Bepaling van chlooramfenicol in diervoeders met polarografie en LCEC

(1)

r - ·· '

Afdeling Additieven Verslag: 82.86

Datum: 1982-09-20 Pr.nr. 505-0600

Onderwerp: Bepaling van chlooramfenicol in diervoeders met polarogra-fie en LCEC.

Bijlagen: 4.

Verzendlijst: direkteur, direktie VKA, sektorhoofd (3x), afdeling Additieven (8x), afdeling Normalisatie (Humrue), Pro-jektbeheer, projektleider, afdeling Contaminanten, afdeling Diergeneesmiddelen, afdeling Zware Metalen, afdeling Microbiologie.

(2)

(3)

Afdeling Additieven Datum: 1982-09-20

VERSLAG: 82.86 Pr.nr. 505.0600

Projekt: Ontwikkeling methoden voor het aantonen en bepalen van antibiotica.

Onderwerp: Bepaling van chlooramfenicol in diervoeders met polarogra-fie en LCEC.

Bijlagen: 4.

Doel:

Ontwikkelen van een kwantitatieve bepaling van chlooramfenicol in diervoeder m.b.v. LCEC.

Samenvatting:

Er is een bepalingsmethode ontwikkeld voor de bepaling van chlooram-fenicol in diervoeders. In eerste instantie werd er een polaragra-fische methode ontwikkeld, maar na aanschaf van een reduktieve elektrochemische doorstroomcel is de bepalingsmethode aangepast. Het terugv.indingspercentage bedraagt 95% op het 10 mg/kg-50 mg/kg niveau. Met de gebruikte methode is het mogelijk om chlooramfenicolge-haltes van 1 mg/kg en groter in diervoeder te bepalen.

De resultaten van de onderzochte monsters zijn weergegeven in een tabel.

Conclusie:

Voor het kwantitatief bepalen van chlooramfenicol in diervoeders is de redoktleve elektrochemische meetmethode na een vloe istofchromatogra-fische scheiding een goed bruikbare methode. De nieuwe analysemethode is vastgelegd in Intern Analysevoorschrift nr. G 220.

De vier onderzochte monsters (nr. 11821, 27331, 27332 en 27333) bleken na onderzoek chlooramfenicol te bevatten.

Verantwoordelijk: dr W.G. de Ruig

Medewerkers/Samenstellers: H. Hooyerink, Projektleider: dra F.G. Buize~

8286.0

(4)

1. Inleiding

Naar aanleiding van een verzoek van de afdeling microbiologie is er een kwantitatieve bepaling ontwikkeld van chlooramfenicol in diervoe -der.

Dit verslag bevat de analyseresultaten van vier monsters diervoeder, die met behulp van polarografie onderzocht zijn op het chlooramfenicol-gehalte.

2. Methoden van onderzoek

2.1 Monstervoorbereiding

In de literatuur (4.4 en 4.5) werd een tweetal organische oplosmidde-len gevonden met gunstige verdelingsco~ffici~nten voor chlooramfenicol ten opzichte van een ammoniabuffer, te weten ethylacetaat en diethyl -ether.

Er werd onderzoek verricht m.b.v. polarografie naar het terugvindings -percentage met ethylacetaatextraktie en met diethyletherextraktie. De opbrengsten met ethylacetaatextraktie en met diethyletherextraktie liggen tussen de 87 en 105%.

Uit veiligheidsoverwegingen werd gekozen voor extraktie met ethylace-taat.

2.2 Polaragrafische analyse (non-flow)

Voor de polaragrafische analyse werd gebruik gemaakt van een PAR model 303 (statie mercury drop electrode) gekoppeld aan een PAR model 374 (polarographic analyzer).

Er werden een aantal elektrolytoplossingen onderzocht die geschikt zijn voor het meten van chlooramfenicol, te weten een acetaatbuffer pH 4.7, een KCl/HCl buffer pH 2.0 en een NaOH/KCl/boorzuurbuffer pH 8.0 (zie tabel 1).

Omdat in de literatuur (4.1, 4.3 en 4.6) een acetaatbuffer het meest aanbevolen wordt als polaragrafisch medium en bij onderzoek van mon-sters diervoeder geen storingen optraden, werd door ons ook voor een acetaatbuffer gekozen.

