Three-dimensional and molecular analysis of the developing human heart

(1)

UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (https://dare.uva.nl)

UvA-DARE (Digital Academic Repository)

Sizarov, A.

Publication date

2011

Link to publication

Citation for published version (APA):

Sizarov, A. (2011). Three-dimensional and molecular analysis of the developing human heart.

General rights

It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s)

and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open

content license (like Creative Commons).

Disclaimer/Complaints regulations

If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please

let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material

inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask the Library: https://uba.uva.nl/en/contact, or a letter

to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You

will be contacted as soon as possible.

(2)

Summary

/

Samenvatting

(3)

Summary

The heart is a crucial organ ensuring the transport of oxygen and nutrients to the tissues to meet the metabolic demands of the organism. Such transport can be altered not only due to decreased myocardial function, but also due to the malformed cardiovascular anatomy causing hemodynamic changes, which are often incompatible with life. The vast majority of cardiovascular malformations seen in the formed heart are the result of aberrant development of the heart and vessels during the first 8 weeks of the human intrauterine life. The heart is the first functional organ formed in the early embryo. The primitive myocardial heart tube, an important characteristic of which is the virtual complete absence of proliferation, starts to work immediately after its formation to produce peristaltic waves of contractions propelling the blood forward. The heart tube then elongates, loops and differentiates into chamber myocardium at the outer curvature whereas the remaining primary myocardium escapes chamber formation and provides the precursors for the conduction system. The understanding of the morphogenetic processes and their molecular regulation leading to the formation of the four-chambered heart with a conduction system and one-way valves was greatly enhanced due to a large amount of experimental work performed in drosophila, zebrafish, frog, chicken and mouse embryos.

The anatomy of the mouse embryonic heart, which is the most widely used model in modern cardiac embryology, is very similar to the anatomy of the human embryonic heart. Based on the similarities in anatomy, the results of experimental studies on the molecular regulation of the development of the mouse heart are often directly extrapolated to the human situation. However, until very recently almost all studies describing cardiovascular development in man were based on non-specific histological stainings of serial sections of staged human embryos. Given the limited possibilities at that time regarding three-dimensional reconstructions and absence of immunohistochemical stainings, the observations were amazingly correct. Nonetheless, several incorrect conclusions were drawn and these studies have raised much controversy. As modern textbooks on human embryology continue to reprodoce the results of these studies, many incorrect concepts remain to be present in these textbooks, despite a large body of disproving evidence from experimental studies. In this thesis we report the results of three-dimensional and molecular analyses of the human developing heart. Using immunohistochemistry and in situ hybridization we assessed the expression patterns of several transcription factors and other proteins, which are known from experimental studies to be

(4)

summary 145

important for the proper development and function of the embryonic heart. Our studies support the notion that the molecular regulatory mechanisms between mouse and human are conserved.

In chapter 1 an general overview of heart development is given, along with a more detailed review of the development and functional maturation of the conduction system. In this chapter we have included our recent molecular findings in the developing human heart, complementing thus the reviewed knowledge from experimental studies with our gene expression data from the human embryonic and early fetal hearts. In chapter 2 we describe the morphogenetic changes occurring at the venous pole of the heart, from which various congenital malformations and many abnormal rhythms may originate. The three-dimensional analyses using computer-generated reconstructions, along with assessment of the expression patterns of the genes marking the different types of myocardium forming the venous pole, have revealed that in human, as in the mouse, the systemic venous myocardium expresses the transcription factor TBX18, whereas the pulmonary venous myocardium expresses NKX2-5. In contrast to the mouse, we observed a systemic venous sinus upstream from the atrial chambers, albeit initially with non-myocardial walls. From the outset, as in the mouse, the pulmonary vein empties to a chamber with atrial, rather than sinus muscle, characteristics. We conclude, that the similarities in gene expression in the distinctive types of myocardium surrounding the systemic and pulmonary venous tributaries in man and mouse permit extrapolation of the conclusions drawn from transgenic and lineage studies in the mouse to the human, showing that the systemic and pulmonary venous myocardial sleeves are derived from distinct developmental lineages. Our findings lend no support to the notion that the pulmonary myocardium originates from the systemic venous sinus, indicating that another pathogenetic mechanisms are responsible for the arrhythmogenicity within the myocardial sleeves of the pulmonary veins in patients with the paroxysmal atrial fibrillation.

