voor DES, oestriol en hexestrol geschiedde dit in een vloeistofstroom bestaande uit 45% acetonitril en 55% water, voor oestron, oestradiol 17B en dienestroldiacetaat was dit 10% acetonitril en 90% water.

Alle onderzochte verbindingen bleken vanaf een bepaalde spanning elek-trochemisch actief te zijn. Door de meetspanning te varieren kan in bepaalde gevallen gediscrimineerd worden tussen de verschillende ver-bindingen.

De resultaten voor dit onderzoek zijn van belang voor LC-EC bepaling voor deze verbindingen.

Conclusie:

De genoemde oestrogenen zijn voltamperometrisch detecteerbaar.

Verantwoordelijk: W.G. de Ruig

Medewerkers/Samenstellers: A.G. van Leeuwen, T.D.B. van der Struijs

(3)

Het onderzoek naar groeibevorderende middelen met hormonale tolerking is in de eerste plaats gericht geweest op diethylstilbestrol (DES).

Het is echter gewenst ook andere anabolica te kunnen bepalen, alsmede mengsels van verschillende anabolica.

Aangezien vele van deze stoffen (m.n. de oestrogenen) elektrochemisch actief zijn, kunnen zij d.m.v. oxidatieve voltamperametrie gedetec-teerd tolorden.

Een aantrekkelijke uitvoering is eerst een scheiding toe te passen met hoge drukvloeistofchromatografie direct gevolgd door voltamperome-trische detectie in een doorstroomcel (LC-ECD).

Het is hierbij noodzakelijk het elektrochemisch gedrag voor de te be-palen verbindingen te kennen, d.w.z. te weten vanaf welke spanning de oxidatie reactie plaats vindt en men een stroomsignaal kan verwachten. Deze relatie kan uitgezet worden in een z.g. voltamagram (stroomsterk-te vs spanning).

Dit schept tevens de mogelijkheid tot een additionele identificatie. Het onderscheid tussen de verschillende anabolica komt in de LC-ECD allereerst tot uiting in verschillen in retentietijden op de HPLC

ko-lom, tolaardoor de verschillende anabolica na elkaar van de kolom

geëlueerd tolorden en dus na elkaar in de tijd gedetecteerd tolorden. Door de spanning tussen de elektroden te variëren kan men echter bovendien nagaan bij to~elke spanning nog een signaal verkregen wordt en aan de hand van de voltamagrammen besluiten tot een bepaalde verbinding.

Uitvoering

In het hier beschreven onderzoek to~erd het elektrochemisch gedrag in een doorstroomcel bepaald van de volgende anabolica: diethylstilbe-strol, hexestrol, dienestroldiacetaat, oestriol, oestron en oestra-diol-17B.

Als doorstroomcel tolerd gekozen de Metrohn EA 1098/2. Deze is weliswaar minder gevoelig dan de t-1etrohm E 656, maar deze waren reeds in gebruik voor het LC-ECD hormonenonderzoek en de resultaten verkregen met de EA 1098/2 zijn zonder meer overdraagbaar op andere doorstroomcellen met dezelfde electroden.

Als voedings- en meetapparaat to~erd gebruikt de PAR 174 "polarographic analyzer".

(4)

Nadat met deze apparatuur ervaring 1-1as opgedaan werd een methode

ont-wikkeld ter bepaling van het voltamperometrisch gedrag van anabolica

die is beschreven in RIKILT Intern Voorschrift nr. G 207, en die als

bijlage bij dit rapport gevoegd is.

Het bleek i.v.m. de oplosbaarheid van de diverse anabolica noodzake-lijk met verschillende elutie/ oplosmiddelen te werken.

Voor DES, oestriol en hexestrol werd gebruikt een mengsel van 45% ace -tonitril en 55% water, voor oestron, oestradiol-17B en dienestroldi

-acetaat 1-1as dit 90% acetonitril en 10% water.

De resultaten zijn weergegeven in de tabellen 1 en 2 en grafisch uit

-gezet in de grafieken 1 en 2.

Conclusie

De gebruikte anabolica zijn voltamperometrisch detecteerbaar.

De detectie voor DES en oestriol is gevoeliger dan die voor de overige

middelen.

(5)

-- 3

-Intern analysevoorschrift nr.G 207 (1e oplage (1982-01-13)

De bepaling van het voltamperometrisch gedrag van de anabolica.

1. Doel

Met behulp van een flow injectie systeem wordt het ele ktroche-misch gedrag van groeibevorderende middelen met hormonale wer-king in vloeistofstromen bepaald.

2. Toepassingsgebied

Deze methode is geschikt voor de bepaling van het elektroch e-misch gedrag van standaardoplossingen.

3. Principe

Een hoeveelheid standaardoplossing 1wrdt in een vloeistofstroom geinjecteerd. De stroomsterkte wordt bij bepaalde spanning t.o.v. de referentie elektrode gemeten.

Deze metingen worden bij verschillende spanningen t.o.v.de r e-ferentie elektrode uitgevoerd zodat een "voltamogram" van deze stof uitgezet kan worden.

4. Reagentia

4.1 Filters van Hillipore type FH en HA (0,45 )..lm) Cl 5 cm. 4.2 \·later (bidest).

4.3 Acetonitril Lichrosolv Merck no. 30. 4.4 Lithiumperchloraat p.a. Merck n. 10538.

4.5.1 Eluens A: Los 2 g Lithiumperchloraat op in 900 ml bidest en voeg 100 ml acetonitril toe en homogeniseer deze op-lossing.