De analyseresultaten van de vier monsters polaragrafisch onderzocht staan vermeld in tabel 2. kolom I en II.

(5)

-2.3 HPLC condities

De vloeistofchromatograaf was samengesteld uit een Waters 6000 A vloeistofleveringssysteem, een Valco injektiekraan en een analytische kolom. De stationaire fase bestond uit een Lichrosorb RP 8 kolom. De mobiele fase bestond uit een mengsel van methanol en 0,01 M HClo₄•

2.4 Elektrochemische detektie.

Voor reduktieve elektrochemische detektie werd gebruik gemaakt van een

elektrochemische doorstroom detektor, de PAR model 310, gekoppeld aan een polaragrafische detektor, de PAR model 364.

Van der Lee (4.3) beschrijft een mobiele fase van methanol/0,01 M HCl0₄ (20/80).

Dit eluens moet direkt voor gebruik ontgast worden en door dit eluens

moet voorgezuiverde stikstof geleid worden.

De resultaten van het monsteronderzoek m.b.v. een

vloeistofchromato-graaf gekoppeld aan een elektrochemische detektor (LCEC) staan in tabel 2, kolom III.

3. Resultaten en conclusie

Tabel I. Halfwaardepotentialen chlooramfenicol.

pH Samenstelling Halfwaardepotentiaal chlooramfenicol v.s. Ag/AgCl 2.0 3 M KCl/HCl - 0,15 V 4.7 6,8 g NaAc/3.0 g HAc/liter - 0,31 V 8.0 3 _{H KCl/0,06 H H3Bo3/0,01 N Na OH} - 0,32 V, -0,48 V 8286.2 - 3

(6)

-- 3

-Tabel II. Bepaling van chlooramfenicol in monsters diervoeder m.b.v.

polarografie (kolom I en II) en LCEC (kolom III).

Hooster Chlooramfenicolgehalte nummer p~ 11821 38 27331 19 27332 63 27333 82

*

analyse februari 1982 ** analyse augustus 1982 II* 42 23 80 83 mg/kg III** 26 23 46 60

Kolom I geeft het gehalte chlooramfenicol weer met een

diethyletherex-traktie, kolom II met een ethylacetaatextraktie. Beide gehalten zijn

polaragrafisch bepaald.

Kolom III geeft de resultaten bepaald met behulp van LCEC. Deze

mon-sters zijn opgewerkt volgens Intern Analysevoorschrift G 220.

De resultaten van de polaragrafische methode en de LCEC methode

stem-men redelijk overeen, maar om eventuele storingen te voorkomen is bij

eerstgenoemde methode een chromatografische voorzuivering aan te

beve-len.

De toepassing van de ontwikkelde bepalingsmethode van chlooramfenicol

in diervoeders m.b.v. LCEC is aan te bevelen.

(7)

-- 4

-4. Literatuur

4.1 Application Note, AN III, Princeton Applied Research.

4.2 Model 310, polarographic detector, operating and service manual, Princeton Applied Research.

4.3 J .J . van der Lee, Determination of chloramphenicol and its appli-cation to residues in milk and dairy cows, Proefschrift Rijksuni-versiteit Leiden, 1981.

4.4 Q.R. Bartz, Isolation and characterization of chloromycetin. J. Biol. Chem. 172 (1948), C.A.~, 4233e.

4.5 A. Brunzell, The assay of chloramphenicol in pharmaceutical pre-parations by means of a simple counter current technique.

J. Pharm. Pharmacol. ~ (1956) 329-333, C.A. 50 14179a.

4.6 K. Fossdal enE. Jacobsen, Analytica Chim. Acta~' 105 (1971).

5. Bijlagen

1) Polarogram chlooramfenicol.

2 en 3) Chromatovoltamogrammen chlooramfenicol in diervoeder

+

standaard.

4) Intern Analysevoorschrift G 220.

(8)

.er

cr

0 LJ

-w

ru

0 '

BIJLAGE 1

.a:

r

-.er

I..Ii

:r

.er

J

"

lL

Ul

(9)

I

:

I

,

'

, . I• ' +' I

I'

I I "I ! ' ~ I I !