In chapter 3 we studied the morphogenesis, growth and differentiation of the early human embryonic heart. Our three-dimensional analyses of several proliferation and differentiation markers reveal that, as in chicken, human heart formation occurs in two steps, first by addition of cardiomyocytes differentiating from the highly proliferative adjacent coelomic wall to form the heart tube, and then, following a phase of quiescence, by local proliferation and differentiation to form the chambers. The patterns of morphogenesis, growth and gene expression in the early and chamber-forming human heart are comparable to those described for experimental animals, suggesting that the basic morphogenetic and molecular regulatory mechanisms are highly conserved between chicken, mouse and human.

In chapter 4 we have focused on the molecular analysis of the patterning of the conduction tissues in the developing human heart. Using immunohistochemical analyses of the expression of key transcription factors, ion channel HCN4 and connexins, supplemented with

(5)

summary 146

three-dimensional reconstructions of myocardial TBX3 expression, we show that TBX3-positive myocardium escapes further differentiation, as it remains free of fast-conducting connexin40 and -43. In contrast to the mouse, we found expression of fast-conducting connexins on top of the developing ventricular septum, where weak TBX3 expression is present. In the early embryonic heart, the pacemaker channel HCN4 is expressed at the venous pole, including the atrial chambers, and atrioventricular canal, and becomes confined during later developmental stages to the components of the conduction system. Patterns of expression of transcription factors, known from experimental studies to regulate the development of the sinus node and atrioventricular conduction system, are similar in the human and mouse developing hearts, suggesting comparability of mechanisms governing the development of cardiac conduction patterning in human and mouse. Our data about expression of connexins and HCN4 provide a molecular basis for understanding the functioning of the human developing heart prior to formation of a discrete conduction system.

Finally, in chapter 5 we report the results of our combined morphological and molecular analyses of the arterial pole of the developing human heart. Lack of gene expression data in all previous studies on the development of the human outflow tract, along with poor morphological integration of experimental studies, regarding the contribution of the second heart field and the cardiac neural crest, have hindered our understanding of the normal development of this important structure and our understanding of the associated congenital malformations. We show that, during stages 14 through 16, separation of the aortic and pulmonary channels occurs through fusion of the endocardial ridges with each other and additionally with a protrusion of neural crest-derived pharyngeal mesenchyme bordering the distal outflow tract dorsally, which is preceded by remodeling of the aortic sac. Then, the separate walls of the intra-pericardial arterial trunks are formed through addition of mesenchymal cells to the distal outflow tract. The expression patterns of the transcription factors marking specifically the mesenchyme derived from the second heart field, endocardium and migrating neural crest cells, respectively, were shown to be similar to those reported for the mouse, confirming the participation of several tissues with distinct origins in the development of the arterial pole of the human heart.

Several technical limitations are associated with the use of the human embryonic material, such as non-standardized fixation and scarcity of available specimens. These limitations have influenced the quality of some immunohisto-chemical stainings and made it impossible to comprehensively assess the biological variation between multiple embryos within the same developmental stage. Despite these potential problems we were able to achieve reproducible results regarding the expression of some key cardiac genes allowing comparison with gene expression and lineage data from animal experiments and to largely confirm the

(6)

summary 147

assumed conservation of gene expression between human and mouse embryonic hearts. We have limited ourselves to previously published experimental data as inclusion criterion to study the genes reported in this thesis. Of necessity, such an approach has as corollary, that the analysis remains comparative only. Ethical reasons make it almost impossible to use human embryonic material to discover new genes involved in the regulation of cardiac development.

