Relatie eigenschappen maïscelwanden en fermentatiekarakteristieken in de pens van herkauwers

Hele tekst

(1)Relatie eigenschappen maïscelwanden en fermentatiekarakteristieken in de pens van herkauwers. J.W. Cone. ANU rapport Oktober 2014. Animal Nutrition Group.

(2)

(3) Relatie eigenschappen maïscelwanden en fermentatiekarakteristieken in de pens van herkauwers. J.W. Cone. Oktober 2014.

(4) Animal Nutrition Group. -4-.

(5) Animal Nutrition Group. -5-. Inhoud Voorwoord. 6. Samenvatting. 7. Inleiding. 9. Literatuuroverzicht. 10. Chemische analyses en in-vitro-fermentatie. 16. Anatomie en Microscopie. 28. Pyrolyse MassaSpectrometrie (PyMS). 45. Referenties. 50.

(6) Animal Nutrition Group. -6-. Voorwoord Dit rapport beschrijft onderzoek naar de relatie tussen de eigenschappen van maïscelwanden en fermentatiekarakteristieken van deze celwanden in de pens van herkauwers. Het betreft hier zowel chemische onderzoek als anatomisch en histologisch onderzoek en in-vitro-onderzoek naar de afbreekbaarheid van maiscelwanden in pensvloeistof. Het onderzoek is destijds opgezet als een AIO-project, waarbij de AIO 4 jaar onderzoek zou verrichten. Nadat de overige financiering van het projectvoorstel niet doorging is besloten om een buitenlandse AIO met een beurs op dit project te zetten. Helaas moest deze Vietnamese AIO door persoonlijke problemen na 1,5 jaar stoppen met zijn onderzoek en zagen wij ons gedwongen om het hele project stop te zetten. Het onderhavige rapport is een verslag van het onderzoek dat gedurende die anderhalf jaar en daarna nog is gedaan. Dank is verschuldigd aan onze MSc-student Jo Depandelaere die veel van het werk van de AIO voor zijn rekening heeft genomen, met name het anatomisch microscopisch gedeelte. Ook is dank verschuldigd aan Dr. Mirjam Kabel en Thibaut Mouthier van de afdeling Levensmiddelenchemie die de analyses met de pyrolyse massaspectrometer hebben uitgevoerd. Het project is een samenwerkingsverband geweest tussen de Animal Nutrition Group (Dr. John Cone) en het Centrum voor Crop Systems Analysis (Prof. Dr. Paul Struik) van Wageningen Universiteit. John Cone Wageningen 28 Oktober 2014.

(7) Animal Nutrition Group. -7-. Samenvatting Naast gras is mais is het belangrijkste ruwvoedergewas voor hoogproductieve melkkoeien. Een groot deel van de energie in mais is afkomstig uit het zetmeel in de kolf. Echter, ook de rest van de plant vertegenwoordigd een grote hoeveelheid energie en kan een grote voederwaarde hebben. De voederwaarde van het stro (plant minus kolf) kan erg variëren en wordt o.a. beïnvloed door het genotype, het klimaat, de ouderdom van de plant, de anatomie en de chemische samenstelling. Er is veel bekend over de relatie tussen de afbreekbaarheid van maiscelwanden en de verschillende eigenschappen van de plant. Zo is er een sterke correlatie tussen het ligninegehalte en de celwandverteerbaarheid. Deze relatie is echter niet een één-op-één-relatie. Er is moet dus meer zijn dat de afbreekbaarheid van een celwand bepaald, of veel eerder het niet afbreekbaar zijn. Het is belangrijk om te weten wat precies de afbreekbaarheid beïnvloedt en bepaalt, opdat veredelaars heel gericht kunnen veredelen. Mais bestaat uit verschillende internodia, meestal 15 of 16. De plant groeit aan de bovenkant, hetgeen betekent dat het onderste internodium (1) het eerst aangelegd wordt en dus ook het oudst is. De bovenste internodia (15, 16) zijn het jongst. Er is dus een ouderdomsgradiënt in de plant van onder naar boven. Daarom werden op één oogstdatum tijdens de bloei (14 augustus) alle internodia van 3 planten van twee verschillende genotypen verzameld om te onderzoeken. De genotypen waren Ambrosini en Aastar. Van Ambrosini wordt veronderstelt dat het een slecht verteerbaar ras is en van Aastar dat het een goed verteerbaar ras is. Verschil in ouderdom van de planten bestaat natuurlijk ook tijdens het groeiseizoen. Om een goede vergelijking te kunnen maken tussen plantmateriaal op verschillende dagen geoogst, werd iedere twee weken internodium 7 van zowel Ambrosini als Aastar geoogst. Alleen het midden van de internodia werden geanalyseerd, dus zonder de knopen. De chemische samenstelling van de internodia nr. 7, geoogst gedurende het groeiseizoen laat zien dat er geen duidelijke trend was in zowel het hemicellulose- als het cellulose-gehalte. Wel was er een trend voor een hoger gehalte lignine in ouder weefsel. Dit was zeker het geval voor Aastar. Binnen een plant van Ambrosini was er geen duidelijke trend voor het gehalte aan celwanden in de verschillende internodia. Voor Aastar was een lichte toename te zien in het gehalte aan celwanden in de hoger gelegen internodia. Het gehalte aan cellulose en hemicellulose nam licht af, naarmate het internodium hoger in de plant aanwezig was, bij zowel Ambrosini als Aastar. De afbraak van het stengelmateriaal in pensvloeistof werd bepaald met behulp van de gasproductietechniek, waarbij er een lineair verband is tussen gasproductie en afbraak van organische stof. Voor zowel Ambrosini als Aastar was er een duidelijke afname van de fermentatie van de celwanden bij toenemende ouderdom. Binnen een plant was er een trend voor een hogere gasproductie, naarmate het internodium hoger in de plant aanwezig was, bij zowel Ambrosini als Aastar. In alle gevallen was de celwandafbraak van Aastar hoger dan dat van Ambrosini. De anatomische verschillen tussen Ambrosini en Aastar waren gering, behalve dat Ambrosini per oppervlakte dwarsdoorsnede meer vaatbundels heeft. Het zijn juist de vaatbundels die veel lignine bevatten en dus slechter afbreekbaar zijn. Het zelfde zien we van onder naar boven in een maisstengel. Onderin de plant zien we veel vaatbundels, met veel lignine, en bovenin veel minder. De onderste internodia zijn dan ook slechter afbreekbaar dan de bovenste. De vele vaatbundels en lignine in het onderste deel van de plant zorgen ook voor extra stevigheid, wat nodig is omdat deze internodia het gewicht van de gehele plant moeten dragen. Er was een duidelijke correlatie tussen het lignine-gehalte en de fermentatie van de celwanden (r2 = 0.66). Ook was er een relatie tussen het lignine-gehalte en de snelheid van fermentatie (r2 = 0.38). De internodia van de beide genotypen werden ook onderzocht met behulp van pyrolyse-massaspectrometrie (PyMS). Dit is een techniek waarbij een zeer kleine hoeveelheid zeer fijn gemalen monster (40 – 70 µg) anaeroob zeer snel wordt verhit, zonder dat de macromoleculen verbranden, maar uiteenvallen in brokstukken. Deze kleinere.

(8) Animal Nutrition Group. -8-. moleculen (brokstukken) worden via een gasstroom (helium) gescheiden in een gaschromatograaf en vervolgens gedetecteerd met behulp van een massaspectrofotometer. Dit is een zeer krachtige techniek om de moleculaire samenstelling van macromoleculen en met name lignine te analyseren. De resultaten laten zien dat de samenstelling van de lignine een belangrijke factor is die bepaald of een celwand wel of niet afgebroken kan worden met behulp van micro-organismen in de pens. De afbraak van de celwanden in pensvloeistof is veel sterker gecorreleerd (r2 = 0.85) met de ratio syringyl en guaiacyl alcohol (S:G-ratio), twee belangrijke bouwstenen van lignine, dan met het ligninegehalte. Het ligninegehalte heeft zeker een negatieve invloed op de afbraak van de celwanden, maar is zeker niet de enige reden waarom een celwand wel of niet wordt afgebroken. Ook de samenstelling van de lignine blijkt van grote invloed te zijn. Meer onderzoek is nodig naar de samenstelling van lignine en de verschillende bindingen van lignine met de koolhydraten in de celwanden en de afbreekbaarheid van die celwanden..

(9) Animal Nutrition Group. -9-. Inleiding Snijmaïs is een belangrijk ruwvoeder in de Nederlandse rundveehouderij. Het gewas wordt na inkuilen als ruwvoer gebruikt en heeft – vooral dankzij het hoge zetmeelgehalte in de kolf – een hoge verteerbaarheid. De verteerbaarheid van de rest van de plant, die vooral uit celwanden bestaat, is een stuk lager dan van het zetmeel en onduidelijk is welke factoren exact de verteerbaarheid bepalen. Onduidelijk is waarom de ene celwand wel wordt afgebroken in de pens van herkauwers en de andere niet en waarom de ene celwand sneller wordt afgebroken dan de andere. Het blijft van het grootste belang om te blijven investeren in de ontwikkeling van betere maïsrassen in het bijzonder en meer optimaal ruwvoer in het algemeen. Onderzoek in de afgelopen decennia heeft geleid tot totaal andere ruwvoederrassen, met een veel hogere voederwaarde en tot rassen die veel meer tegemoet komen aan de behoeftes van de dieren. Onderzoek heeft geleid tot maïsrassen met een veel hogere opbrengst en een veel hoger aandeel zetmeel. Omdat men daarbij vooral gefocusseerd was op de opbrengst en het kolfaandeel heeft dit onderzoek niet geleid tot een hogere en/of snellere verteerbaarheid van de restplant (voornamelijk celwanden). Onderzoek naar de oorzaken van verschillen in verteerbaarheid van de celwanden kan leiden tot maïsrassen met een betere en snellere verteerbaarheid van die celwanden. Maïsrassen met een hogere celwandafbraak zullen een hogere voederwaarde hebben, dus lagere kosten, lagere milieuemissies en betere prestaties van de dieren. Het belang van optimaal ruwvoer wordt nog vergroot wanneer beperkingen gesteld gaan worden aan de import van veevoedergrondstoffen en de veehouder meer afhankelijk wordt van ruwvoer van eigen bodem. Ook zal de opkomende “bio-based economy” gepaard gaan met enorme reststromen die voor een (groot) deel hun weg zullen vinden als veevoedergrondstoffen in de melkveehouderij. Ook bij deze reststromen is het van groot belang dat de voederwaarde hoog is. Het belangrijkste doel van dit onderzoek is om inzicht te verkrijgen in de relatie tussen de eigenschappen van maïscelwanden en de fermentatiekarakteristieken in de pens, inclusief de snelheid van afbraak en de synthese van fermentatie-eindproducten. Tot op heden zijn veel vragen nog onbeantwoord om uit te maken welke eigenschappen celwanden moeten hebben voor een optimale fermentatie in de pens en hoe planteneigenschappen de synthese van vluchtige vetzuren en de fermentatiekinetiek beïnvloeden. Er bestaan grote verschillen in de anatomie van planten, de structuur en chemische en fysische eigenschappen als gevolg van verschillende groeicondities. Het onderzoek beschreven in dit rapport richt zich op de relatie tussen de eigenschappen van celwanden van maïs uit de stengel, chemische samenstelling, anatomie en in-vitro-pensfermentatie, gemeten met de gasproductietechniek. Het doel is om inzicht te krijgen in de achtergrond van verschillen in celwandstructuur en samenstelling tussen verschillende monsters, ook op moleculair niveau..