I

:

'

I

I I' I I I I ~ - -- - - --- --,- - --·-··----'-'- - ' -1'----.---t- - --- ~ '

t-

f

.;

:

i

'

'11₀₀ ₉₀ ₈₀ _,

.'7

o

· _G

_O

o

Jn

-

~0

;

:,i:

_LQ

~-

l

:!l:

~

q

:

li

~

Q

-

_;

_1:0

_!

_.

--

-

---

--

~---~

--'----4---' . , I • : I : • : , • ,. I i • BIJLAGE 2

L

r

: : : I : :

l

I I

:

;

:

I

:

l

:

l

î

:

l

i :

:

;

I

~

;

i

!

i : .

i

: :

'

i

I

:

11 - - -- - -- - - = - -- - - i ' 1 1 ,,: •· I • 1 1 11 11 1 1 •

'

i·j:

·l

::·.

:,\

1

~ ~~ j!•1i ' ' '

1:)Q·t')2.l ;,'I,

I

;

t

''lii,'

'

i;,

I

':!

'

I

!

:

!·jl

!'I

li . I l· 1'1

'

I.

I !

I

~ ~---lc--. ..,...· ..,...;...,....,...--+--- --1-' +-' ~· r--:---,...".._;~·..:..1...;.. : I : : . I I ' I I I I ' ' ' i I ! i . j '_' --,---j~-+----:-,':...-++

~

I . ; :

i

~

.

i

I!

I

! ' . '

i

~

:

!

i

'I

I

i

:

I

i

!

I

!

,'

:

IJ

!

:

i

:

'

I

:

I

i

:

I

' '

: : : :

I

i

~I

I ' i' :. I ! i

I

:

' I : , ! '

I!

'

I I! : I' .' i I '

I

:'

!

I

.I

.

:

!

I

il~~

~

~~

~

~~,~

~

,

~

-

,,

,

,~,·

· ···;

~

:

~~

;

~

.

i

~~

i

~

l

!

+

l

~

:,

~-

41

_i

₊

_i

_~

_i

_~

_!

_~

₁

_~

_l

_~

_''

_~

_l

_~

_-

4

.

+

!

~

i;

~

l,

~

.~

;

~

l

~

:

~

::

-

~

~i

· ~

:

-

· j

~

~I 1\ ' I t i I

:·

I

!;

!

:

I: t ! ' I ,

I::

I

I'

I ' . t , I ~. l '

\.

i.,

'

·,· .. ,,

1; 1 l I

'.I :'

I'

11' I ' I' ' ' I : 1. '1

t:

~~;; I

,

'

:

I 11 I I : ' i i: :

! '

!.

!' '

I ; I I, I t I : I

I

:

I

i

'j

i

!

l ' i ' I I : I I I

'I

I I I; I' ~~

l

I I I

I!

' I ~I :1· · ; I I i

·:··

,

.:,!'1

!

I

i

:j

1

· :li_

q

~

-, j j

!l·

i!

i:

1 !:: .

:i

I

!·

i

· i

I :.

I

(

i

i :,

I

1\) I ' :

I

1 :

I

!

'

!

I '.: ' : l I :

I

'

.

I I : : ' . '

!

:

.

'T

.

I

I i

I

'

!

:!

1:

· ~

: .

1·

1 i

I !- l =i ' l1' , 1

1il

i!

ii

:1

11 ' : 11

!

'i

~~

---~--~

~

--~

~

)

~

:

-+j~

!il

~

+

l

~

l

--+I-

.

·~~~

~

~~

~.