10% acetonitril: 90% water.

4.5.2 Eluens B: Los 2 g Lithiumperchloraat op in 100 ml bidest en voeg dit bij 900 ml acetonitril en homogeniseer deze oplossing.

90% acetonitril: 10% water.

Filtreer onder vakuum deze oplossing voor gebruik over een filter type FH.

(6)

4.5.3 Eluens C: Filtreer onder vakuum 550 rul eluens A over een filter type HA en daarna '•50 rul eluens B over een filter ty-pe FH en homogeniseer deze oplossing onder vakuum. 45% acetonitril: 55% water.

4.6 Methanol p.a. Merck no. 6009.

4.7 Lithiumchloride p.a. Merck no. 5679.

4.7.2 3 M lithiumchloride: Weeg 12,7 g lithiumchloride af en los op in 100 rul methanol.

4.8.1 Diethylstilbestrol (DES) Ken K no. 11005 4.8.2 1 rog DES/ml eluens C

4.8.3 0,1 mg DES/ml eluens C

4.9.1 Hexestrol

4.9.2 1 mg hexestrol/ml eluens C

Los 100 mg DES op in 100 ml eluens

c.

Verdun 10 ml oplossing (4.8.2) naar 100 ml met eluens C. K en K no. 15529

Los 100 mg hexestrol op in 100 ml eluens C

4.9.3 0,1 mg hexestrol/ml eluens C: Verdun 10 ml oplossing (4.9.2) naar 100 ml eluens C 4.10.1 Oestriol 4.10.2 1 mg oestriol/ml eluens C 4.10.3 0,1 mg oestriol/ml eluens C 4.11.1 Oestron 4.11.2 1 mg oestron/rul eluens B

4.11.3 0,1 rug oestron/rol eluens B

4.12.1 Oestradiol-17B

4.12.2 1 rug oestradiol-17B/rul eluens B

4.12.3 0,1 rug oestradiol-17B/rul

Nerck no. 3727

Los 100 mg oestriol op in 100 rul eluens C

Verdun 10 rul oplossing (4.10.2) naar 100 rul met eluens C

Herck no. 8966

Los 100 rug oestron op in 100 ml eluens B

Verdun 10 rul oplossing (4.11.2) naar 100 rul met eluens B

Herck no. 8964

Los 100 rug oestradiol op in 100 ml eluens B

Verdun 10 rul oplossing (4.12.3)

eluens B naar 100 ml met eluens B

4.13.1 Dienestrol diacetaat Ken K no. 5856

4.13.2 1 mg dienestrol diacetaat/rul: Los 100 mg dienestrol diacetaat eluens B

4.13.3 0,1 rug dienestrol diace-taat/rul eluens B

824.4

op in 100 ml eluens B

Verdun 10 ml oplossing (4.13.2) naar 100 ml met eluens B

(7)

-- 5

-5. Apparatuur

5.1 Polarographic analyzer b.v. PAR 174.

5.2 Elektrochemische detectorcel Metrohm EA 1098/2.

5.3 2 mini glassy-carbon-electroden EA 286/1.

5.4 1 zilver/zilverchloride elektrode EA 444.

5.5 Injektieblok Metrohm EA 1099.

5.6 Vloeistof leverings systeem Waters M45.

5.7 Recorder Servogor Z10.

5.8 Laboratoriumglaswerk.

5.9 Vakuumpomp.

5.10 Pipetten.

6. Werkwijze

6.1 Instelling polaragraaf en recorder

Polarographic analyzer PAR 174:

Operating mode DC

Current range Keybord

0,05 m A

INIT

Low pass filter: 0,3

Selector Recorder Servogor Z10 volle schaal papiersnelheid 6.2 Beschrijving analysegang external cell 10 V 2 cm/min

Leid door de doorstroomcel een eluens met een debiet van 1

ml/min waarvan de samenstelling gelijk is aan die van de te

onderzoeken verbinding.

Voor DES, oestriol en hexestrol bestaat de vloeistofstroom uit

45% acetonitril en 55% water, voor oestron, oestradiol-17B en

dienestrol diacetaat uit 10% acetonitril en 90% water.

Injecteer 10 ~1 van een 0,1 mg/ml standaard oplossing in de

vloeistofst room.

Meet na het injecteren de piekhoogte (stroomsterkte) bij een

(8)

Verhoog* nu de spanning met 0,100 Volt naar 0,200 Volt t.o.v.

de referentie elektrode en herhaal de meting.

Blijf de spanning t.o.v. de referentie elektrode met stappen

van 0, 100 Volt verhogen tot er geen piek vergroting meer

op-treedt of tot een spanning bereikt is die groter is dan 1,9

Volt t.o.v. de referentie elektrode.

Maak, voordat deze metingen voor een 0,1 mg/ml standaard oplossing

worden herhaald, de twee glassy carbon elektroden schoon met een

Kleenex tissue en ververs de oplossing (4.7.2) van de

referen-tie elektrode.

7. Berekening

824.6

De piekhoogten van de 0,1 mg/ml standaard oplossingen (tabel 1

en 2) worden uitgezet tegen de spanning t.o.v. de referentie

elektrode in t1o1ee grafieken nl. gebruikmakend van eluens A in

grafiek 1 en eluens B in grafiek 2.

*

Deze werkto~ijze to~erd gekozen i.v.m. de bij het RIKILT aamo1ezige

apparatuur.