(10) Animal Nutrition Group. - 10 -. Literatuuroverzicht Plantaardige weefsels bestaan uit verschillende soorten cellen. Sommige van deze celtypes vormen een barrière en zorgen voor stevigheid van de plant. Jung et al. (1993) onderscheidt drie typen celwanden met verschillende functies: de primaire, secundaire en tertiaire celwand. Als planten groeien worden ze meer rigide en worden ze steeds sterker. De grootste bijdrage aan die veranderingen is de afzetting van lignine (Juniper, 1979). Stengelsamenstelling In een dwarsdoorsnede van de maïsstengel is de epidermis de buitenste laag, met daaronder verschillende lagen sclerenchymweefsel die zorgen voor stevigheid en stijfheid. Vaatbundels aan de binnenkant van de epidermis zijn omringd door verschillende lagen sclerenchymcellen, terwijl vaatbundels in het midden van de stengel omgeven zijn door slechts één laag sclerenchymweefsel. De rangschikking van vaatbundels is complex en ze liggen verspreid in het parenchymweefsel. Aan de zijkant van de stengel zitten meer vaatbundels dan in het midden (Esau, 1977). Door de verschillende samenstelling van de epidermisrand en het parenchym in het midden is er een verschil in afbreekbaarheid, waarbij het parenchym beter afbreekbaar is dan de buitenste rand met de epidermis en veel sclerenchymweefsel. Het parenchym bevat veel minder vaatbundels en heeft dunnere celwanden (Jung, 1989). De afbreekbaarheid van de celwanden neemt af, naarmate het weefsel ouder wordt (Jung, 1989). Ontwikkeling vaatbundels Vaatbundels worden reeds gevormd in de wortels. Ze groeien door in de stengel en splitsen zich voor de ontwikkeling van nieuwe bladeren tijdens de groei van de plant. Bij veroudering van de stengel wordt geen nieuw weefsel gevormd. In de rand van de stengel zijn meer vaatbundels aanwezig, omdat daar de bladeren worden gevormd. Sommige vaatbundels buigen aan de buitenkant van de stengel om de middennerf van een blad te vormen. In jongere internodia van de stengel is de rand kleiner en zijn er minder vaatbundels. In de jongere internodia zijn meer vaatbundels reeds gebogen voor de ontwikkeling van de bladeren. Aan de rand zijn de vaatbundels meer ontwikkeld dan in het midden van de internodia (Fig. 1), hetgeen veroorzaakt zou kunnen worden door een hogere concentratie auxine. Dit hormoon is een van de belangrijkste regulatoren voor de ontwikkeling van vaatbundels. De meer ontwikkelde vaatbundels in de rand dragen bij aan de stijfheid van de maïsstengel, hetgeen van belang is voor de oudere plant en de lagere delen van de plant die het gewicht van de hele plant moeten dragen. Morfologische kenmerken Boon et al. (2008) onderzochten de lengte en diameter van de internodia 7 tot 16 in twee cultivars. De lengte van de internodia neemt naar beneden toe vanaf internodium 14 tot aan internodium 8. Internodium 7 is echter een uitzondering. Omdat dit internodium de kolf draagt is dit internodium altijd korter dan de naastliggende internodia. Een negatieve correlatie werd gevonden door Struik et al. (1985). Een ander kenmerk is de diameter van de internodia die consequent kleiner wordt naarmate het internodium hoger in de plant aanwezig is (Boon et al., 2008). Externe invloeden, zoals droogte, zijn van invloed op de ontwikkeling van de planten en beïnvloeden de lengte en de diameter van de internodia (Espinoza-Paz, 1996; Bennouna et al., 2004)..

(11) Animal Nutrition Group. -11-. Fig. 1. Dwarsdoorsnede van een maïsstengel met de meer ontwikkelde vaatbundels in de rand. Anatomische kenmerken De verteerbaarheid van celwanden kan worden beïnvloed door anatomische eigenschappen, zoals blijkt uit incubaties van verschillende weefsels uit de stengel met pensvloeistof (Deinum en Struik, 1989; Cone en Engels, 1990). Deze verschillende weefsels zijn: vaatbundels, sclerenchym, epidermis, chlorenchym en parenchym. Chlorenchym en parenchym wordt bijna volledig afgebroken binnen 24 uur. De afbraak van vaatbundels, sclerenchym en epidermis duurt veel langer, tot meer dan 96 uur (Engels en Schuurmans, 1992). Tachtig procent van het gewicht van een maisstengel wordt gevormd door de vaatbundels en het sclerenchym. Dit zijn nou precies de minder verteerbare delen van de plant. Dit betekent ook dat de verteerbaarheid van de hele plant kan worden verbeterd door het verbeteren van de verteerbaarheid van de vaatbundels en het sclerenchym. Het grootste deel van de vaatbundels en het dikwandige sclerenchym wordt gevonden in de rand, terwijl het binnenste deel van de stengel voornamelijk bestaat uit dunwandig parenchym en kleinere vaatbundels (Boon et al., 2005). Aantal vaatbundels Het aantal vaatbundels per doorsnede neemt toe vanaf de bovenkant van de plant naar de onderkant van de stengel. Hierbij zijn er meer vaatweefsel in de rand dan in het midden (Esau, 1977; Wilson et al., 1993). Het weefsel in de rand bevat ook meer feruulzuur en pcoumaarzuur dan de weefsels in het midden. Dit is onder anderen het gevolg van het hogere ligninegehalte in de rand (Morrison et al., 1998). Sclerenchym Het aantal lagen sclerenchymweefsel rond de vaatbundels is van invloed op de verteerbaarheid. Volgens Boon et al. (2008) is het sclerenchym rond de vaatbundels aan de bovenkant van de stengel ongeveer hetzelfde gepositioneerd, zowel de adaxiale als de abaxiale kant, dus rondom de vaatbundels. Bij de oudere internodia, aan de onderkant van de plant, is het sclerenchym meer gepositioneerd aan de adaxiale kant van de vaatbundels, dus aan de binnenkant. Dit is ook het geval bij vergelijking van een jonge vaatbundels met oude vaatbundels. Cone en Engels (1990) onderzochten het verschil in celwanden tussen twee verschillende groeicondities en vonden dat de diameter van de parenchymcellen groter was en de celwanden van het subepidermale sclerenchym dikker was in maïs geteeld bij een lage temperatuur in vergelijking met maïs geteeld bij een hoge temperatuur. Binnen een.

(12) Animal Nutrition Group. - 12 -. internodium neemt het aantal sclerenchymlagen toe van het bovenste internodium naar de onderste. Echter, de dikte van de celwanden van het sclerenchymweefsel nam af van de top tot de basis van de plant (Boon et al., 2005). Het aantal subepidermale sclerenchymlagen wordt sterk beïnvloedt door het weer, de locatie, het genotype, etc. (Boon et al., 2005). Het aantal subepidermale sclerenchymlagen is mogelijk ook een kenmerk voor de afbreekbaarheid. Dikte van de celwanden Omdat pensbacteriën eerst de ene celwand moeten verteren, voordat ze naar de celwand daarnaast kunnen, is de dikte van de celwanden belangrijk voor de verteerbaarheid. De dikte van de celwand van sclerenchymweefsel neemt naar beneden toe in de stengel vanaf internodium 15. Dit geldt zowel voor het subepidermale sclerenchym als voor het sclerenchym in de vaatbundels. Boon et al. (2005) liet zien dat boven in een internodium de celwanddikte van sclerenchymweefsel in de vaatbundels groter is (4.2-4.7µm) dan in de subepidermale laag (3.0-4.0 µm). Aan de onderkant van een internodium was er geen verschil in celwanddikte van de verschillende sclerenchymcellen (2.1-2.7 µm). Cone en Engels (1990) toonden aan dat dunne celwanden en een kleine diameters het gevolg kan zijn van een intensieve strekking van de cellen door een hoge temperatuur. De rand bevat veel vaatbundels in parenchymweefsel met een kleine diameter. In de kern zijn de parenchymcellen groter, waardoor er in de kern een lagere concentratie aan celwanden is. De weefsels in de rand van de stengel bestaan voornamelijk uit epidermis, subepidermaal sclerenchymweefsel en subsclerenchymaal parenchym met verspreid vaatbundels en beslaat 20% van de oppervlakte van een dwarsdoorsnede. Toch is het aandeel van deze cellen in het totale droge gewicht van de stengel 80% (Engels, 1989). Het floëem-weefsel in de vaatbundels neemt af van de top naar de voet van de stengel. Dit komt door vermindering van het aantal vaatbundels per oppervlakte-eenheid. Naarmate de plant ouder wordt liggen de vaatbundels meer uit elkaar. Dit betekent dat er meer sclerenchymweefsel aanwezig is tussen de verschillende vaatbundels. Lignine Niet alle weefsels of celtypes lignificeren in dezelfde mate. Collenchym en floëemcellen in voedergewassen lignificeren niet of nauwelijks, en zijn zelfs niet gelignificeerd in volwassen weefsels (Wilson, 1993). Jung en Casler (2006) vonden dat in volwassen planten floëem het enige weefsel is dat niet gelignificeerd is. Hoewel sommige parenchymcellen direct naast een vaatbundel dat soms ook niet zijn. Jung en Casler (2006) toonden ook aan dat tijdens de strekking alleen protoxyleemvaten positief kleuren voor lignine. Na de strekking lignificeren ook het metaxyleem, parenchym en sclerenchym, maar het floëem niet. De depositie van lignine in het protoxyleem in strekkende internodia is algemeen voor voedergewassen, het komt ook voor in Luzerne. Gegevens laten een beperkte lignineconcentratie zien in de jongste stengeldelen van de maïsplant en een proportionele daling van het ligninegehalte in de celwand tijdens de strekking. Gelignificeerde cellen en weefsels zijn minder verteerbaar (Jung en Himmelsbach, 1989; Akin et al., 1990). De toegankelijkheid van de koolhydraten in de celwanden voor de microben in de pens worden beperkt door de chemische samenstelling en de anatomie van ieder celtype binnen een weefsel. Chemische samenstelling Lignine kan erg verschillen in samenstelling. Lignine kan omschreven worden als een driedimensionaal netwerk, opgebouwd uit phenylpropaaneenheden (Fig. 2). Lignine is een complex polymeer dat voornamelijk uit drie monomeren bestaat: coumaryl alcohol, coniferyl alcohol en sinapyl alcohol (Boudet, 2000; Humphreys en Chapple, 2002). Coumaryl alcohol wordt hoofdzakelijk gevonden in lignine van grassen of voedergewassen (Yeung, 1998). De drie chemische formules staan weergegeven in figuur 3..