~

-

~~

~~~

~

-

~~-~

.

~

-L,

4 ,

~

,

~

1

4 !

~

i

~

1 ~

i

~

I

~

!

~

'

M!

I

i

~

'

~

i

.~'j

+

,~

,

4 ,

\~

'

-~

~

:, 1 1 ' I

I

1j : ,,1 ·1, 1 1

!

I

:'

::

:,:i,.!

I!

i

I

i

i:

I

i i

!

i

l

i:;

!I : : ! !

:

i

I

·,:::

I

!

:i

~ , : 1 t ! : 1 i 1 ! r . 1 1 ~ 1 1 • l 1 i : ' 1 ;

i,Jc:::....

-~

~

.:-

..

'

,,

,

--

· ~

.

,

.

,

., ..

:

i

'

I

~

;

.

··-1 1 '1 1,

_:

1 ~-

:

:.·

~~

~-·

l':jj

! : i,

I'

i ·

I

_{I :}

,.

1 i

_I

::,

_;I

,

I

1.,

: : _I

~···

_;_I_;

r

_'_{. ...-}

-:·1

_'_'

I

t I' . I I I . I I t . ' ! ' I

I

' .

~

'--~

-

--

-+--

.-

-

~

:

-~-+

~

-~~

· ~:n

'

~

:

++~

~

~~

~

:

~

~~~

-

~

-

~

· ~

'

~

· ~

~~

~

i

H

I

~

I

~

· ~

·~I

+o-

·=~

· ~7

· ,

~

++

j

,- ₉₀ _. I I _' : ' ! . I i i : ' ' I .. ,' : 11 : : _. ' ·, I I '

I

I ' , 'I " ·_ I I I . I

I

'

' '

I

I -~ , , I I ~ .., I , ' ' I , j , , ' , • , , , ~

wo

8,0

i

· to

(

Q

;

/o

₁

~

q

;

·

I

q

· :

i ·

.

;

.;

Q

'!

: :

i

~

1

9 !

,

!

::

,

:

0:

~

'I

;

l

!---·i ---~~==~~-- -t: ----• ----~--+-~~l-~

r

,

---tI ~~; , 7;~~: , ~nH~tT~it~~+;! · :· , - i ' ! - ·· •·~! ~~~it -~

:

---

--

----'-

~

--~-

-

~

·-

--

--t

:

I : 'i : . '

i

.

,,

!

I

i

I

'

I

!

'

[!

I

i

:

~

I : : . .

I!

.

: ;

i

' : I i I . I i : !

i

I

'!.:

i'

I :

I !

!

I

I I

I

i

I i

:

'

I

! ,---~,---~--~,---~--~~~--~---+~--+.~~~---~, ~~--~~~--~~J,+ I ' I

~

' I! ' I' i I

! .

I

;

I

i

'

1 ! 'I '

I

! i ' ; :

I

.

i : I

i

,

I

· ,,

:

i

i',·

i'

I

i

I .

I'

I

:1' I I

I' . :.

I ! : ' , :!

!

' I ' : I , I : ' ! • i : ' i I : I . I I I - L!--!1 I I I '

I

'

i I I' I'

I:

'1:

I

i I I ' :

'I

! I '

I

'

I

i '

i

:

I

! I I I i '

i

!

i

i :

!

i

I

i

I

i

:

!

! .

i

:

i

I : : : ;

I

~

'

!

I

!

I

! I :

l!

!

-~

!

I

'

I I

I

.

'

I ! I :

I·

i : I ' i

I

i

I

l

j

:

i

;

! ;

i

:

i

!

.

'i ;

I

l

!

'

i

!

'i 1 11 :1 I

!

'

I

! ' ...

'

I

'

i i '

'I

I ' ,

I

I'

I I i i I I i I I : I I ;

i;

l

I ' ' I

i:

I I I ' : I 'i I : ;

I

:

i

:

I

\

:

! '

I :

!

:I'

I ; !

i

I

i

i'

i

I 'i I

i!:'

I

;.:

'I i :

:!

I

''I

:I I

l

!

11:

;

'i

i

I

J_;·-J''-'--.l+-1 ----'-. '

~

:

_'

~

+

!

0 ~

,

~

· ~

!

_,_; -'---: 1-+---t-'..J...I ..,...;

----~

·

f-l'-'-: ...!...! .L:

~

i4!-'-:

+1--1--li...LI

I

:

I : :

~

I

::

!I

: : :

;I' :

I

; I

i

~

!

i : I

! : :

i

: : ; :

i

::

oo

90· 3 : ; .' '70 G'O '

i

! I I '

i :

:

{

I 1: : ; 3 0 : :

~

0 :

!