The analysis of development of the valve formation, transformation of the aortic arch system, formation of the coronary circulation and anatomical and molecular maturation of the conduction system in the human heart was not completed during our studies presented in this thesis, but are interesting and important topics of research for the future.

(7)

Samenvatting

Het hart is een essentieel orgaan dat voor het transport van zuurstof en voedingsstoffen zorgt naar de weefsels om aan de metabole behoeften van het organisme te voldoen. Dit transport kan worden verstoord niet alleen door een verminderde hartfunctie, maar ook als gevolg van afwijkingen in de normale anatomie van het hart, die op hun beurt hemodynamische veranderingen kunnen veroorzaken, die vaak niet compatibel zijn met het leven. Het overgrote deel van deze afwijkingen zijn het gevolg van een foute ontwikkeling van hart en grote vaten tijdens de eerste 8 weken van het menselijk intra-uteriene leven.

Het hart is het eerst gevormde functionele orgaan in het vroege embryo. Onmiddellijk na de aanleg van de primitieve myocardiale hartbuis, begint het hart te kloppen. De primitieve hartspier trekt samen in peristaltische golven, waardoor het bloed naar voren wordt gestuwd en het embryo van voedingstoffen wordt voorzien. Vervolgens wordt de hartbuis langer, buigt, een proces dat looping wordt genoemd, en de cellen aan de buitenkant van de gebogen hartbuis differentiëren in kamermyocard, terwijl het overige embryonale, of primaire, myocard grotendeels ontsnapt aan kamervorming, waardoor het de kans krijgt zich te ontwikkelen tot het geleidingssysteem van het hart. Ons begrip van de morfogenetische processen en hun moleculaire regulatie die tot de vorming van het hart met vier kamers en kleppen leidt, is sterk verbeterd door veel experimenteel onderzoek in het fruitvliegje, de zebravis, kikker, kip en muis. De anatomie van het embryonale hart van de muis, dat het meest gebruikte model is in de moderne embryologie van het hart, is zeer vergelijkbaar met de anatomie van het menselijke embryonale hart. Op basis van de overeenkomsten in anatomie, zijn de resultaten van experimentele studies naar de moleculaire regulatie van de ontwikkeling van het muizenhart vaak direct geëxtrapoleerd naar de menselijke situatie. Echter, tot nu toe, waren bijna alle studies die de cardiovasculaire ontwikkeling bij de mens beschrijven, gebaseerd op niet-specifieke histologische kleuringen van seriële coupes van menselijke embryo's. Gezien de beperkte mogelijkheden van de drie-dimensionale reconstructie technieken, die op dat moment in gebruik waren, en de afwezigheid van immunohistochemische kleuringen, waren de beschrijvingen verbazingwekkend correct. Toch was het onvermijdelijk dat een aantal onjuiste conclusies werd getrokken, die op hun beurt weer tot veel controverses geleid hebben. Alle moderne leerboeken over de menselijke embryologie blijven echter de morfologische tekeningen van deze studies weergeven, waardoor onjuiste concepten in deze leerboeken blijven staan, ondanks dat vele experimentele, genetische en moleculaire studies tot andere inzichten hebben geleid. In dit proefschrift beschrijven we de resultaten van driedimensionale en moleculaire analyses van de ontwikkeling van het hart bij de mens. Met behulp van immuno-histochemie en in situ hybridisatie hebben we naar de expressiepatronen van verschillende

(8)

samenvatting 149

transcriptiefactoren en andere eiwitten gekeken, waarvan uit experimentele studies bekend is dat zij een belangrijke rol in de ontwikkeling en de functie van het hart spelen. Onze studies ondersteunen de hypothese dat de moleculaire regulatie mechanismen geconserveerd zijn tussen muis en mens.