(13) Animal Nutrition Group. -13-. Figuur 2. Chemische structuur van lignine.. Figuur 3. Lignineprecursors (Yeung, 1998) Na polymerisatie via radicaalvorming vormen deze monomeren om tot p-hydroxyphenyl, guaiacyl en syringyl. De verhouding van deze stoffen in de verschillende types van lignine varieert tussen verschillende planten. Lignine vormt chemische bindingen met de koolhydraten in de celwanden via ester bindingen, met uronzuur residuen, en ook via phenolzuren. Deze zuren dragen bij aan het proces van lignificatie in de celwand (MacAdam en Grabber, 2002). De bindingen tussen cellulose en lignine geven de plant mechanische sterkte. Deze bindingen veroorzaken echter ook een verminderde toegankelijkheid voor enzymen en pensmicroorganismen (Theander en Westerlund, 1993). Volgens Jung en Buxton (1994) is het niet alleen het ligninegehalte dat de verteerbaarheid beperkt, maar ook variatie in samenstelling met de verschillende componenten en bindingen..

(14) Animal Nutrition Group. - 14 -. Een toename van het aantal fenolverbindingen resulteert in een afname van de verteerbaarheid, aangezien dit de bouwstenen van lignine zijn (Jung en Sahlu, 1986). Twee van deze phenolcomponenten zijn p-coumaarzuur en feruulzuur. Primaire weefsels van gras zijn relatief rijk aan feruulzuur en toch zijn ze zeer goed verteerbaar (Harvey en Hartley, 1976 Akin en Chesson, 1989). Daarnaast is p-coumaarzuur aanwezig in de secundaire celwanden en deze weefsels zijn minder verteerbaar (Burrit et al, 1984;. Akin en Chesson, 1989; Jung en Casler, 1990). Morrison et al, (1998) toonden aan de rand van een stengel relatief meer feruulzuur en p-coumaarzuur bevat dan de kern. Harris en Hartley (1976) onderzochten de relatie tussen fluorescentie/kleuring en verteerbaarheid. Wanneer de weefsels werden behandeld met een hydroxide nam de fluorescentie af. Fluorescentie wordt vooral veroorzaakt door onverteerbare celwanden die fenolen bevatten. Xyleemvaten vertonen bijvoorbeeld een hoge fluorescentie. Delignificatie van de weefsels resulteerde in een lagere fluorescentie en kleuring (Akin et al., 1990). Verteerbare secundaire celwanden zijn positief voor fluorescentie en kleuring met phloroglucinol (Acid Phloroglucinol, AP). Echter, deze celwanden kleuren niet met AP na behandeling met permanganaat. Primaire celwanden blijven AP positief maar worden fluorescentie-negatief na behandeling met permanganaat. Kleuring en fluorescentie geven echter alleen maar aan of fenolen aanwezig zijn in de celwanden en niet of de celwand wel of niet verteerbare is (Akin et al., 1990). Uit een experiment met sclerenchymweefsel in maïs bleek dat de secondaire celwanden biologisch afbreekbaar zijn, hoewel ze intensief gekleurd waren voor lignine (Engels, 1989, Cone en Engels, 1990). Jung en Deetz (1993) toonden aan dat feruulzuur alleen veresterd met de koolhydraten in de ontwikkelende primaire celwand en niet in de secundaire celwand. Feruulzuur kan ook etherbindingen aangaan in de primaire celwand. Lignificatie begint in de primaire celwanden en pas later in de secundaire celwanden. Alle verdikte secundaire celwanden tonen een intense positieve kleuring met phloroglucinol (Fig. 4), een indicator voor de aanwezigheid van lignine (Mulder et al., 1992). Een intense kleuring betekent ook dat dit weefsel slechter verteerd kan worden door zowel enzymen als micro-organismen (Akin en Burdick, 1981; Akin en Chesson, 1989).. Figuur 4: Phloroglucinol Lignine kan ook worden ingedeeld op basis van gevoeligheid voor hydrolyse. Non-core (niet kern) lignine bestaat uit laagmoleculaire fenolpolymeren. Bij hydrolyse laten deze fenolen vrij snel los uit de celwanden (Hartley en Ford, 1989). Core (kern) lignine is sterk gecondenseerd en is grotendeels bestand tegen milde afbraakprocessen, in tegenstelling tot niet-kern lignine. De twee types zijn belangrijk omdat volgens Jung (1989) de voedingswaarde niet alleen wordt beïnvloed door de hoeveelheid lignine maar ook door de aard van de lignine. Lignificatie wordt reeds 50 jaar gerelateerd met verminderde verteerbaarheid. Niettemin is de exacte oorzaak van verteerbaarheid en vooral niet-verteerbaarheid nog niet bekend. Plantenweefsels zijn altijd een samenstelling van verschillende celtypen. De wanden van de verschillende celtypen variëren sterk en verschillen in toegankelijkheid en dus ook in.

(15) Animal Nutrition Group. -15-. afbreekbaarheid (Akin, 1989). De rijpheid (ouderdom) van een plant heeft echter de meeste invloed op de afbreekbaarheid (Jung, 2011). Vorming van lignine De vorming van de secundaire celwand en de depositie van lignine begint voordat de volledige groei van de plant begint en de strekking begint. Pas als de secundaire celwand verdikt, begint de lignificatie van de primaire celwand en pas daarna lignificeert de secundaire celwand (Terashima et al., 1993). De uiteindelijke concentratie van lignine in de primaire celwand is hoger dan in de secundaire celwand, maar omdat de secundaire celwand veel dikker is, is de totale hoeveelheid lignine het grootst in de secundaire celwand (Terashima et al., 1993). Tijdens de afzetting van lignine in de celwanden wordt water verwijderd, en dat maakt dat de celwand hydrofoob wordt (Inomana et al., 1992). De mate waarin lignine voorkomt in plantweefsels is genetisch bepaald, maar het kan echter ook worden beïnvloed door omgevingsfactoren zoals temperatuur. Lignine is een zeer belangrijke component in de plant, omdat het de plant beschermt tegen ziekteverwekkers, beschermt tegen weersinvloeden (wind) en combineert het structurele sterkte en stijfheid (Boon et al., 2005). Lignine en afbreekbaarheid Niet gelignificeerde weefsels zijn altijd volledig verteerbaar. Naarmate een weefsel meer lignificeert, neemt de verteerbaarheid af. In theorie zal de verteerbaarheid van een stukje plantenweefsel bestaande uit enkel primaire celwanden met 100 % afnemen zodra de secundaire celwand wordt gevormd. Hoewel secundaire celwanden zeer verteerbaar zijn, zal de primaire celwand fungeren als een perfecte barrière voor bacteriën, tenzij mechanisch verbroken (Engels, 1989). Ieder weefsel met gelignificeerde celwanden is nooit volledig verteerbaar. Een dun sterk gelignificeerd residu zal overblijven, zelfs na langdurig incuberen in de pens (Engels, 1989). Dit onverteerbaar residu is wat er over is van de intens gelignificeerde primaire celwand, hetgeen een ondoordringbare barrière vormt voor pensbacterïen. Pensbacterïen verteren celwanden van binnen uit de cel en gaan naar andere celwanden vanuit het lumen van die cellen (Engels, 1989). Omdat bacteriën de sterk gelignificeerde primaire celwand niet kunnen afbreken, kunnen ze niet zondermeer van de ene secundaire celwand naar de naastgelegen celwand gaan (Chesson, 1993), hetgeen wel mogelijk is in niet-gelignificeerde weefsels (Engels en Jung, 2005). Door de lignificatie zijn er grote hoeveelheden potentieel verteerbare koolhydraten in de celwanden die niet beschikbaar zijn voor vertering in de pens, omdat de cellen in het (ruw)voer fysiek niet verbroken worden door het kauwen en het herkauwen (Wilson en Mertens, 1995). Een gemiddeld voerdeeltje in de pens bestaat uit vele honderden cellen en 1/3 van deze cellen zullen niet worden verteerd omdat ze ontoegankelijkheid zijn voor de micro-organismen. Niet-beschadigde cellen zijn onbereikbaar omdat de omliggende gelignificeerde primaire celwanden niet kunnen worden verteerd. Dit betekent dat gelignificeerde primaire celwanden van niet-beschadigde cellen een ondoordringbare barrière vormen voor pensbacteriën en dat potentieel verteerbare celwanden ontoegankelijk zijn wanneer ze zijn omgeven door niet-beschadigde cellen (Jung, 2011). Dit werd door Wilson en Mertens (1995) aangetoond voor grassen, maar geldt ook voor andere gewassen..

(16) Animal Nutrition Group. - 16 -. Chemische analyses en in-vitro-fermentatie Materialen en methoden Mais Zaden van de maiscultivars Ambrosini en Aastar werden gezaaid in de eerste week van Mei in 2012 op de proefvelden van Unifarm in Wageningen. De zaden werden beschikbaar gesteld door Limagrain (Rilland, Nederland). Van beide cultivars werden 4 veldjes aangelegd, zoals weergegeven in Figuur 5. De veldjes waren ieder 6 bij 4.5 meter en de plantdichtheid was 10 planten per m2, met 13.3 cm tussen de planten en 75 cm tussen de rijen. De veldjes hadden een zandgrond met pH 5.5, 2.1 % organische stof en voldoende P, K, S en Mg. De perceeltjes werden bemest met 40 kg/ha koeienmest, 150 kg/ha calciumammonium-nitraat (KAS, 27% N), 160 kg/ha kalium (K60, 60% K2O) en 100 kg/ha fosfaat (tripelsuperfosfaat, 45% P2O5).. Ambrosini Aastar 5. 6. Ambrosini 7. Aastar 8. 6m. 9m padth. 24m. Ambrosini 1. Ambrosini Aastar 2. Aastar 3. 6m 4. 6 rows 4.5m 24m Figuur 5. Schema van de proefveldjes met de maiscultivars Ambrosini en Aastar.. Monsters maisinternodia Gedurende 2012 werd internodium 7 (geteld vanaf de grond) van de maisplanten geoogst op verschillende data. De internodia werden geoogst inclusief de onderste en bovenste knoop. Er werd geoogst op 17 juli (dag nr. 199), 31 juli (213), 14 augustus (227), 28 augustus (241), 11 september (255), 25 september (269) en 23 oktober (297). Op 14 augustus werd bovendien van 3 planten per veldje per cultivar de hele stengel geoogst, om zodoende de verschillen tussen de internodia binnen één en dezelfde plant te kunnen bestuderen. De geoogste internodia en stengels werden direct na het oogsten bewaard in een vriescel bij -20°C. Voor chemische analyses, pyrolyse massaspectrometrie (PyMS) analyses en in-vitrofermentatie werden de internodia (zonder de knopen) gedroogd bij 70°C en vervolgens gemalen over 1 mm. Voor de microscopische analyses werden de monsters niet gedroogd. Chemische analyses Droge stof (DS) werd bepaald na 4 uur bij 103 °C en as na 3 uur bij 550 °C. Neutral Detergent Fiber (NDF) werd bepaald met de methode van Van Soest et al. (1991), met gebruikmaking van een hittebestendige amylase. Resultaten zijn uitgedrukt zonder as in de.