(9)

-- 7

-Tabel I. Piekhoogte uitgezet tegen de spanning bij oestrogen en opge

-lost in eluens

c.

V (Volt) t.o.v. DES Oestriol Hexestrol

ref. elektrode piekhoogte piekhoogte piekhoogte

(cm)

0,3 0,4 0,22 0,5 0,89 0,02 0,6 2,83 0,60 0,31 0,7 6,56 2,93 1,11 0,8 11, 78 6, 73 2,48 0,9 14,98 9,64 3,96 1, 0 16,80 13,25 5,55 1,1 17,45 14,84 6,31 1,2 17, 70 16,10 7,10 1,3 17,18 17, 73 7,31 1,4 17,05 1,5 16, 70 1,6 1, 7 1, 8

(10)

Tabel II. Piekhoogte uitgezet tegen de spanning bij oestrogen en

opge-lost in eluens B.

V (Volt) t.o.v. Oestron Oestradiol-17B Dienestrol

diace-ref. elektrode piekhoogte piekhoogte taat piekhoogte

(cm) (cm) (cm) 0,4 0,5 0,6 0,14 0,7 0, L19 0,8 1,23 0,35 0,9 2,27 1,33 1 '0 3,61 2,84 1' 1 4,50 3, 74 1' 2 5,56 4, 71 0,08 1,3 7' 11 5,58 0,44 1,4 8,40 6,36 1' 76 1,5 9,35 7,32 3,44 1,6 9,80 7,59 4,68 1,7 9,84 7' 76 5, 76 1' 8 7,16 1,9 8,56 824.8

(11)

· ₁₎ Grafiek I

-P

~

ekb.o

_:_._:·

~

e.:t...e...

_{:: ·:}_._:_:cm _{::: TJI.} _l_'lilll_ti_!!I'₁_'!₁_·:qj:l_{l· .. : .}-:":":T Jr.r.ïï"' ·- ..

,-:-:-ffiï:r.--

r·

.

l

'!!!I' 'I 1'!''11:;: I! ;I I'I:Jliiiii~·JII ," '' ''·11 'i' ol,j. ' 11:' :11: I ~"! I jll~ 111![ I;;

· ·.. : .. ! ::: :::: : 111 ! 1 ltl !l!J ::! ! 1!:: I: 1 ~ 1.:. · . . 11: · . " . : '[' 1:! Ji,: ~ Dl..!!,_: ~im·

.

·'

.

..

I !-i 1 · • . " 1 ~$ 11 r 11!:: 11 1 "

~

,

_i

"

· y:::

_I_{. .}

:

_.

:::i:

_{. ,}_....

:

;;

:'1

_{I I}1

~1

₁

tm

_...

1

₁₁*+,1 ₁₁₁_!!!ITITIHT:Htii,· _!_.,_,1 _._{I I I · "}

J'T

ii

,

1

::i; ::

_, _..

·.·.

:·

-~:

_.

1 :

_{I, ,}

i

r

:

:;~wi ~:~

_,_, _" _.,_I_{I .}

ï,·!

_,

i

_!/[JjiJ; lil

~:11::

_1,1

·

1

_.l.

;;.,·

;

.

_I_,

·:

:·.:.

_,_,

~

_,

·;;::::..8'

_,,_,_,_._,_,,_-.,.

l-li'i' ~~

_L:.!.J._I

~

_I:_1.j

~'i~

_{" ,}

-

_,

~,

,~

₁₁ :_.·_,j11_I1 _,:

r

I

i

_•

!

_;

i

L

l!

_{I_}

~~ .... 1 .. Jllr· .• , ''rl 'I IJ :!'' I lil·· 'I .. .... 1'1' ,. ,, ,.,

I

I Jll·" ', ... I''' I , I'''''" '"11'-o..• ,, '"" '''I til I ,,++ ' . rrrrr . I" ,,';~·: .:·, :•:,1: :i •t: \!, t 1;:• • I! II ;,:•:•: ;:1; ::• • I ' ' ,j ' t jj J! 1 , ;• tl •: tl!ll:l ' ~~~~1::~ .•: :t:J'' ;!1 1,1 l!J: ! • 1 • ll.LJ, 1 ... :::: .. ;;; '·!..::

·'··Hffi

..

,l ...

~~"

..

.rl!ll

t ....

. , .

.

..

.

i

L

..

,

.

..

1.1.1 ... lillf!J1.,1.

1

11 1 11

,1Hw

.··1

:

··'

· J

· :·l;n·~

·~· .11_

11 ~L

1 .

m

.

11

'

;.:.:

mh

· '

hf.

ll

;J -li·j ' · ' . .. · ·· •· :r,,.' '' ··· r.+. ' ·•· '

TITf

' 11 • I'

m

Tfj

'I

'

I

n ' '

I

'

I I

I

rr1/, : 11 . ITril·'I '

I

'

n

: ' r

il

1 1

i

I'I''' ' ' ' 1

'rr

• '

·

'1

'

lt

I!1 • . . m !.!:. ': 16 1 ..

::·

=

.:

.~~

:

;::·:

;~;

:·

::

:

1

: : .. , 1"; l. diethylstilbestrol

~:

:;.; I ·

!

·

I!.:IJ ·· ... :1:; ·

:!hii:·

·

11

.1.:

1 ,I :IJ. r-

~

1· . ·1 "l'l: Classy carbon elektrode t.o.v.

1

.. " ... I .... ' .. I ' ' " ~

I

:

''I ~

n

1 !