; I 11

Q

I I I ; I ; ~--~'-\--~1 ---+·-· --~~~-~ ~~~~1 --+-~~~--~--++L~ii~'~·+LI~I ~;++~! !~·~--~· ·~·+-~·~·~l-~~--~~:~1

I

""-

l

1

I

~

I

1 :::

ij

~

~~~~~111

·i

r

l

' i

l'

1---L._

:

.

I

l

i

'

!

! ,

I :

I

:

!

i

I 1

~l

·:?i)-11:7" ' : I

.-~

,·

~

1\)

11

i

:1 I I

!

:1 : : '

:!

i:

~I

I : ;

'

i

_ _:

0 :._____Jl:.__ - - -+---..J...I

-~~:4----

----+--'--

--'-i--L

'

; i

!

! I ' I '

!

j : , .

i

I

~--~--

1 _--t--

_--'-1

i

l

. ; -

-'-

'--

!

--!-

!

-

~

i

I : : i

l

I! I

i I'.. ! ! .

i

.~

I ' I . __

,·

f

· ---'---_

'

~i

I

:

-

~

---:-

.-

I ; ' I

I

i

'

l

'

l

ii

L

'

· I r-· :

I

i !

i ;

I

I , : " I

I

'

I

'

:

i

:

.

'

:

I ' . •

!

I

'

• ..

'

I

.

.è

L

.

'

i

~

I

'·

!'

1' ' :

I

:

J

I

i

(

~-

_,~J

~

I

I I :

'i

'

I

.

~ I ! i I ' ' I ' __ ... ! I , :

!

.

I ---~ - -. f---- ---~---...,-, ---~---~-~--··I' .... :-~ -

-:

-

---r---

-

--

-~---'~--- -- - - - + -- - - --- ______ ___,__!! _ _.:... __

l

· -

I

j_

__

_

-

~

--

--!

-~-

-

--L-~

-

-~~

~

-~

-

·

1

_ _ ....~..,___ I I . I \ ' t. I I I I \ . I I

-

--·

- - -

----

--

-;--- ----7-

-

- -

-

-~-

-

----

-

--

· ·-

-

--r--

-;

-

.

...

! I

(10)

: . ·---··~----t ---~, - - - -- ·-1 ; l ! : : I

!

-. --

--=~--...-=-'==..·:..::::::;==:.:-=-:.:::· =~· ==~-

-

--;

----:---

·

Î - - - --- ..

-

--

---

----

---

-

~~

~~~

~

I - - - - -~---·-~__! __ -

----T

I

' BIJLAGE

3

I i i

;p

'

--

-

r

.

-

---

-

--

- - -

;

---

-

---

-

---oo

1Jo

80 70 60 -

~

, 40 30 20 1

o

P

,.

-

:

'

~

· !

:

!

-

---.~

~

=-

---

~

'·

---

· --~i-

~~-

~

· -

--~

· ----~

'

--

-

---

-

---~

I

I I : !

I

:

'I

I ' Î

''1!11

1 ''

',

.

I ''I ' ,· !, I !.. ,, '1·. I

l

I ! :

i

I I : i ' I . .

i

I : . il .

I

il '

I

'

I 11 .,·

i

~

:

I . ' . • i I I I I I I ' '

I

:,

· -

·;

· -!-L

..

:·

---

:

-

,

-

---'

,

-_,..;

!

-:-

:

~

-

:

1-'--.

- ; -i :- . --:;;+1

~

:

--,r----:-

;

..

,

-f-rl

ll

'

-

· ~

~--i--+::

i---+--1

.

--+1-

1 --:-+-

:

-

,

--+__:

:

.

-

.

-

,,r.-

,,

_,...

;

-

:

+,-,

-1'

--+-

,

1

1 ,

---1

'

!

'

I i ' I ' :- I '

I

I I

I

;

i ! I '\..._ 1. 1! •

!

·

I 11'.

:

1!

I i

I

:,

,j .: ' .

!