(17) Animal Nutrition Group. -17-. NDF. Asvrije Acid Detergent Fiber en lignine (Acid Detergent Lignin, ADL) werden bepaald met de methode van Van Soest (1973). Het gehalte hemicellulose werd berekend als het verschil tussen NDF en ADF en cellulose als het verschil tussen ADF en ADL. Stikstof (N) werd bepaald met de Kjeldahl-methode en ruw eiwit (RE) werd berekend als N x 6.25. Gasproductie-incubaties De fermentatiekinetiek werd bepaald met de gasproductietechniek (Cone et al., 1996). Incubaties met 0.5 gram organische stof (OS) werden uitgevoerd in duplo in 60 ml gebufferde pensvloeistof (1 deel pensvloeistof en 2 delen buffer) in 250 ml flessen bij 39 °C in een schudwaterbad. Pensvloeistof was afkomstig van 2 droogstaande koeien, gehouden onder standaardcondities. De dieren werden 2 keer daags gevoerd met hooi en in de ochtend met 1 kg krachtvoer. De pensvloeistof werd 2 uur na het voeren in de ochtend getapt..

(18) Animal Nutrition Group. - 18 -. Resultaten Chemische samenstelling internodium 7 De gehaltes aan as, NDF, ADF en ADL in internodium 7, geoogst op verschillende data gedurende 2012, staan weergegeven in Tabel 1. Het valt op dat er nogal wat variatie in de chemische samenstelling was in de monsters geoogst op de verschillende data. Er is geen duidelijke trend voor een hoger gehalte NDF en ADF in ouder weefsel (Fig. 6). Bij Ambrosini is er wel een trend voor een hoger gehalte lignine (ADL) in ouder weefsel (Fig. 7). De verschillende tussen de twee cultivars zijn niet groot. Er is weinig verschil in de gehaltes NDF en ADF tussen de twee genotypen. Wel is het ligninegehalte in Ambrosini duidelijk hoger dan in Aastar. Tabel 1. Gehalte as (g/kg DS ± sd), NDF, ADF en ADL (g/kg OS ± sd) in internodium 7 van de maisgenotypen Ambrosini en Aastar, geoogst op verschillende data in 2012. As sd NDF sd ADF sd ADL sd Ambrosini Juli 17 71.5 0.9 654.7 6.4 446.3 5.3 47.0 0.1 Juli 31 47.2 0.4 680.6 2.5 474.1 8.2 63.2 4.4 Augustus 14 40.2 0.2 548.2 1.1 386.2 0.6 54.0 0.0 Augustus 28 40.7 0.1 540.5 2.6 380.1 0.2 46.2 4.1 September 11 50.9 0.6 658.7 8.2 471.8 9.1 71.9 7.9 September 25 58.3 0.3 738.1 1.4 523.9 0.3 79.8 1.7 Oktober 23 57.5 0.0 649.1 3.5 450.2 1.9 59.8 1.8 Aastar Juli 17 Juli 31 Augustus 14 Augustus 28 September 11 September 25 Oktober 23. 68.6 47.6 41.3 49.6 44.3 50.1 70.9. 0.5 0.7 0.0 0.8 0.4 0.1 0.2. 615.3 658.6 507.9 622.1 505.0 537.1 605.7. 3.7 2.2 0.0 2.6 7.9 3.0 4.1. 410.2 451.8 344.9 440.7 342.5 370.5 404.5. 0.2 0.9 2.8 1.3 1.3 3.1 10.4. 31.2 45.5 38.7 60.2 38.6 41.8 40.3. 0.6 0.3 4.6 0.7 1.4 5.3. 800 750 700. g/kg OS. 650. 600. NDF Ambr. 550. NDF Aast. 500. ADF Ambr. 450. ADF Aast. 400 350. 300 5-jul. 25-jul. 14-aug. 3-sep. 23-sep 13-okt. 2-nov. Fig.6. Gehalte NDF en ADF in internodium 7 gedurende het seizoen in Ambrosini en Aastar..

(19) Animal Nutrition Group. -19-. 90 80. g/kg OS. 70. 60 ADL Ambr 50. ADL Aast. 40. 30 20 5-jul. 25-jul. 14-aug. 3-sep. 23-sep. 13-okt. 2-nov. Fig.7. Gehalte ADL in internodium 7 gedurende het seizoen in Ambrosini en Aastar. Chemische samenstelling binnen een plant De gehaltes aan as, NDF, ADF en ADL in verschillende internodia binnen een plant, geoogst op 14 augustus 2012, staan weergegeven in Tabel 2. Ook hier is geen duidelijke trend te zien in chemische samenstelling van oud (laag internodium) naar meer jong (hoog internodium) weefsel (Fig. 8). Wel is er een lichte trend te zien voor een lager gehalte ADF, naarmate het internodium hoger in de plant aanwezig is en het weefsel dus jonger is. Er is wel een duidelijke trend voor een lager gehalte ADL in de jongere weefsels (Fig. 9), hoger in de plant. De grootste verschillen tussen Aastar en Ambrosini is dat Aastar een lager gehalte ADF en ADL laat zien. Tabel 2. Gehalte as (g/kg DS ± sd), NDF, ADF en ADL (g/kg OS ± sd) in verschillende internodia (van bodem naar top) van planten van de maisgenotypen Ambrosini en Aastar, geoogst op 14 Augustus 2012. As sd NDF sd ADF sd ADL sd Ambrosini Internodium 5 75.8 0.2 683.3 1.4 481.6 0.8 72.5 0.5 Internodium 7 44.0 0.4 592.2 0.3 408.6 2.1 57.4 2.1 Internodium 9 31.6 0.7 633.4 2.0 420.2 1.0 55.4 0.6 Internodium 11 35.1 0.6 611.6 1.1 385.0 4.0 52.6 0.0 Internodium 13 37.4 0.2 616.7 0.1 370.7 1.3 47.0 1.0 Internodium 15 36.5 0.4 618.6 1.8 373.7 4.2 48.6 1.6 Aastar Internodium 5 Internodium 7 Internodium 9 Internodium 11 Internodium 13 Internodium 15. 59.5 44.8 35.7 33.6 38.0 41.3. 0.3 0.0 0.1 0.0 0.3 0.3. 553.9 514.0 509.6 529.5 539.1 609.7. 1.1 2.7 2.2 2.3 10.5 5.5. 389.3 354.5 329.8 326.7 320.5 346.5. 3.9 0.2 1.7 2.2 7.0 1.2. 52.7 39.7 34.7 34.1 30.6 29.6. 0.0 1.1 1.5 0.6 0.8 2.2.

(20) Animal Nutrition Group. - 20 -. 750 700 650 g/kg OS. 600. 550. NDF Ambr. 500. NDF Aast. 450 400. ADF Ambr. 350. ADF Aast. 300 250 5. 7. 9. 11. 13. 15. Internodium nummer. Fig.8. Gehalte NDF en ADF in de verschillende internodia, van laag tot hoog, in planten Ambrosini en Aastar, geoogst op 14 augustus. 80 70. g/kg OS. 60 50. ADL Ambr. 40. ADL Aast. 30 20 5. 7. 9. 11. 13. 15. Internodium nummer. Fig.9. Gehalte ADL in de verschillende internodia, van laag tot hoog, in planten Ambrosini en Aastar, geoogst op 14 augustus..

(21) Animal Nutrition Group. -21-. In-vitro-fermentatie van internodium 7 Het internodium 7, zonder de knopen, werd gedroogd en gemalen over 1 mm en de fermentatiekinetiek in pensvloeistof werd onderzocht met behulp van de gasproductietechniek (Cone et al., 1996). De gasproductie (ml gas/g OS) na 3 en 72 uur incubatie in pensvloeistof staat weergegeven in Tabel 3, alsmede de gasproductie tussen 3 en 20 uur. De cumulatieve gasproductie na 3 uur is een maat voor de fermentatie van de water-oplosbare fractie en de gasproductie tussen 3 en 20 uur is een maat voor de fermentatie van de niet-oplosbare fractie (Cone et al., 1997). De niet-oplosbare fractie bestaat vooral uit zetmeel en celwanden (cellulose, hemicellulose en lignine). In het geval van maisstengelmateriaal bestaat de niet-oplosbare fractie uit celwanden. De gasproductie tussen 3 en 20 uur is dus een maat voor de afbreekbaarheid van de celwanden in de maisstengels. De cumulatieve gasproductie na 72 uur is een maat voor de totale afbraak. De resultaten in Tabel 3 laten zien dat er enige variatie is in de gasproductie na 3 uur voor de verschillende oogstdata voor zowel Ambrosini als Aastar. Er is echter geen sprake van een systematische verhoging of verlaging bij een latere oogstdatum. Variatie in met name suikergehalte kan ook veroorzaakt worden door verschillen in het weer en tijdstip van oogsten op de dag. Het jongste monster (17 juli) laat de hoogste gasproductie zien tussen 3 en 20 uur. Er is een tendens voor een lagere gasproductie, naarmate de internodia later werden geoogst. De verschillen zijn echter klein, zeker voor Aastar. Er is geen duidelijke trend voor een lagere gasproductie na 72 uur incubatie, bij zowel Ambrosini (Fig. 10) als bij Aastar (Fig. 11). Opvallend is dat bij Aastar de hoogste gasproductie werd gemeten bij het oudste materiaal. De gemiddelde gasproductie was in alle gevallen hoger voor Aastar dan voor Ambrosini. Tabel 3. Gasproductie (ml gas/g OS ± sd) bij fermentatie van maisgenotypen Ambrosini en Aastar, geoogst op verschillende data incubatie in pensvloeistof en de gasproductie tussen 3 en 20 uur. 3h sd 20-3 h sd 72 h Ambrosini Juli 17 42.6 116.9 249.2 1.2 2.3 Juli 31 38.8 91.1 232.9 1.1 2.3 Augustus 14 66.0 94.6 258.3 3.4 4.7 Augustus 28 72.3 106.3 273.3 4.0 4.2 September 11 47.0 95.0 245.0 4.7 6.5 September 25 30.0 84.6 227.2 3.4 5.3 Oktober 23 53.8 86.4 245.5 2.6 3.9 96.4 247.4 Gemiddelde 50.1 Aastar Juli 17 Juli 31 Augustus 14 Augustus 28 September 11 September 25 Oktober 23 Gemiddelde. internodium 7 van de in 2012, na 3 en 72 uur sd 6.3 8.0 12.4 5.9 11.9 11.4 5.0. 40.9. 0.7. 130.9. 2.0. 264.0. 5.0. 37.5. 3.1. 118.3. 4.8. 266.7. 8.9. 77.0. 3.6. 108.9. 8.9. 284.5. 23.2. 54.4. 5.0. 102.4. 6.0. 257.5. 7.7. 83.2. 5.1. 124.5. 6.0. 310.0. 11.6. 73.3. 1.7. 113.4. 4.6. 296.0. 20.7. 65.0. 3.4. 113.5. 4.0. 281.9. 7.2. 61.6. 116.0. 280.1.