In hoofdstuk 1 wordt een algemeen overzicht van de ontwikkeling van het hart gegeven, samen met een meer gedetailleerd overzicht van de ontwikkeling en functionele rijping van het geleidingssysteem. In dit hoofdstuk hebben we onze recente moleculaire bevindingen over de ontwikkeling van het menselijke hart toegevoegd. Zij vormen daarmee een aanvulling op de nieuwe kennis verworven uit de experimentele studies. In hoofdstuk 2 beschrijven we de morfogenetische veranderingen in de veneuze pool van het ontwikkelende hart. De veneuze pool is een complex gebied, dat niet alleen aanleiding geeft tot vele pathologische ritmestoornissen, maar waarvan de ontwikkeling ook vaak niet goed gaat en aanleiding geeft tot verschillende aangeboren afwijkingen. De driedimensionale analyses met behulp van computer-gegenereerde reconstructies, samen met de beoordeling van de expressiepatronen van de genen die de verschillende types van myocard markeren bij de veneuze pool, hebben aangetoond dat bij de mens, net als in de muis, het systemische veneuze myocard de transcriptiefactor TBX18 tot expressie brengt, terwijl in het pulmonale veneuze myocard de transcriptiefactor NKX2-5 tot expressie komt. In tegenstelling tot de muis, hebben we een systemische veneuze sinus gevonden stroomopwaarts van de boezems, zij het dat die aanvankelijk niet-myocardiale wanden heeft. Net als in de muis is de longvene vanaf het begin verbonden met een kamer waarvan de wanden bestaan uit atriaal werkmyocard en niet uit het type myocard dat de sinus venosus omgeeft. Omdat in de muis in deze gebieden hetzelfde patroon van genexpressie is gevonden is het aannemelijk dat de conclusies uit transgene en lineage studies in de muis in het algemeen geëxtrapoleerd mogen worden naar de mens. Dus het is aannemelijk dat ook in de mens het sinus en pulmonale myocard een verschillende ontwikkeling, of lineage, hebben. Onze bevindingen geven geen steun aan de hypothese dat het pulmonale myocard ook van de systemische veneuze sinus afkomstig is en dat deze gemeenschappelijke afkomst de verklaring zou zijn waarom het myocard rondom de longvenen aritmogeen is. Andere pathogenetische mechanismen zijn derhalve verantwoordelijk voor deze ritmestoornissen.

In hoofdstuk 3 onderzochten we de morfogenese, groei en differentiatie van het vroege menselijke embryonale hart. Van onze drie-dimensionale analyse van verschillende proliferatie en differentiatie markers blijkt dat bij de mens, net zoals in kip, het hart zich in twee stappen vormt, eerst door toevoeging van differentiërende cardiomyocyten van de zeer proliferatieve aangrenzende coelomic wand om de hartbuis te vormen, en vervolgens, na een fase van rust, door lokale proliferatie en differentiatie om de kamers te vormen. De patronen

(9)

van morfogenese, groei en genexpressie zijn vergelijkbaar in het vroege en het kamer-vormende menselijke hart met die beschreven voor proefdieren, wat suggereert dat de fundamentele morfogenetische en moleculaire regulerende mechanismen sterk geconserveerd zijn tussen kip, muis en mens.

In hoofdstuk 4 hebben we ons gericht op de moleculaire analyse van de aanleg van de weefsels van het geleidingssysteem tijdens de ontwikkeling van het menselijke hart. Met behulp van immunohistochemische analyses van de expressie van belangrijke transcriptiefactoren, het ionkanaal eiwit HCN4 en gap junction eiwitten (connexines), aangevuld met drie-dimensionale reconstructies van de myocardiale expressie van de transcriptiefactor TBX3, laten we zien dat het TBX3-positieve myocard ontsnapt aan verdere differentiatie, omdat het vrij blijft van de snelgeleidende connexines 40 en 43. In tegenstelling tot de muis, vonden we expressie van snelgeleidende connexines op de top van het ontwikkelende ventriculaire septum, waar ook zwakke TBX3 expressie aanwezig was. In het vroege embryonale hart, komt het pacemaker kanaal HCN4 in de veneuze pool tot expressie, inclusief de boezems en het atrioventriculaire kanaal. In latere ontwikkelingsstadia komt dit kanaal alleen tot expressie in het geleidingssysteem. De patronen van expressie van transcriptiefactoren die van experimentele studies bekend zijn als regulatoren van de ontwikkeling van de sinusknoop en het atrioventriculaire geleiding systeem, zijn vergelijkbaar in het ontwikkelende hart van de mens en de muis, wat suggereert dat de regulatoire mechanismen van de aanleg van het geleidingssysteem vergelijkbaar zijn bij mens en muis. Onze data over de expressie van connexines en HCN4 levert een moleculaire basis op voor het begrijpen van de werking van het menselijke ontwikkelende hart dat nog geen duidelijk geleidingssysteem heeft.