· 1,

-

--

-

--

-~

==

~==

==-=-=~

· ::::;

'

:::~

· =====

~~

~~~

r--

· t

!

-

~

i

iu~

~

~~

:

L-

-

--

t·-

_,

l

__

-41

__

~~

.--t-

· -

'

~~-~

r-~

:

rl_

··-t-_

_

__

~

)

___

~

;

-~~

:

~

· --l-~

l

___

,

___

r

,

I_

· _,

:

~L~

;

_

· _

· ~

,

I~

~

--

~

~~~

· -~

~

--4~-~~--+--

·~

1 -~~-

'

~

:

_

.

~

I

I ;

i

',

i

I

:

~

.

:

j

I,

~

li 1 1 :

I

\

I 1

!

j _v , 1 ' ; , .. - -,-- ·---'1' - - - " - - ---+---,---- -t-~--+---+---+-...L'I ---~--- t--- - t - --t---+----t----!-- ---i,----t---

-r--'PO

:

rl

p

:

~

o

j :

1 o

,

~o

·I

i

e

0 .

;

'

~

c

I

· o

[

< 1

o

:

1 o

i

c

I

i

'

!

i

!

:

i

'

!

'

I '

I

;

I '

I

: :

i :

!

:

'

i

:

i '

'

!

i

I '

l-

--1---

-t---:

-

-t-I ' I . : I ' I.; '. ' I : ; ! I I r_{_i}_{__}

L_'~....,··c_:

.:

__

~

::.

_

'

î

_

· :~=~=~~~~~;;:~t:

· J

:

1 ~

t

,

~t~t

· ~

~~·

:

!

~

· ~

:

t:t

1 ::

'

t

:rj

1 ~

· =

~~:

1t

,

~t

i

t

.

~

.

î1

:

'

~

· ~--

r

· --~t

~

-. I :I I ! ! I ' ' : ' : I ! i I ' i I ' ! ' • I I ! i ' i I . I .

!

I

:

! 11

i

:

;

:

I

'

I

-- r--' ~ I l, I ' I ;

I

I I i

I

I I • : I : I • i I . I ' ' i I . . i •· I ' i•l i I,

r

- l \ .

-

----

~

!

I

,

l

I

'

I

,

'

,

I

.

'

I I ' •

I

I • :

i

,

I

~-

-:

-

\_____

.

!

i

'

· .

: ; ;

;i

!

i

;

J

8-f--t-;-

· ----+

J

-

--1-;

_____

~

--

~

'

,

-

~--~

;

___

~

;

:

_

· -

· -7~--

_,:

__

1

7 ;

_

,

~

1 _:_

~~~~~~~3~

1 :

~:

_

Ll~

~--

~~----

~

--~~~

~

:

~

'

----~~

-

~-~

~~

--

· -4-~

~-~--l

;

i

___

'

_-r

:

--~

:

-~~---~

~

:

~

1 +-~

~

-~

~~~

· -

· +

i

--

~l

--~

:

--+

!--~

i

~

.

-

·

· _~

j~

1 ---

· --~

~

--~~---

+

I

!

i

:

I ;

;

~

ll

!

:

I

:

I

,

!

I ... ____ __;_I --l---'----~:---.:__--'---J--....L.-~J.--- - J---.,----l---!-1 ---+~' ..,----+----'

--

--,-

'

---+

1 !

o

.

9p

ao

:

io

!

:_

.co

~L

~

~§

T-

d

o

;

l

o

1

~

!

'

lo

,. ' ' I ' I I I

!

I I ; ,. ' i I~

!

I

I I· . 'i ; I !

,

i

I ' ; l :

!

,,~

:

!

'

I

l ' ,; ., I i,

· ~-;---o-

\-

--

---+--~~~

--~

~

~~--7---4'

~

--~--~--~--~--~

~

l

~

l

~

'

~·~

· ~

· --

--~

'

--~--~-: \_ I : ' . , !

:!

•,'

I' ~ ' : '

1 -: .

I · I I ! ' ·

I

~

I I

~

·I

I

;

I • I

I

1 _ _

· ~

-

--~

~

-

~

-

---

--

~

· ~-

· ~i--~

!

~-rl

'

-~

---4~o

i

--~

1-+

l

--i--

~-

~-~

·-~--~-

~

--

;

~

~~

gl I : '

:

I

I ' I

i

!