(22) Animal Nutrition Group. - 22 -. Ook de tijd (uren) die nodig is om de helft van de maximale gasproductie te bereiken laat geen duidelijk beeld zien. Bij Ambrosini lijkt er een trend naar een langere halfwaardetijd te zijn, maar het beeld is niet eenduidig. Een langere tijd die nodig is voor de helft van de maximale gasproductie duidt op een langzamere fermentatie. De gemiddelde halfwaardetijd was voor Aastar lager (12.9 uur) dan voor Ambrosini (14.6 uur). Dit werd echter volledig veroorzaakt door de monsters geoogst in September en Oktober. Tabel 4. Tijd (uren) die nodig is om 50 % van de maximale gasproductie te bereiken bij fermentatie van internodium 7 in pensvloeistof van de maisgenotypen Ambrosini en Aastar, geoogst op verschillende data in 2012. Ambrosini Aastar Juli 17 12.9 13.4 Juli 31 16.9 16.3 Augustus 14 11.7 11.1 Augustus 28 10.4 13.2 September 11 14.9 10.5 September 25 19.8 12.6 Oktober 23 15.8 13.0 14.6 12.9 Gemiddelde. 300. 250. ml gas/g OS. 200. 150. Ambr 17-07 Ambr 31-07. 100. Ambr 14-08 Ambr 28-08 Ambr 11-09 Ambr 25-09. 50. Ambr 23-10. 0 0. 10. 20. 30 40 50 Incubatieperiode (uur). 60. 70. 80. Fig. 10. Gasproductiecurven van internodium 7 van Ambrosini, geoogst gedurende het seizoen 2012..

(23) Animal Nutrition Group. -23-. 350. 300. 250. ml gas/g OS. 200. 150 Aast 17-07 Aast 31-07 Aast 14-08. 100. Aast 28-08 Aast 11-09 Aast 25-09 50. Aast 23-10. 0 0. 10. 20. 30 40 50 Incubatieperiode (uur). 60. 70. 80. Fig. 11. Gasproductiecurven van internodium 7 van Aastar, geoogst gedurende het seizoen 2012.. In-vitro-fermentatie van internodia binnen een plant Op 14 augustus werden alle internodia van 3 planten per veldje per cultivar geoogst. De internodia (zonder knopen) werden gedroogd en gemalen over 1 mm. De fermentatiekinetiek in pensvloeistof van de internodia 5, 7, 9, 11, 13 en 15 werd onderzocht met behulp van de gasproductietechniek (Cone et al., 1996). De gasproductie (ml gas/g OS) na 3 en 72 uur incubatie in pensvloeistof staat weergegeven in Tabel 5, evenals de gasproductie tussen 3 en 20 uur. Ook hier is er enige variatie in de gasproductie na 3 uur, zij zowel Ambrosini als bij Aastar, maar er is geen duidelijke trend waarneembaar. De gasproductie na 3 uur was voor alle internodia iets hoger bij Aastar dan bij Ambrosini. De gasproductie tussen 3 en 20 uur laat een duidelijk trend zien voor hogere gasproductie naarmate het internodium hoger in de plant zit. De gasproductie van het laagste internodium (5) is voor beide cultivars het laagst. Zowel bij Ambrosini (Fig. 12) als bij Aastar (Fig. 13) is de totale gasproductie na 72 uur van internodium 5 het laagst. Het onderste internodium wordt het eerst aangelegd en is dus ook het oudst. De overige internodia laten geen eenduidig beeld zien. In alle gevallen is de gasproductie van Aastar hoger dan van Ambrosini. De tijd (uren) die nodig is om de helft van de maximale gasproductie te bereiken is zowel bij Ambrosini als bij Aastar het hoogst bij internodium 5, dus daar vindt de langzaamste fermentatie plaats. Bij Ambrosini lijkt er een tendens naar een steeds snellere fermentatie naarmate het internodium hoger uit de plant komt. De gemiddelde halfwaardetijd was voor Aastar lager (12.2 uur) dan voor Ambrosini (14.0 uur)...

(24) Animal Nutrition Group. - 24 -. Tabel 5. Gasproductie (ml gas/g OS ± sd) bij fermentatie van internodia 5, 7, 9, 11, 13 en 15 van de maisgenotypen Ambrosini en Aastar, geoogst op 14 Augustus 2012, na 3 en 72 uur incubatie in pensvloeistof en de gasproductie tussen 3 en 20 uur. 3h sd 20-3 h sd 72 h sd Ambrosini Internodium 5 39.2 96.9 245.1 8.4 3.3 21.3 Internodium 7 57.8 111.0 282.2 10.8 4.6 16.0 Internodium 9 49.7 111.9 265.9 8.5 4.4 15.5 Internodium 11 60.4 138.9 313.3 2.5 5.9 Internodium 13 59.8 132.3 299.3 8.2 7.1 Internodium 15 50.6 122.7 273.6 3.0 6.4 9.1 279.9 Gemiddelde 52.9 119.0 Aastar Internodium 5 Internodium 7 Internodium 9 Internodium 11 Internodium 13 Internodium 15 Gemiddelde. 60.3. 11.5. 119.9. 8.4. 291.2. 18.2. 71.1. 13.0. 132.7. 7.3. 323.1. 15.0. 74.5. 10.5. 137.0. 5.1. 327.4. 8.0. 67.1. 9.7. 139.3. 8.2. 315.6. 16.0. 62.4. 11.7. 142.0. 11.5. 310.0. -. 55.4 65.1. 4.4. 146.3. 10.2. 305.9. -. 136.2. 312.2. Tabel 6. Tijd (uren) die nodig is om 50 % van de maximale gasproductie te bereiken bij fermentatie van internodia 5, 7, 9, 11, 13 en 15 van de maisgenotypen Ambrosini en Aastar, geoogst op 14 Augustus 2012. Ambrosini Aastar Internodium 5 17.0 13.6 Internodium 7 14.6 12.7 Internodium 9 14.3 11.8 Internodium 11 12.6 11.7 Internodium 13 12.2 11.5 Internodium 15 13.0 11.8 14.0 12.2 Gemiddelde.

(25) Animal Nutrition Group. -25-. Fig. 12. Gasproductiecurven van internodia 5, 7, 9, 11, 13 en 15 van Ambrosini, geoogst op 14 Augustus 2012.. Fig. 13. Gasproductiecurven van internodia 5, 7, 9, 11, 13 en 15 van Aastar, geoogst op 14 Augustus 2012..

(26) Animal Nutrition Group. - 26 -. Relatie ligninegehalte en in-vitro-fermentatie Figuur 14 laat de relatie zien tussen het ligninegehalte (ADL) en de totale fermentatie na 72 uur. De figuur laat zien dat er een redelijke negatieve correlatie is tussen de totale gasproductie en het ligninegehalte. De correlatie is sterker als de gasproductie tussen 3 en 20 uur genomen wordt, dus alleen de fermentatie van de celwanden (r2 = 0.66) (fig. 15).. Fig. 14. Relatie ligninegehalte (ADL, g/kg OS) en de gasproductie na 72 uur incubatie (r2 = 0.56).. Fig. 15. Relatie ligninegehalte (ADL, g/kg OS) en de gasproductie tussen 3 en 20 uur incubatie (r2 = 0.66)..

(27) Animal Nutrition Group. -27-. Het ligninegehalte heeft ook een positieve invloed of de halfwaardetijd, de tijd die nodig is om 50% van de maximale gasproductie te verkrijgen (Fig. 16). Dit betekent dus dat ligninegehalte een negatieve invloed heeft op de fermentatiesnelheid (r2 = 0.38).. Fig. 16. Relatie ligninegehalte (ADL, g/kg OS) en de tijd (h) die nodig is voor 50 % van de maximale gasproductie (r2 = 0.38).. Conclusies De chemische samenstelling van de internodia nr. 7, geoogst gedurende het groeiseizoen laat zien dat er geen duidelijke trend is in zowel het NDF als het ADF gehalte. Wel is er een trend voor een hoger gehalte ADL in ouder weefsel. Dit geldt zeker voor Aastar. Binnen een plant van Ambrosini is er geen duidelijke trend voor het NDF-gehalte in de verschillende internodia. Voor Aastar is er een lichte toename te zien in het NDF-gehalte in de hoger gelegen internodia. Het ADF-gehalte en ADL-gehalte neemt licht af, naarmate het internodium hoger is in de plant. Dit geldt zowel voor Ambrosini als voor Aastar. Voor zowel Ambrosini als Aastar is er een duidelijke afname van de fermentatie van de celwanden (gasproductie tussen 3 en 20 uur) bij toenemende ouderdom. Binnen een plant is er een trend voor een hogere gasproductie, naarmate het internodium hoger in de plant aanwezig is. Dit geldt voor beide genotypen. De fermentatie van Aastar is in alle gevallen hoger dan dat van Ambrosini. Er is een duidelijke correlatie tussen het lignine-gehalte en de totale fermentatie (gasproductie) (r2 = 0.56) en tussen het lignine-gehalte en de fermentatie van de celwanden (gasproductie tussen 3 en 20 uur) (r2 = 0.66). Ook was er een relatie tussen het ligninegehalte en de snelheid van fermentatie (tijd nodig voor 50 % van de maximale gasproductie) (r2 = 0.38)..