I'

I ~' ' n: 1j

l

I' jl! ~ '

li

l

I

'

'i ' :

!l

l

:

:\i

lil: ' :

~I

'

I : 11

lfl!

I

H

l ' L .

i

'!

i

'lnt

!Hl]~~

~:~~

.l@m

Htl

~11Di

rm

'!!illlmlt!TI~

.

r~

1

1 ,1~11!

!i

i

l

li!li~I

IIIÎ

,11

i

!ltn

~ I~L

f

J

Ag/ AgCl

3

M LiCl in methanol.

1 ,:.

:

,:

_.:

:

.

~

:

:L

~

,

~!:

'i:

i

::!

1

I!

lll1111 ; 1 1

i"

J;

:

:_

i

1

:1JJ

J

~Jl

Wil, 1 11 , 1 i 1 1 1

r

d 1 i 1 futq" 1!! 111 . i

~11

1 1,

!

1: 1 , . . . 1 . . , lTIT lTTT • 111 ., 11 . lliTH " 11 11 1

1- ... ... , ... ti+ I' · 1 1! f.i:t

i

·++

rfi-;-n

f;'ri :!!1 11₁_· _·_• _• _· ₁ _· _. _Hf, hï , _·1:! _. ·.:r _I! _. _· _· _lf_..

fm

1::::!·:::: : ::::::

· :::!i:!~

.:

11i

,H-j

iJ!

:11: HU

! I !i i i Hi!

r

il

I

il:l . +I

%

11 ti

I

~

liL I

·ll: !

• l

· llli

tl

~

ll!!f:

i

lllr!l

rHt

r·

lllh

11.

r I .r .

l.l

lllH

.

ff

t

TI

1

4 , ... ... , .... ... , .... 'j!l 'I~ :1'1

'm

"ll

I I

:Tl,

.

I 'lil

lj:l

I

'I I 'I'. ' . 1!,. I" 11

tf

lf

lil'

'

I

J'

i! l ,. .. . . 1 . '. .

f

'

.

ml

m

tt lt ti

'

:::::!::.~1>:~:~ :~~;~

;~

~

!.;

~

llr~-·1

I. ;1!1 I

~!

Jl

i!!

_.::

;

'I

'

i! 11; •1.111! .1!1 . Til ' I I!!

~

I . I

· ~:![I

I . : .. . . I

!

,.

.

llrr rt 11 tf

':'·:::": ::·::: .. : :::lj::::HII:

r

I

r;:-;1

1'

'

I

:tii

!Ij! lmllf'! yrr+

m

v

HtrHii

I

'

r!T

I! 1!1 I

·r

r

t ... . J .

H

l

r

I

i

'·:+

.

-:::::::::::

::

:(.::

::11

ll

t '

:

.l

I

'!

'!:

::.:::::::

:

I:!!:

i!

!/111::11[1 I . I

'~

I

11 ' I . .:. 1-. . . I,

I '

11 . :

~

_·_{· "·.. · ..}

,q.

' I

:·":

_'' _·_.._·.

1

_..

:

.

·:.1

_{il - ·}" .. "

:

;

1:

_1.11ljI~!' l! jlllil l 11 I! 11111'!I:.' I _._{I ..}1 ' ij',!!' :: _.1 _{·• .• '}·"' :r: I " ·:_f';:i!· . _I. "I

'i!

1111

t

:

'

11·

I

!111~11!!1

'

i~

l

1

1 1!1 I L

I

r ll! . ' .· ·11, L L I I .

-~li

I!

'

~I

t~11li~~ml

I .

W r ' ' . • · · I j·

12

1

::>:::::

· :::!::::

::::r!!ll

':!'

!_!1:%

1~ m,~i

!i i

!

liTll!~

;

:;

l

:~!

1 _

:

!11111fu

.

I

.

1 I

I

m

11 I

11_

t

. : _

.. :

· .

.

''!

1.

n

J!,

11 i I

!

l!li

i

tl~~

~

::::1:::_" _,₁_,_.._,: _{.. ,}:!:11 _11111...

!1

!1_"tl!!l!_i_l:·j;j _I_:~tjjj!fjj _+;-_I _~!li!_Lro.i!!!_•_lillljrnl_":lj _'I!1_f-~11 _,il_.!li_{I , (.;}l•llf_._!',~l _I

m

f_~~il 11 _• · _. _• 1': _,_._• ji _• ~- ·. . , _.

;Tl}~

_.._.._,_{.. .}_.

Çl:~,

_{I ..}:! _ll..

;

.

₁

:!ll

_\!I _I;

·!!·

_1:

t

_, lmt,,:!

,·r::,·.tm:

:

i

i!:,

· n,~

I

I!

i 1'1,'1 ' ! I •

I

oestriol

r

I

· I

I

In . : ... ·, : . . ·. 11

11

111· I' ; 11

1 I .. . I I 11, , . , I,. . I I .. , .-" , , I /I llt ' 1 1111

~.:

::

,:::=u:::;:

::·,!l:!

:

i

,:!!Pr,~~

Jr:iH*'!i

I

:1;

!11:

i'·i

:li

~

'

]

l

'

"·tul'4:1~

-

~ln

lrln~•~

.

_..

~

m~~

f

~

.

u:

·

1,.,

fLfJ

-

1!

..

-_

...

_

.1.

I ·.