I I '

~1

---

,

~

~==

~

~~=~

:

~=~

-

=~i; --~

-

~

,

'

ï

i

-rJ

-~

!

.

~

:

.

;

~

:

r

~

· -

:

_~~

i

-

7 i;

r

,l

_

__

· ~

;-

~f-

'

-

~i:

_

T~,

· ---~:

~

-

· --

,

~~

i

~

:

--

~

.;

--~i~~

· ~

~

~~

~

: i

r

:

-

.

---+-

l

--,

j

---'----r;

----:~

;

-~..,...

,'

t--

!

--l

~

---+

~

'

-

· -

--..:

~-

,-r-~

1 ,

-t

-+,

· -

-'-

.

--

i

---+-

1 ~

----l

-·

I ! .

I

I : • • I

(11)

INTERN ANALYSEVOORSCHRIFT NR. G 220. 1e oplage (1982-08-10)

BEPALING VAN CHLOORAJtFENICOL IN DIERVOEDER MET LCEC.

Verzendlijst: afd. Normalisatie/harmonisatie, bibliotheek (15x),·

afd. Additieve~ (10x), ~uizer, afd. Contaminanten,

afd. Diergeneesmiddelen, afd. Zware Met.alen, afd.

l-tfcrob~ologie.

, G220.0

(12)

Intern Analysevoorschrift nr. G 220. 1e oplage (1982-08-10)

Bepaling van chlooramfenicol in diervoeder met LCEC.

1. Inleiding

Het chlooramfenicolgehalte in diervoeder wordt bepaald na extraktie van het diervoeder, door een vloeistofchromatografische scheiding op een C 18 reversedphase kolom gevolgd door elektrochemische detektie.

2. Omvang

Chlooramfenicol wordt uit diervoeder geëxtraheerd met een ammonia-buffer. Na centrifugeren wordt de waterfase uitgeschud met ethylace-taat. De ethylacetaatfase wordt gedroogd en ingedampt. Het extrakt wordt opgelost in de loopvloeistof en gefnjekteerd.

De vloeistofchromatografische scheiding bestaat uit een vloeistofleve-ringssysteem, een injektieblok en twee C 18 reversedphase kolommen: een voorkolom en een analytische kolom.

Het elektrochemische detektiesysteem bestaat uit twee delen:

A.

Het nat-chemische gedeelte: de meetcel, waar zich de elektroden be-vinden.

B. Het elektronische gedeelte: de apparaten voor de levering van de gewenste polarisati~spanning en voor het meten van de stroom. Voor de meting wordt gebruik gemaakt van drie elektroden: een · druppe-lende kwikelektrode als werkelektrode, een platina-elektrode als hulp-elektrode en een Ag/AgCl-elektrode, gevuld met 3M LiCl in methanol, als referentie elektrode.

De elektrische ·stroom wordt over de hulpelektrode gemeten, terwijl de referentie-elektrode er voor zorgt, samen met de potentlostaten van de detektór, dat er een konstante polarisatiespanning is.

De werkpotentiaal is - 500 mV tegen Ag/AgCl/3M LiCl in methanol. De bepaling van chlooramfenicol is gebaseerd op de reduktie van de nitrogroep aan de druppelende kwikelektrode.

(13)

3. Toepassingsgebied

Er wordt een methode beschreven voor de bepaling van chlooramfenjcol in diervoeder, dat ca. 10-250 mg/kg chlooramfenicol bevat.

4. Definitie

Chloorarnfenicol is een antibioticum en wordt gebruikt bij de behande-ling van infektles veroorzaakt door bacteriën en virussen.

5. Struktuurforrnule:

6.·Reagentia en materialen

·Alle reagentia moeten van zodanige kwaliteit zijn, dat er geen interfe-renties optreden.

Gebruik gederoniseerd water (6.13) of water van ten minste gelijke zuiverheid.

6.1 Chloorarnfenicol.

6.1.1 Standaardoplossing chlooramfenicol (1 ~g/~1).

6.2 Methanol (Merck, liChrosolv~ nr.6007)

6.3 Perchloorzuur (Merck, Suprapur art.nr.517)

6.3~1 0.01. M perchlooizuur.