(28) Animal Nutrition Group. - 28 -. Anatomie en Microscopie Materialen en methoden Coupes en kleuringen Het 7e internodium van de planten werd geoogst en aanvankelijk bewaard bij 4°C. De internodia die niet direct werden gebruikt werden bewaard bij -20°C. Door te fixeren kunnen de internodia veel langer bewaard worden. Kleine stukjes van de internodia werden gefixeerd in een oplossing met 2% paraformaldehyde (PFA), 0.1% glutaaraldehyde (GA), 0.05 M P4O en 10% 0.5 M pipes buffer. Met een scherp scheermes werden stukjes van 1,5 tot 2 cm uit de internodia gesneden en in flessen met de fixeervloeistof gedaan. Om de fixatievloeistof goed in het weefsel te laten trekken werd er een vacuüm aangelegd van ongeveer 0.2 atmosfeer. Na een dag werd de onderdruk opgeheven en de fixeervloeistof 1 op 1 verdund met water en werden de monsters bewaard bij 4°C. Daarna werden de monsters eerst gewassen met water en vervolgens werden dwarsdoorsnedes van de stengels gemaakt van 100 tot 120 µm dikte met een Reichert sledemicrotoom. Voor analyse met een microscoop met een kleinere vergroting werden coupes gemaakt van 250 µm. De coupes werden gekleurd met een oplossing van 1% phloroglucinol in 20% HCl gedurende 15 minuten. Daarna werd de kleuroplossing weggespoeld en de coupes bekeken door een microscoop. Om vervaging van de kleuring te voorkomen, werden de coupes gefotografeerd binnen 15 minuten na de kleuring, met een Nikon 80i microscoop. Bij vergrotingen van 8 tot 100 keer werd een Zeiss (Zeiss, Wetzlar, Duitsland) binoculair gebruikt. Bladlengte De lengte van de bladeren behorende bij het 7e internodium werd gemeten, gedurende het groeiseizoen. Op 14 augustus werd de lengte van alle bladeren binnen een plant gemeten bij beide genotypen. Sclerenchym rond de vaatbundels Het aantal lagen sclerenchym aan de floëem-kant van verscheidene vaatbundels werd geteld op verschillende afstand van de epidermis. Hierbij werd een vergroting van 100x gebruikt. De dikte van de celwanden van het sclerenchym-weefsel werd bepaald bij een vergroting van 400x. Door een zwart-wit afdruk te maken van een doorsnede van de stengel is het mogelijk om met behulp van Image J software de celwandconcentratie in een sclerenchym-bundel te berekenen. Vaatbundels Van de internodia 5, 9, 13 en 17 van Ambrosini en Aastar werden vele foto’s gemaakt van vaatbundels van de epidermis tot aan het midden van de stengel. Verschil in kleurintensiteit van de vaatbundels geeft het verschil in lignificatie weer. Het oppervlakte van de celwanden in dwarsdoorsnedes (250 µm) van beide cultivars werd bepaald door opnames te analyseren met het softwareprogramma Image J. Dit werd gedaan bij verschillende internodia (5, 8, 11 en 14) om zo het verloop van onder naar boven in de plant en dus van oud naar jong te zien. Voor internodium 7 werd dit gedaan op 3 verschillende oogstdata (17 Juli, 14 Augustus en 11 September). Dezelfde foto’s werden gebruikt om het totale aantal vaatbundels in dwarsdoorsnedes van de internodia 5, 8, 11 en 14 van de maisstengels van beide cultivars te bepalen, geoogst op 14 Augustus. Dit werd ook gedaan voor internodium 7 op de oogstdata 17 Juli, 14 Augustus en 11 September..

(29) Animal Nutrition Group. -29-. Met behulp van het softwareprogramma Image J werd onderscheid gemaakt tussen de rand en het midden van de dwarsdoorsnedes. Dit werd gedaan door onderscheid te maken tussen het dikwandig sclerenchym in de rand en het dunwandig parenchym in het midden (Jung en Casler, 2006). Van zowel de rand als het midden werd de oppervlakte bepaald en de ratio tussen rand en midden berekend. Vervolgens werd het aantal vaatbundels per cm2 bepaald voor zowel de rand als het midden van de dwarsdoorsnedes. Er werd onderzocht of er een correlatie is tussen de afstand van een vaatbundel tot de epidermis en het oppervlak van het sclerenchym in die vaatbundel.. Resultaten Variatie in bladlengte Variatie in bladlengte binnen een plant werd gemeten om de groei van de plant te analyseren. De resultaten zijn weergegeven in Figuur 17. Deze figuur laat zien dat de bladeren van Aastar langer zijn dan die Ambrosini. Echter van internodium 15 en 16 zijn de bladeren van Ambrosini langer. Bovendien heeft Ambrosini een blad (17) meer dan Aastar, hetgeen wordt veroorzaakt door een snellere ontwikkeling van Aastar.. Fig. 17. Variatie in bladlengte binnen een plant (Ambrosini en Aastar), geoogst op 14 Augustus..

(30) Animal Nutrition Group. - 30 -. Figuur 18 laat de bladlengte van internodium 7 van beide cultivars gedurende het groeiseizoen zien. De resultaten tonen dat de verschillen gedurende het groeiseizoen en tussen de twee cultivars erg klein waren. Dit suggereert dat bij de eerste meting op 17 Juli de bladeren reeds volledig gestrekt waren. De gemiddelde lengte van de bladeren van Ambrosini en Aastar verschilden nauwelijks van elkaar. In de literatuur wordt een gemiddelde bladlengte gevonden van 60 cm voor Aastar en 65 cm voor Ambrosini. In dit experiment was de bladlengte voor beide cultivars rond de 65 cm.. Fig. 18. Bladlengte van het 7e blad gedurende het groeiseizoen van zowel Ambrosini als Aastar. Ontwikkeling vaatbundels In de figuren 19, 20, 21 en 22 zijn foto’s van vaatbundels van de internodia 5, 9, 13 en 17 weergegeven. In deze figuren zijn van linksboven naar rechtsonder de vaatbundels van de rand naar het midden van de stengel te zien. De vaatbundels in het midden hebben minder sclerenchym-weefsel rondom de vaatbundels dan aan de rand. Een ander belangrijk verschil is dat het weefsel rondom de vaatbundels verandert van dikwandige sclerenchym in de oudere internodia en in de rand, naar dunwandig parenchym in de jongere internodia en in het midden van de stengel. Verder is de sclerenchym-laag rondom de vaatbundels kleiner in de jongere internodia dan in de oudere. Figuur 22 (internodium 17) laat zien dat boven in de plant de rand slechts enkele cellagen dik is. Daarentegen is onderin de plant (internodium 5, Fig. 19) de rand vele cellagen dik. De kleur is in de onderste internodia veel intensiever en helderder van in de bovenste internodia, hetgeen duidt op een veel intensievere lignificatie onderin de plant dan bovenin. De plaatjes tonen tevens aan dat de vaatbundels in de jongere internodia kleiner zijn dan in de oudere internodia..

(31) Animal Nutrition Group. -31-. Fig. 19. Ontwikkeling van de vaatbundels in Internodium 5 (variërend van epidermis naar cortex van linksboven naar rechtsonder).. Fig. 20. Ontwikkeling van de vaatbundels in Internodium 9 (variërend van epidermis naar cortex van linksboven naar rechtsonder)..

(32) Animal Nutrition Group. - 32 -. Fig. 21. Ontwikkeling van de vaatbundels in Internodium 13 (variërend van epidermis naar cortex van linksboven naar rechtsonder).. Fig. 22. Ontwikkeling van de vaatbundels in Internodium 17 (variërend van epidermis naar cortex van linksboven naar rechtsonder)..

(33) Animal Nutrition Group. -33-. Oppervlakte van een dwarsdoorsnede Figuur 23 laat de oppervlakte zien van dwarsdoorsnedes van internodia 5, 8, 11 en 14 binnen een plant van zowel Ambrosini als Aastar. Het oppervlakte neemt af van onderin de plant naar boven toe. De resultaten laten geen significante verschillen zien tussen de twee genotypen. Het oppervlak van internodium 7 van beide genotypen werd gemeten op 3 verschillende oogstdata nl: 17 juli (701.5 GGD), 14 augustus (1067.5 GGD) en 11 september (1462.5 GGD) (Fig. 24). De resultaten laten zien dat er slechts kleine verschillen waren tussen de verschillende oogstdata en dat er geen verschil in oppervlakte van de dwarsdoorsnedes was tussen de genotypen.. Fig. 23. De ontwikkeling van de totale oppervlakte van een dwarsdoorsnede van de maisstengel.. Fig. 24. Het oppervlakte van een dwarsdoorsnede van internodium 7, geoogst op 3 verschillende data, nl: 17 juli (701.5 GGD), 14 augustus (1067.5 GGD) en 11 september (1462.5 GGD) ..

(34) Animal Nutrition Group. - 34 -. Vaatbundels Figuur 25 geeft het totale aantal vaatbundels (VB) weer in een dwarsdoorsnede van verschillende internodia van stengels van Ambrosini en Aastar, geoogst tijdens de bloei (14 augustus). Deze figuur laat duidelijk zien dat er een afname is van het aantal vaatbundels van onder in de plant (internodium 5) naar boven in de plant (internodium 14). Boven in de plant zijn de internodia ook veel dunner dan onder in de plant. De onderste internodia moeten steviger zijn, omdat zij de gehele plant moeten dragen. Er is vooral een afname in het aantal vaatbundels te zien tussen internodia 8 en 11. Er bleek geen significant verschil te zijn in het aantal vaatbundels per dwarsdoorsnede tussen Ambrosini en Aastar.. Fig. 25. Totaal aantal vaatbundels per dwarsdoorsnede van verschillende internodia van Ambrosini en Aastar.. Fig. 26. Totaal aantal vaatbundels per dwarsdoorsnede van internodium 7 Ambrosini en Aastar, geoogst op 17 juli (701.5 GGD), 14 augustus (1067.5 GGD) en 11 september (1462.5 GGD)..

(35) Animal Nutrition Group. -35-. Figuur 26 geeft het totale aantal vaatbundels (VB) weer in een dwarsdoorsnede van internodium 7 van stengels van Ambrosini en Aastar, geoogst op 3 verschillende data (1707, 14-08 en 11-09). De figuur laat een lichte daling in het aantal vaatbundels zien gedurende het groeiseizoen. Op alle oogstdata heeft Ambrosini iets meer vaatbundels dan Aastar, echter het verschil is alleen op 11 september significant. Oppervlakte rand en kern Figuur 27 toont de oppervlakte van de kern van dwarsdoorsnedes van verschillende internodia van stengels van Ambrosini en Aastar, geoogst tijdens de bloei (14 augustus). Van internodium 14 naar beneden naar internodium 8 is er een duidelijke toename te zien in de oppervlakte van de kern. Dit komt ook doordat de diameter van het internodium groter wordt naarmate het internodium lager in de plant aanwezig is. Internodium 5 vormt een uitzondering. Omdat de onderste internodia de plant moeten dragen en daarom stevig moeten zijn, zou veel dunwandig parenchym in deze internodia de plant verzwakken.. Fig. 27. Oppervlakte van de kern van verschillende internodia van Ambrosini en Aastar. De oppervlakte van de kern van internodium 7 werd bepaald op verschillende oogstdata, gedurende het groeiseizoen (fig. 28). De oppervlakte van de kern van internodium 7 bedroeg ongeveer 60 mm2. Internodium 7, geoogst op 14 augustus, had een iets kleiner kernoppervlak dan de monsters geoogst op de andere data. Er werd geen significant verschil gevonden tussen de twee cultivars. Figuur 29 toont de oppervlakte van de rand van verschillende internodia van zowel Ambrosini als Aastar. De oppervlakte nam toe van boven in de plant naar onderen, waar de oudere internodia zich bevinden die de totale plant moeten dragen. Extra stevig sclerenchym en vaatbundels in deze internodia dragen bij aan de stevigheid van de plant. In alle internodia (behalve 8) had Aastar een iets groter oppervlak van de rand dan Ambrosini, hetgeen ook veroorzaakt wordt door de snellere ontwikkeling van Aastar. Deze snellere ontwikkeling is ook te zien in Fig. 30 waar Aastar op 17 juli en 14 augustus een groter randoppervlakte heeft dan Ambrosini. Echter op 11 september heeft Ambrosini een groter randoppervlakte..