~~ni1 ~,,

11111!'1-n

I · · ·. -· · ·' · ·. " -·· · ·'I' ... " I -• " ' ' • .I ' '' T"" I . 'I I • • " ' ,., , " ' ' ' . _ I. . . ." . . I ' • ·I r Ll lt I i! ,._ ' ~ ll lil 11 I i . . 11 11 11

, ... , .. ,. T:;iilf i~··" I p; , .. fll'' ,. I . I I , I! .. . . I fT

. . : .. <I:' '1.

! :

:

J

::

I

mtmit

'

!

I

d!! :! ! :

L

i:: i ; 'i: ::

L

Jn

I

I,

J

I! I!

'

ITI

_

I

.

r

1

I ' '

r

llJllt lil u .

.

'

I

u

.

tl

w

1

1 rn

[

d

·"

1 ₀

I :

:~~JT

t:!:

:

~~ !!!1

~

!

ilil

!i

i!

I

lil!

:ji!Jill !!!

i

::!iliii

il!!

i

!

W'ilili;

~

-

''

~

'dil

@I

ITI

· II '

r

Ir

'

l

~~~

~!! ll!lll

11 .

I

m

i

q

I. .

m

·

1 w

I ï

IPI1

1

î-

11 ~

i

I!

d

. .

.

f

tffilTillltiii~IIIIIIMil!r

.

l

i%r

_::

,

_'

... "

_::i:

_::::

'11_::i:11 _i,, _!_!_I_.1!_i1111:1• if.ll:!!ll!+i-;,

l

il

iR

mr

.

'

·ltt

I' Tl'

11-r

ll

fl

rrr

l

n

r

T

1~1

I!

'11

.

ttl . I ' lil

i! I:!!! lH I lil' I

i!

i! ' ! I i~!

l ;

'

I I 11 ' '.I I' I I :! I ,I i i . . I fl . . . . . . I :

... ₁... ,.

1

.. !'lill ~ il4! n'IIIU 11 , :l!ti·:: 111

m

·

~ ~- 1 11 f

j

H"

.

,

.

·

u~

1

~ 11 ..

rn

,

~:!.L

::::

~~

;

1

4 ~- il

· r

:

J

mT!I': :

i!l~

~''u

lj

.

l

Al-1"'1 1

/

.:J.

::,

.

·

1

p .

· i

·

.r: . · . 'n.· · ··. . I . .H . · 1ft- ,

~~~

Wl

: ... ! :::: ,·::::

:::! ;

i' I ; I I I I lil' I'!'

rrrt

rl:

:

l: 111111 :'I'

I

m

I

'

I' j

I

I '[i

I

.

r

l

r

]

'

.

. .

l

r

I

.

n

I I tl 1'11:1.!:1 111tJ ll11 H .

8 ... p ... ··~ •. I{ ' I ,!L ,!., I. 11 •. I . . , 1 I I - I ' I . . ... . I

.·=

· 1 :

_.

· ,

_{. .}

:

:t::W

_.._.._._{'. 11}1i• i _.1 _,1 lll!lU. !I l~~~~~~~t'l1 • q 1 Ll~· · ljt~.ü.!.:.l!. ::II;!W1. ,!;,;! '1' 1 . 1j!1 .11 !~~1 ~~

Jil

U

1

u

'l

.

i' ~ 1.1 11 1 , 11111111 · • ~.r ~ ·. =trt .t .. ·.1 11 t , . ·

n

:t

.

l'lll'llrlll'l

~

·

:· .. ·; I ! : ; ' ,. 'I' I ft T ' •'\!:: "ITIIIi: !i1 ', '

r

T . · ·

:.

1:-

1,

!Jii:h::lrmr

ITr:

1 1

Hl

.111

!1::

l!

:

d:"'

ll

z

llil

·

111 U

:

J

llf..

..

llrrr

I

IT

'

[

1

~~

11 .

[

· tt

llir

f

-

~'

11

I

..

,

1.

tH+Httt+-t+tttttttltttttttttlr!ffilri±Ht. --

~

r-

tttt

·

Httt. H:iit!

· .iftt:t

1 iiltttt1

]#llJ lil I-Hi

l

i Hl

1 :11+~®.1

1-tu

HIT~Il

I

Nlm

Jiillf~Jtll

l

lltlll

. . . H . i I JIJ I"IIII:LIIIH'II':fl'jf'+'j''nj•Wt·1'rHj'TtWULWUWUIUUIW

6 _ . .

₁

1. 1 · 11 . .IJ

11

t~ lul1itl iHit1:1 :1htt litJJmttH±ttttt! Hli ttf

w

ttitt-Httt'!H.rr.

.

r

~u

.

J:·[Jl ~ftTITiffllj.'

.

flli!

-

~j-llill

• .

l

ll1t1lnl

l~~lln

1 ji

~W~t='

F!

1 .

.

J

.

'

Hill

.

:f

i

~~

-

f

.l

lll[tnllill!~Wr

·

· .htll,l

Til,.

~

drrm

~

m

=

,I.m.,

mn.

rmmmrmnmmm.

1 I

Ir

1 nrrr

hl

:111

rrnrrmm

·•:u T.W'I'IIIT

I

IHil~~

;

..

~

,

)1!:

i)

I!!

'

IH~

1Ilj

1

li.hffi!

'i

4i~

11

1HJlLj

-#I

~

!.~

W!fm:!~

1ffi

'

~

1:

1

t

~

I· .

mrr

IT '."

.

1

j1

I!

I

~111

r

1

· ·.

_

I

±t-

· r

I

i' .. ·· 11

I!