Tenslotte presenteren we in hoofdstuk 5 de resultaten van onze gecombineerde morfologische en moleculaire analyse van de arteriële pool van het ontwikkelende menselijke hart. Afwezigheid van genexpressie data in alle vorige studies naar de ontwikkeling van het menselijke uitstroomkanaal en de slechte morfologische integratie van experimentele studies met betrekking tot de bijdrage van het tweede hartveld en de cardiale neurale lijst, zijn er de oorzaak van dat ons begrip van de normale ontwikkeling van deze belangrijke structuur en de geassocieerde aangeboren afwijkingen beperkt is gebleven. We tonen aan dat gedurende stadia 14 tot en met 16, de scheiding van de aortale en pulmonale kanalen gebeurt door fusie van de endocardiale kussens onderling en met een uitstulping van neurale lijst-afkomstig mesenchym die het distale uitstroomkanaal van dorsaal begrenst. Dit proces wordt door aanzienlijke vormveranderingen van de saccus aorticus voorafgegaan. Vervolgens worden de afzonderlijke wanden van de intrapericardiale arteriële trunci gevormd door toevoeging van mesenchymale cellen aan het distale uitstroomkanaal. De expressiepatronen van de transcriptiefactoren, die het mesenchym afkomstig van het tweede hartveld, het endocard en de

(10)

migrerende neurale lijst cellen markeren, waren vergelijkbaar met die bij de muis. Dit maakt het waarschijnlijk dat de oorsprong van de cellen die deelnemen aan de vorming en septatie van de arteriële pool in de mens dezelfde is.

Het gebruik van menselijke embryonale materiaal is onderhevig aan een aantal beperkingen, zoals niet-gestandaardiseerde fixatie en schaarste van de beschikbare exemplaren. Deze beperkingen hebben invloed op de kwaliteit van sommige immunohistochemische kleuringen en maakte het onmogelijk om de biologische variatie tussen meerdere embryo's uitgebreid te evalueren binnen dezelfde ontwikkelingsfase. Ondanks deze potentiële problemen, waren we in staat om reproduceerbare resultaten te bereiken met betrekking tot de expressie van een aantal belangrijke cardiale genen die met de genexpressie en lineagedata uit dierproeven vergeleken kunnen worden en die grotendeels de veronderstelde conservering van genexpressie in de embryonale hartontwikkeling van mens en muis bevestigen. We hebben ons beperkt tot eerder gepubliceerde experimentele gegevens als inclusie criterium voor de studie van de genen beschreven in dit proefschrift. Noodzakelijkerwijs heeft een dergelijke aanpak tot gevolg dat onze studie een vergelijkende analyse blijft. Ethische redenen maken het bijna onmogelijk om menselijk embryonaal materiaal te gebruiken om nieuwe genen die betrokken zijn bij de regulatie van ontwikkeling van het hart te ontdekken.

De analyse van de ontwikkeling van de kleppen, transformatie van het aortaboogsysteem, de ontwikkeling van de coronaire circulatie en de anatomische en moleculaire rijping van het geleidingssysteem konden we gedurende onze studies in het kader van dit proefschrift niet beschrijven, maar zijn interessante en belangrijke onderwerpen van onderzoek voor de toekomst.