(36) Animal Nutrition Group. - 36 -. Fig. 28. Oppervlakte van de kern van internodium 7 van Ambrosini en Aastar, geoogst op 17 juli (701.5 GGD), 14 augustus (1067.5 GGD) en 11 september (1462.5 GGD).. Fig. 29. Oppervlakte van de rand van verschillende internodia van Ambrosini en Aastar..

(37) Animal Nutrition Group. -37-. Fig. 30. Oppervlakte van de rand van internodium 7 van Ambrosini en Aastar, geoogst op 17 juli (701.5 GGD), 14 augustus (1067.5 GGD) en 11 september (1462.5 GGD).. Aantal vaatbundels in rand en kern Figuur 31 toont het aantal vaatbundels in de kern van dwarsdoorsnedes van diverse internodia van Ambrosini en Aastar, geoogst op 14 augustus. Er is een duidelijke stijging te zien in het aantal vaatbundels in de kern van boven in de plant naar onderen. Naar boven toe hebben bladeren aftakkingen van de vaatbundels. Dit verklaart mede waarom er in de hogere internodia minder vaatbundels aanwezig zijn. Zoals reeds eerder aangegeven zorgen de vaatbundels in de lagere internodia voor stevigheid van die internodia, maar ook van de gehele plant. Figuur 32 laat zien dat er significant meer vaatbundels in de kern van een dwarsdoorsnede van Ambrosini aanwezig waren op verschillende oogstdata dan van Aastar. Een hogere dichtheid aan vaatbundels betekent meer dikwandige cellen en verklaart waarom Ambrosini minder verteerbaar is dan Aastar. Figuur 33 toont het aantal vaatbundels in de rand van dwarsdoorsnedes van diverse internodia van Ambrosini en Aastar, geoogst op 14 augustus. Er is een lichte stijging te zien voor het aantal vaatbundels in Ambrosini en een sterkere stijging in Aastar van boven (jong) naar beneden (oud). Dit betekent dat Ambrosini een hogere dichtheid aan vaatbundels in de rand heeft dan Aastar in de jongere internodia. Bij de oudere internodia is het verschil kleiner. De dichtheid aan vaatbundels in de rand varieert weinig gedurende het groeiseizoen. Figuur 34 laat zien dat de dichtheid vrij stabiel is op ongeveer 350 vaatbundels per vierkante centimeter voor Ambrosini en 300 voor Aastar. Wel is een significant verschil in vaatbundeldichtheid in de rand tussen de twee cultivars, met de meeste vaatbundels voor Ambrosini..

(38) Animal Nutrition Group. - 38 -. Fig. 31. Totaal aantal vaatbundels in de kern per dwarsdoorsnede van verschillende internodia van Ambrosini en Aastar.. Fig. 32. Totaal aantal vaatbundels in de kern van internodium 7 van Ambrosini en Aastar, geoogst op 17 juli (701.5 GGD), 14 augustus (1067.5 GGD) en 11 september (1462.5 GGD)..

(39) Animal Nutrition Group. -39-. Fig. 33. Totaal aantal vaatbundels in de rand per dwarsdoorsnede van verschillende internodia van Ambrosini en Aastar.. Fig. 34. Totaal aantal vaatbundels in de rand van internodium 7 van Ambrosini en Aastar, geoogst op 17 juli (701.5 GGD), 14 augustus (1067.5 GGD) en 11 september (1462.5 GGD)..

(40) Animal Nutrition Group. - 40 -. Verhouding rand en kern Figuur 35 laat de verhouding zien van de oppervlakte van de rand en de kern van dwarsdoorsnedes van verschillende internodia van Ambrosini en Aastar, geoogst op 14 augustus. Deze figuur laat duidelijk zien dat internodium 5 een hoger oppervlakte aan rand heeft dan de bovenliggende jongere internodia. Ambrosini heeft een significant lager percentage rand dan Aastar in internodium 5. In internodium 5 heeft Ambrosini ongeveer 71% kern en 29% rand. Voor Aastar, is dat 67% kern en 33% rand. Het hoger percentage rand in de oudere internodia (lager in de plant) wordt ook veroorzaakt door het indrogen van het materiaal en parenchym krimpt meer dat sclerenchym.. Fig. 35. Verhouding oppervlakte van de rand en de kern van dwarsdoorsnedes van verschillende internodia van Ambrosini en Aastar, geoogst op 14 augustus.. Fig. 36. Verhouding rand en kern van internodium 7 van Ambrosini en Aastar, geoogst op 17 juli (701.5 GGD), 14 augustus (1067.5 GGD) en 11 september (1462.5 GGD)..

(41) Animal Nutrition Group. -41-. Uit figuur 36 blijkt dat Aastar vroeg in het seizoen een hoger percentage rand heeft. Op 14 augustus zijn de percentages ongeveer gelijk voor de twee cultivars en aan het einde van het seizoen heeft Ambrosini een grotere rand dan Aastar. De verhouding rand : kern is gemiddeld 25:75 Figuur 37 laat de verhouding zien tussen het aantal vaatbundels in de rand en in de kern. Meer dan de helft van het totale aantal vaatbundels bevindt zich in de rand van de internodia, hoewel de rand een veel kleiner oppervlak inneemt dan de kern. De grafiek laat zien dat Ambrosini altijd een hoger percentage vaatbundels in de rand heeft dan Aastar.. Fig. 37. Verhouding aantal vaatbundels in de rand en in de kern van dwarsdoorsnedes van verschillende internodia van Ambrosini en Aastar, geoogst op 14 augustus.. Conclusies Er is aangetoond dat bladlengte een goed criterium is om te bepalen welk internodium het 7e is. Verondersteld werd dat de bladlengte van Ambrosini 65 cm is en van Aastar 60 cm. Dit verschil werd echter niet gevonden. De gemiddelde bladlengte van beide cultivars was ongeveer 65 cm. Het lijkt er op dat Aastar zich sneller ontwikkelt dan Ambrosini. Naarmate het seizoen vorderde werden de verschillen kleiner. De ontwikkeling van de vaatbundels, van de kern naar de epidermis, werd getoond middels foto’s, die de literatuur ondersteunen. Er werd meer dikwandige sclerenchymweefsel rondom de vaatbundels gevonden in de rand dan in de kern. De vaatbundels in de kern werden omringd door dunwandig parenchym. De buitenste vaatbundels werden door meer lagen sclerenchym omringd. Bij kleuring met phloroglucinol bleek internodium 5, het onderste onderzochte internodium, het meest intensief te kleuren, een bewijs dat daar de meeste lignificatie was opgetreden. Het is bekend uit de literatuur dat dikwandig en meer gelignificeerde celwanden moeilijker te verteren zijn. Aan de hand hiervan kan men concluderen dat de oudere internodia, dus meer onder in de plant, moeilijker te verteren zijn dan de jongere internodia, meer boven in de plant. Hoewel de verschillen gering waren, strookt dit met de eerder gevonden verschillen in afbraak in pensvloeistof. Er was een stijgende trend te zien van jong naar oud voor de dikte van de internodia. Naar boven toe nam de diameter van de internodia af door het afsplitsen van de bladeren..

(42) Animal Nutrition Group. - 42 -. Het totaal aantal vaatbundels in een maisplant daalt van onder naar boven, voornamelijk het gevolg van de afnemende diameter van de internodia. Hierdoor neemt ook het oppervlak van zowel de rand als de kern toe van boven naar beneden in de plant. In Internodium 5 heeft de rand het grootste oppervlak en is de kern het kleinste. Dit grotere oppervlak voor de rand en het grotere aantal vaatbundels in de rand, is niet alleen gerelateerd aan de diameter, maar zorgt ook voor meer sterkte en stijfheid. De onderste internodia moeten het gewicht van de plant dragen. De dichtheid van het aantal vaatbundels nam duidelijk toe van boven naar beneden in de maisplant, in zowel de rand als de kern. Bij iedere knoop tussen twee internodia wordt een blad gevormd en dan splitsen een aantal vaatbundels zich af en vormen de nerven in de bladeren. Ambrosini heeft een duidelijk hogere dichtheid aan vaatbundels tijdens de gehele groeiperiode, hetgeen mede een oorzaak is van het minder verteerbaar zijn van Ambrosini dan van Aastar. De verhouding van het oppervlak van de rand en de kern is in de jonge internodia constant en ligt rond de 80% kern en 20% rand. Het 5e internodium laat een veel groter oppervlak zien aan rand, hetgeen te maken heeft met het feit dat de onderste internodia sterk moeten zijn om de plant te kunnen dragen. Meer dan 50% van de vaatbundels bevindt zich in de rand, dat slechts 20% van de diameter uitmaakt. Ambrosini heeft altijd een hoger percentage vaatbundels in de rand dan Aastar. Er kan worden geconcludeerd dat de vaatbundeldichtheid het enige echte verschil is tussen de cultivars Ambrosini en Aastar. Dit lijkt anatomisch gezien de belangrijkste oorzaak te zijn voor de betere verteerbaarheid van Aastar ten opzichte van Ambrosini..

(43) Animal Nutrition Group. -43-. Verder onderzoek Als het om microscopisch onderzoek gaat kan een grote verbetering worden bereikt door gebruik te maken van in Technovit, een soort plastic, ingebedde stukjes weefsel, in plaats van verse coupes. Met behulp van een roterende microtoom (1-3μm) kunnen op deze manier veel dunnere secties worden gesneden en kan zo een veel gedetailleerder beeld worden verkregen. Figuur 38-40 geven wat impressies van de plaatjes die na inbedden met Technovit gemaakt kunnen worden. In Fig. 38 is een vaatbundel te zien na kleuring met tolueenblauw. Op deze foto is veel meer detail te zien en de celwanddikte kan veel nauwkeuriger worden gemeten. In Fig. 39 en 40 is een dwarsdoorsnede van een vaatbundel te zien. Ook de andere waarnemingen kunnen met veel meer precisie gedaan worden door het materiaal in te bedden in Technovit. Een ander voordeel is dat verschillende kleuringen gebruikt kunnen worden. Zo kunnen zowel eiwit, vet, celwandcomponenten, lignine en andere stoffen zichtbaar gemaakt worden. Een nadeel van deze methode is dat het inbedden een tijdrovende klus is die nauwkeurig uitgevoerd moet worden. Bovendien is er geavanceerde apparatuur (microtoom) voor nodig.. Fig. 38. Een dwarsdoorsnede van 2 µm van een vaatbundel na inbedden met Technovit en kleuring met tolueenblauw..