_

fl1_i

TI

I

ij

'1

1..

.

. .

.

IT

.

m··

·

. .. 1 , . . 1 .11.11.

11 o~Grtittrn

1 :,,

1

1 1,,

J

l

1

,

J

,

₁

!

!lil

1 11 1 111 11.

I!

.

1 :1.

:

~:t

I!II'J'r 1:_1_

1

11 .

r

ll'l

!

2 · .. . . : : : .. ! I : : 1 • : : • 1 :J. -I i! i! : : I : : · · . · 1 : 1 : ! /: . , I ." , .1 il I : I 1 11 U · 1 11 1'1 1 I lil :-1 l! · · ll• · r-... -..

1 .

.

'1' ... ~

1

.. 1'1"". :~:~·~· 11:\11''1

Til!

l/

:

·l

l

·

· w

~~~:""'

·

r-r

1

-~~~~~~~

1

· • r

₁

1.1:·1 -- · [ 11-· · -1 -r1 ~ 1-1 11 ttn1 · -, 1 1-

J

1.: .. =l 1:11 rn-:wr1:n

mw-1 .. ::: ... :

:i

:

>f

::~4!.8

;r

~H r1i1'iE: \{:i\:11!1v~ iJ:·r~ l ~ 111 1111 11 . . ~ 1!. •

1:r

t

11 11 !~ ,,,., 1

ii,!l

₁₁

h

1 1. • · , , ·. ~ 1:: t!J.lll~l1

1

mm!+1

..

.

..

l

:

.

r

=·

· :t

.

..

.

~:,

..

:

..

:,

..

!Piiini~~

....

n

l

:

lm

nn!J.:

i:l

:

ri:

Y. ::I~:

Zl

,~:l.

nrr~!

n

1

1 -"

1 · !!J. . 1r

~

h

r.11

H!

l

l!!l!!l!nTimrmi

·'"

1

1r I fl ,

dtltllillil

illlillllilli

"lllllii. IF/ "!ji""IJ:"'I'./.

tll!'l

I n

lllif!

1! fl!i I

I

.

11 r '111

H

I ~--::r'jl!iiiiDll rrl+l-llf>rtluwr·j"n: lt ~'):~J:m u.ml

(12)

r

₁

1 :

;;:::;:

:~;;;~:::

:

;

::

11j

11 ;,,::il'l!.l

l

llil

:::

· l·i

:

.

::;

1 ;;;

:

'::.: ·,·:":

::

r

i

!

:::

· ;;:

:i

;

;;r

::i!ï

iii

ll

tw''

!

'UlJ

n

1 1i!

1!\IIP!:Ij:':'lii!!l·:d

ll!'

!

lj!ttiJ

11~

11!1!

:w

ili

I

!lJ

1 1~!!!

I

l~

l:

Glassy carbon elektrode t.o.V.

l:

:

..

·::r· !

::fu

·:l

:·;rmtl!i''tttt! .. l 11 I

.!

~-;

i!!:J:.:~

... ;. :;:. ·i·· : :. :; ' .:_:

~+r.

rnr· :'

Jhll

iT IT.-:

ji)p:~

l'llj!!r I kt

I

tj., pl!-i

r,lp

TI

n,

TI

ni:

:-;~r:.:-

:

:n: ..

;;l·~b.

'I' t I

l

'l

j

·1·,,·1

r,d,

1

::::!!"I!"! :iÏ :j·:

jliill

jll!

',

:

!

'll•l,lrr ,.,

''P •::1 t '1'1

·:·1

i'!' i

I

!lP,: I ;I: I ,.

11 ' ' .

dao/~"""1

3

M LiCl in methanol

I: ... I ':: : • : : : : : : ; i': I ; t; I. ' . .. ' :

lil!!:!

.

I :: I!:: : :' :':I . i 11.:: t ; .. . I '~ ' ' " • . . • • ' • • •

ll

I • - . .n.o. ..n.o~ •

16 'T1:L:

;;;

:

;:;<;:,

1 ,

;1

i

!i

,

ui

,;ii

lill'!lUP

!!l

!l

l:n:·::iill:l!

id!ll!!! i!!:

i~!~

wm,,;

.

'l

il

n

1

!!il'l;

1:1,

441~l

~ii

"Wl

i

_IU1l

1

il.l-l

i , , , :

1 :,

..

:

"~;"

~·:

:-;.:

,.

:

:"

d,,,, ,,

:-:-rr ·;..

₁₁

nn,

.. ":: .. · · . :. :

r

. ,

·.

:: ·.

1

t 1

~11:

1 1_ , :..

11 :

· ; ;

i:

1: 1! i , 11! . 1

r

1

11!

!

1

111 111

11

1 ,

· ,

.

11

rrr

u

111 nu u

'

111

r:

11,, m1

rnn:

r,

!I

lil!,

.!

l!

TIJT ,

rr

.

1!1111:

1

111

r:::1r"

11!!

~

111 1

m

.

11 :

· :

:::

:··

)1, ";

. "

..

1

• ::

1 .

11 ,

11

Ulllll!l

11 ummrlill

:ii:~:!:!

:!r!:!:ti

1:!

:1

:

1ii

:11:

1!

:!

!illULl!l!.'1

i~~IW,l

W,li!

illll

llUlll11l

ill11

1U

1 ~llli

~+~

u

1 ,

11 81r

m

· ,;'

₁

;

'

u

· . -

_

.

i

f*u

u

IM . , .11

·. J1