6.3.2 Loopvloeistof. Meng 800 ml 0.01 M perchloorzuur (6.3.1) met 200 ml methanol (6.2).

6.4 Ammoniumchloride (Herck nr.ll43)

(14)

- 3

-6.5 Ammoniumhydroxide (Analar).

6.6. Ammoniabuffer pH 10.

Los 54 gram ammoniumchloride (6.4) op in gedetoniseerd water (6.13). Stel met behulp van ammoniumhydroxide (6.5) de pH in op 10,0 (verbruik ammoniumhydroxide ca. 260 ml) en vul aan met gedetoniseerd water

(6.13) tot 1000 ml.

6.7. Ethylacetaat (Merck no. 9623).

6.8 Lithiumchloride (Merck no. 5679).

6.8.1 3M LiCl in methanol (6.2).

6.9 Natriumsulfaat (Merck no. 6649) .

6.10 2 ml injektiespuit (Terumo) .

6.11 Filters van 1,2 ~m (Gelman Acrodisc). 6.12 Solvent Clarification Kit (Millipore).

6.13 Milli-Q, Reagent-Grade Water Systems (Millipore).

Oplossing 6.3.2 moet iedere dag ontgast worden m.b.v. de Solvent Clarification Kit (6.12).

7. Apparatuur.

7.1 Vloeis~ofleverlngssysteem 6000 A (Waters Associates) 7.2 Injectiekraan (Valco)

·7.3 Polaragrafische detektor. 364 (EG enG PARC)

7.4 Elektrochemische doorstroomdetektor 310 (EG enG PARC)

(15)

4

-7.5 Voorkolom: liChrosorb RP 8,10 J-1, lengte 3 cm,~ 4 mm (Merck). 7.6 Analytische kolom: liChrosorb RP 8, 5 J-1 lengte: 12,5 cm, ~ 4 mm

(Hibar). 7.7 Recorder. 7.8 Centrifuge (3000 rpm). 7.9 Schudwaterbad (100 rpm, temperatuur 60°C). 7.10 Rotavapor (temperatuur 60°C). 7.11 Laboratoriumglaswerk. 8. Herkwijze

8.1 'veeg 10 gram diervoeder af in een erlenmeyer van 250 rol en voeg 50 rol ammoniabuffer (6.6) toe.

8.2 Plaats de erlenmeyer in een schudwaterbad van 60°C gedurende een

uur.

8.3 Breng de vloeistof, na afkoelen, over in een centrifugebuis van 250 ml met enige rol water.

8.4 Centrifugeer en breng daarna de vloeiitoffase via een trechter met glaswol.in een scheitrechter· van 250 rol.

8.5 Extraheèr met 50 ml ethylacetaat (6.7) door gedurende een minuut ~e

schudden. Laat· de waterfase aflopen in een tweede scheitrechter en

herhaal de ·extractie'met. nog eens 50 ml ethylacetaat.

8.6 Verzamel de ethylacetaatfasen en filtreer over natriumsulfaat in een platbodemkolf van· 250 ml en damp met behulp van de rotavapor

droog.

(16)

-- 5

-8.7 Los het residu op in 1000 ~1 loopvloeistof (6.3.2), breng dit in

een 2 ml injektiespuit (6.10), monteer een 1,2 ~m filter (6.11) op de

injectiespuit en injekteer 25 ~1.

9. Instelling apparatuur.

9.1 Vloeistofchromatograaf.

Loopvloeistof: methanol/0.01 M HClo₄ (20/80)

Injectievolume: 25 ~1

Vloeistofsnelheid: 2 ml/min

Recorder: 10 V

Papiersnelheid: 1 cm/min.

9.2 Elektrochemische detektiesysteem.

Operating Mode: Differentlal Pulse

Initia! Potential: -250 mV/Ag/AgCl/LiCl in methanol

Current Range: 50 ~AFS.

10. Berekening.

Vergelijk de gevonden piekhoogte met die van een standaard.

Formule:

El

x S x 01 x 1 p2 02 g ~g/g chlooramfenicol waarin: pl piekhoogte monster in mm p2 piekhoogte standaard in mm S hoeveelheid standaard in ~g