lll

.

UltJI-llillJ

fi!:JH

J

i!:

r~

; :

:rm

:::tiTITI

tJNITIT

1Illili1

,

..

1

11

1

11 i:

f!,

'1

',

11

!

1 11

'1..

llil

w

11

llilll

n

~~

u

'

u

:

w

11, i 1

williD

I' 1

u, '

,

l . " - , • - • ..

~

L!l .. ·

u

~

14

:~:

::

r:Jr~

_

rnr,

w

TIJJrJIITI!I:l

!li!

::t

J!

.

Ji!l!Jili'IHu1!

1 ~nw'H' ~

-

w

:i::

.,

ill~'u

'il!~!Jllll~,,r

1 r

1 l1.111

tlllllllllllllll

~

1

111

· J

1_

11

u

.

,

1

1 n!.,

1 ·~~:1'!r:'

1 w:''''

,~1.1

rm

11 n

.

,

H

lilli

Pt

I

,

.

,.

'11'''1

T

..

1

·Ï:l ti ..

,l,rrlmrft11Jll

··l·

· t,

l,t,

'11:

:I

jl

n

Hl

.

iH

m

l+i+:,rjr

I

.

irj

I

'

I

lH

lj]·l

t

I

~

I

I i

'I'

r

Ir

t!·

.

rjffi

,mi

1t

11 1 I

10 :

· ·:!:::.

:

::,::;

,

ll1

lli:i

r ii

ii

I:.!I!IH

!, ,

r

i!!:

:

1

!i!

i:!i

i

r

i. I I 11 I 1 lil! rl I !1,! .. 1 i ! ,11 oes ron - . 11 , ! I 1 •

11 .

,

i i lillil .:

11

I · , I !

!

....

, ..

.

:I' . ! !

"rl

'I ;

11!

1 !

I I I t ' lil'! "I !

I':

Ij'! l '., .

U

i

l

I 11'

I

I 11!!' I 1 !I

lil'

· n

-

.111!

1 '

'1

n

I

I! ll !

11 .

.

. -

.

1 'llil J 11111 :I I

tn

I u

I

l:ttiiiiJ

.

-

I I 'I

!)

~

'!

{

l~;'~

::

:i

fii·!;:l4;ii.i!l!fm+:

'

Ufi~::~

:rl

;l'r'hlJI!:rl,

'

-

'

I,_,

·'~

ld

!i

h

!!

lffil

ill

_

'''.

:·

· '

-i ·

'

1:'irt~!!.!'

.

il_i

-r IJIH'.·' . - -.

,r;ii!

, .... l ...

rn

..

....

,In,,

ll•r IU!!Imr,,l ' i ,rr, :!"·' ITIT!:!il

!!

··

!p

i

l!!

Jin,

-

l 11=·-

I'''

lllr! ,!I 11

,r

IT

n- 1 - . . tI Tl'·l!·

llHi

:

1

~ rrJJII!:Ij .

I

:u,

':.:.!::'.! ... ::.:.: ; :I I . 1 U_: ·li. ! lli!! ; : . :I I.!: ::I! p: I lil I " I I ~~ : d r-1 I~ •· 11 I 11:.,. f: I 11 I · ' I I 11 . ,. . 1 I . .~! ·~· . "I ., 11 n ,. 1 ::I

"'"""'"'I'" 1

J

't

!t8''1!"i!

'

ll

~~

'lrrl

• p

11 q·~·

'

:jll'!l

'

''11"111 ~IUU

-

IJ·- ,:llliHm

'ljj

I

.

r

··

- .

111 '

I nlll ï! ITI . jli

l

rJI r- . .

tl'11,ill

.~:~:~~~~i:~~~::i:.'

iil

::::

'_

:

H:

l!!.;..lii'i1~~'ITffi·i]!::i: iJ~~l~'

!!

i

:'i:::li,

1.r.~: 4 • 1·

.[Jl'! _

1

, . ~'' : . . ~ . -~ _

1

i1n ''·

w

.

,

11 111 • · - - , '''i~

... ,J .... j .... r::;-1 .... 'i·fttinljj

!!

I

jl!Ti1Ti

r

1

,fl

1

jiflnit

l

1

t

'Ijl 11

n-

·n,l1

I ' lT· I 11 - . ii!UIIj!lllj I

!I'

lliJTl

-

..

._

.

jl!llt1_1!!

:·:::::"i· .::::.l:::iH:I!!!l I. . 1 ••

1 ! i

!i; :!i: i.i!

:!r

i!r 1 !1 .1! 111 · I 1:1 1 1 Ir 1 ,i ,!Y,rd : . 11.. , I ,· lillil !I :1 ; I , :,11 1- ·I - I d 1 ..

8 '.;.

:

.;:::!:

:

..

,,

:::~

!i

iH!!!'III

!

îll

l

!l

ill' ,.,,,

W'

;;J!

'I

·I ·lij

:·

,,I

lilijl

Ir

I'

,

-

.

dHf.ll'

11.,,

·

1 1:

'

i(!:JI I' iÏ . I·. . -·,

j

r.. î!llj,

t·m

Jr

~

.

lil

'J

I·

-

;

-

--

.

,

rH11L

, .. ::':~!~ .! : ""l~t"lj]

...

ll!JI I ~

*

L ' E . ~' 11 ' t 11 . Ui I!! I I ' [I~~~' . . I ~ t ' I I. ' ' . I 1111

I.H:

d::f:mTI~!ii

!

Tiii

iil!.

iiil

llliWii

11!

!::!

r

~

ttrr'tm

iTIT!

1 ilr 'I

-1

!!'I

11 ll

,liL

,m

~d!

i[if

,rr

~~

·

11 .

· , .

·

=· _:-

i'

.ITfllri

.

llr.

.

· 1!·.

'j., . .. :

J

llil

bJ;

j]U

!i1!jjji

J!J!JllJ

!ill

1

· !:!1 !!i

..

ll

i!li!il l

i

ij

:!i

lllli;!tllill

11 ~

-

-·

j

.

1

_{1_1}

I!

1

1 _illlll

_:

BJ

~

I

JJ

!

1

_l_._!_{!_i}

1

_J.i1'1·_"'\"9_r[_{_}_{_}

I!

· : .:

:

'.

· · ·

··

·~~

-

I

!I!

_j:jj

_-

_{: _}

_...

· ~

-

,

_'

_,

_·

_{· -·}

_·

_;

_{_·}

_-

_J{

rlli

'11. ' ... I'

'

I"

·

1 .. '11' I" lj'l mrt

n

·,

l

++rt

:-rft,,+J' m

1 t

rj:-

· r.!

'l

i

11!

11 :I

lt

,,

r

l

lriT~

11111+1

fiW

W'

.,

'OI.> .. . -11 11 . I :1 .

u

.

ttt

6 1·:.:.:!:: !d: !i!!

:::

:r!

:!l,

!:Hili .11

i!!l

iir

!

li

l::

;,

..

1

ll 1

_r,r

_·_u· ~l _!

_!

_'"

_'

_·

₁

_,.

1 " I ~:1' ,

0"Y · - -_ : · qy11 . ·

1-:

·

11 · r: :.~ · :.· .. :· · · .· ~-Jj_

i

·

_._;:

.:

:

_:;

;::::

_:.!.:~I;::

,

::::!::

_:_'~-~:

:

::

_:;±·

:

.

r-

:!:

_..

_{r ...}

:r:qJn,

_·i~

_....

-

,nm

_,

,~n

i!'

!

i!

!

iii'!H

~-n itt,:ltJ.t

Ir

-t

-

1 .

_

,il!'

-

·

T Y,niW~' f(i'~ o.~

..

:

..

.

· ;:

.

· .-

:_

-: -

.

·r

-

:- .-

-

: .

.

·. .

~-

.

uu

lttJ

1. !:1_ ~•t_.

1

.

r

IIH . , r .

r

'lH .·

•.

'

-:;,~

.

₀ .

1 .

,

.

l'.. lll~ . .. .. .. ' .. I ·] ' . .. ..; :1; r;: rT;l I ! i F'L 'I' I !I f - -

I!

I

!

11 : ! 11. ' I ' I I ~ )(., . . qy . . . . .

r

.

ï I ! I t-1

J::,

:

:::

:

,::.!.:::: :1_!1_:!i:llii_l_n·,l!

:!TI

I

'

1i1i :::;

_i.lr

_:

_.TI

_111:

1 I

l!m

I

lilll

·

11

I '

1 ~

:

I

1:/.: oe 11 . - 1 ..

-i7

r

.

I

i1TITI

-

lllli

u

ili

..

_{·: •}

..

_..

'J

_;_:

'

_:_·::;::

"'

''""

_·_:_::·:-~u_:1 :'r' 1 _•_:;

I

n

_{r ''}

· _·'

t!l'

_rl

_I:,:

tt

_•

-lUl! _U

I

$

_:

'

_·

,

1

;

_:

...

_:1

,

,,

..

I' I' 11'

1

~H

rrrr

-

,

r

I~ i'!l~. I ljll

·rllll!ü

11! - 1!/.1.• - . . I

n

·-

.

-

.

ITillUmitm

' ~-f I' :' 1, 111 .~~,- 111 i 1 I' I ;

lt! ;

~

"r

r

1 • · 1 ~+'

...

.·

-

· ·-

· -

·

1 · ' i

• , • • • • • • ~ o o , • • I I o o I • 1 • * f t o 0 • I • I • ~~ I -' 11 ' t • ~ ..J. - 7 ,~I I o o I o t T

,. ·:;::·T~

·:

·:::

:

1

::::

_~_•_{• ;-;-;}

::

i;

_;,

;;:~:;~:

_" _...._f.l _"·_·_I_!!! _{' .,}₀_'j_~_' _' _!!_I_r _~

n

.

..

rt

•

_I! _. _{_--} I 0 . . . .

:uî!

-

li!!

rif:

lil

:l::

i!!

:

i!l!mn

d I;

lfl'r+.-

~

Jli I

IY.i

.

ili

11;

lli!!

lJit

·I

I. .

~

'OI,o.ç .f

R

111

I '

u

-

n

I I

.i!

f . I n

dfffi

lnTtiliH

} ; .. ":1""

'

"

'1~

-

·

1 " " "

'!~

''' '!L!'I~"

'"'"'1'''[11

11 tt·,

111"

lf:ffi

ttll!

t ; I'' :!

I

"11

'

!

'I

~

-

.

"fp . - . 11 I tr·-

!f·

.

u

r~

1

•

1 n

· lfU!lli'l'llU

..., ... . .. , .... '" .. , '" r I 11 I• ' ' ' ''1!1_;11: 1_' _' _- _·_' _~" _' _r_: _. _"" _{! i ·} _· _I