(44) Animal Nutrition Group. - 44 -. Fig. 39. Een lengte van 2 µm van een vaatbundel na inbedden met Technovit en kleuring met tolueenblauw.. Fig. 39. Een lengte van 2 µm van een vaatbundel na inbedden met Technovit en kleuring met tolueenblauw..

(45) Animal Nutrition Group. -45-. Pyrolyse MassaSpectrometrie (PyMS) Internodium nr. 7 van de maisplanten Ambrosini en Aastar, geoogst op 17 Juli, 14 Augustus, 11 September en 23 Oktober, alsmede de internodia 5, 9, 13 en 15 van planten geoogst op 14 Augustus, werden onderzocht met behulp van Pyrolyse Massaspectrometrie (PyMS). Een schema van een PyMS-apparaat is te zien in Fig. 40. Het principe van PyMS is als volgt. Een zeer kleine hoeveelheid monster (40 – 70 µg) van een zeer goed en fijn gemalen (Retsch kogelmolen) monster wordt anaeroob zeer snel verhit in een elektrisch veld, waardoor de macromoleculen niet verbranden, maar uiteen vallen in brokstukken. Deze kleinere moleculen (brokstukken) worden via een gasstroom (helium) gescheiden in een gaschromatograaf en vervolgens gedetecteerd met behulp van een massaspectrofotometer (zie review Boon, 1992). Op deze manier worden spectra verkregen die iets zeggen over de samenstelling van het uitgangsmateriaal (Fig. 41). Met name wordt informatie verkregen over de verschillende bouwstenen (Fig. 42) die tezamen het lignine vormen en over de onderlinge verhoudingen. Met name de verhouding tussen syringyl alcohol en guaiacyl alcohol, de zogenaamde S:Gratio is een belangrijke parameter die iets zegt over de afbreekbaarheid. Een hoge S:G-ratio is een indicatie voor een slechte verteerbaarheid.. Fig. 40. Schematische voorstelling van een pyrolyse-gaschromatograaf-massaspectrometer (PyMS)..

(46) Animal Nutrition Group. - 46 -. Fig. 41. Voorbeeld van twee spectra verkregen van een maisinternodium met behulp van een pyrolyse-gaschromatograaf-massaspectrometer (PyMS).. Fig. 42. Drie belangrijke bouwstenen van lignine. H = Phenol, G = Guaiacyl alcohol en S = Syringyl alcohol.. S:G-ratio De S:G-ratio in internodium 7 van de genotypen Ambrosini en Aastar, geoogst op verschillende data is weergegeven in Tabel 7. Uit deze tabel blijkt dat de S:G-ratio toeneemt gedurende het seizoen. Zowel voor Ambrosini als voor Aastar werd de laagste S:G-ratio waargenomen in het jongste internodium, geoogst op 17 Juli. Voorts blijkt dat de S:G-ratio in alle gevallen het hoogst was in Ambrosini en het laagst in Aastar. De S:G-ratio in de internodia 5, 9, 13 en 15 van de maisgenotypen Ambrosini en Aastar, geoogst op 14 Augustus 2012, staat weergegeven in Tabel 8. Deze tabel laat zien dat de S:G-ration, voor beide genotypen, afneemt naarmate het internodium hoger in de plant aanwezig was. Het oudste internodium, onderin de plant, heeft de grootste S:G-ratio, terwijl de jongere internodia, hoger in de plant een kleinere S:G-ratio laten zien. Ook Tabel 8 laat zien dat de S:G-ratio voor Ambrosini hoger is dan van Aastar..

(47) Animal Nutrition Group. -47-. Tabel 7. De S:G-ratio (Syringyl alcohol/Guaiacyl alcohol) in internodium 7 van maisplanten Ambrosini en Aastar, geoogst op verschillende data in 2012. Ambrosini Aastar Juli 17 0.45 0.35 Augustus 14 0.53 0.43 September 11 0.59 0.41 Oktober 23 0.56 0.46 0.53 0.41 Gemiddelde. Tabel 8. De S:G-ratio (Syringyl alcohol/Guaiacyl alcohol) in de internodia 5, 9, 13 en 15 van de maisgenotypen Ambrosini en Aastar, geoogst op 14 Augustus 2012. Ambrosini Aastar Internodium 5 0.58 0.51 Internodium 9 0.46 0.38 Internodium 13 0.36 0.33 Internodium 15 0.36 0.28 0.44 0.38 Gemiddelde. S:G-ratio en celwandafbraak in pensvloeistof De relatie tussen de S:G-ratio en de totale gasproductie na 72 uur incubatie van de monsters in pensvloeistof staat weergegeven in Figuur 43. Er blijkt een negatieve correlatie te bestaan met een r2 van 0.50. Naarmate de S:G-ratio hoger is neemt de verteerbaarheid af. Dit geldt zowel voor Ambrosini als voor Aastar. De relatie tussen de S:G-ration en de gasproductie ten gevolge van de afbraak van de celwanden in pensvloeistof, dus de gasproductie tussen 3 en 20 uur, staat weergegeven in Figuur 44. Hier wordt een veel sterkere correlatie (r2 = 0.85) gevonden dan met de totale gasproductie (Fig. 43). De correlatie tussen de afbraak van de celwanden en de S:G-ratio is 0.85, terwijl de correlatie met het ligninegehalte slechts 0.66 was. De S:G-ratio is dus meer bepalend voor de afbraak dan het ligninegehalte. Ook de correlatie tussen de S:G-ratio en de snelheid van gasproductie (Fig. 45) was hoger (r2 = 0.45) dan tussen het ligninegehalte en de snelheid van gasproductie (Fig. 16, r2 = 0.38). Ook dit laat zien dat de S:G-ratio meer bepalend is voor de snelheid van afbraak, naast de mate van afbraak..

(48) Animal Nutrition Group. Fig. 43. Relatie S:G-ratio en gasproductie na 72 uur incubatie (r2 = 0.50).. Fig. 44. Relatie S:G-ratio en gasproductie tussen 3 en 20 uur incubatie (r2 = 0.85).. - 48 -.

(49) Animal Nutrition Group. -49-. Fig. 45. Relatie S:G-ratio en de tijd (h) die nodig is voor 50 % van de maximale gasproductie (r2 = 0.45).. Conclusies Er kan geconcludeerd worden dat de samenstelling van de lignine een belangrijke factor is of een celwand wel of niet afgebroken wordt met behulp van micro-organismen in de pens. De afbraak van de celwanden (gasproductie tussen 3 en 20 uur) is veel sterker gecorreleerd met de S:G-ratio dan met het ligninegehalte. Het ligninegehalte heeft zeker een negatieve invloed op de afbraak van de celwanden, maar is zeker niet de enige reden waarom een celwand wel of niet wordt afgebroken. Ook de samenstelling van de lignine blijkt van grote invloed te zijn. Meer onderzoek is nodig naar de samenstelling van lignine en de verschillende bindingen van lignine met de koolhydraten in de celwanden en de afbreekbaarheid van die celwanden..

(50) Animal Nutrition Group. - 50 -. Referenties Akin, D.E., Burdick, D., 1981. Reltionship of different histochemical types of lignified cell walls to forage digestibility. Crop. Sci., 21: 577-581 Akin, D.E. 1989. Histological and physical factors affecting digestibility forages. Agron. J. 81:7-24 Akin, D.E., Chesson, A., 1989. Lignification as the major factor limiting forage feeding value especially in warm conditions. In: R. Desroche (ed.), Proc. XVI Int. Grassland Congress, 4-11 October 1989, Nice, France. Association Française pour Production Fouragere. INRO: Route de Saint-Cyr, 78026 Versailles Cedex, France. Vol. 3: 1753-1760. Akin, D.E., Hartley, R.D., Morrison, Ill, W.H., Himmelsbach, D.S., 1990. Diazonium compounds localize grass cell wall phenolics: relation to wall digestibility. Crop. Sci., 30: 985-989 Bennouna B., Lahrouni A., Bethenod O., Fournier B., Andrieu B., Khabba S. 2004. Development of maize internode under drought stress. Journal of Agronomy vol 3. 94102. Boon, J.J. 1992. Analytical pyrolysis mass spectrometry: new vistas opened by temperatureresolved in-source PYMS. Int. J. Mass Spectrometry and Ion Processes 118/119: 755787. Boon, E.J.M.C., Engels, F.M., Struik, P.C., Cone, J.W. 2005. Stem characteristics of two forage maize (Zea mays L.) cultivars varying in whole plant digestibility. II. Relation between in vitro rumen fermentation characteristics and anatomical and chemical features within a single internode. NJAS – Wageningen Journal of Life Sciences 53, 87-109. Boon, E.J.M.C., Struik, P.C., Tamminga, S., Engels, F.M., Cone, J.W. 2008. Stem characteristics of two forage maize (Zea mays L.) cultivars varying in whole plant digestibility. III. Intra-stem variability in anatomy, chemical composition and in vitro rumen fermentation. NJAS-Wageningen J Life Sci 56-1/2: 101-122. Boudet, A.M. 2000. Lignins and lignifications: selected issues, Plant Phys. Biochem. Vol. 35: 81-96 Burrit, F.J.W., Bittner, E.A., Street, A.S., Anderson, J.C., 1984. Correlations of phenolic acids and xylose content of cell wall with in vitro dry matter digestibility of three maturing grasses. J. Dairy Sci., 67: 1209-1213 Chesson, A. 1993. Mechanistic models of forage cell wall degradation. p.347-376, In H.G Jung, D.R. Buxton, R.D. Hatfield, and J. Ralph, eds. Forage cell wall structure and digestibility. ASA-CSSA-SSSA, Madison, WI, USA Cone, J.W., Engels F.M., 1990. Influence of growth temperature on anatomy and in-vitro digestibility of maize tissues. J. Agric. Sci., Cambridge, 114: 207-212 Cone, J.W., A.H. Van Gelder, G.J.W. Visscher, L. Oudshoorn, 1996. Use of a new automated time related gas production apparatus to study the influence of substrate concentration and source of rumen fluid on fermentation kinetics. Animal Feed Science and Technology 61: 113-128. Cone, J.W., A.H. Van Gelder, F. Driehuis, 1997. Description of gas production profiles with a three-phasic model. Animal Feed Science and Technology 66: 31-45. Deinum, B., Struik, P.C. 1989. Genetic variation in digestibility of forage maize (Zea mays L.) and its estimation by Near Infrared Reflectance Spectroscopy (NIRS). An analysis. Euphytica 42: 89−98. Engels, F.M., 1989. Some properties of cell wall layers determining ruminant digestion. In: A. Chesson and E.R. Orskov (ed.), Physico-chemical Characterisation of Plant Residues for Industrial and Feed Use. Elsevier Applied Science, London and New York, pp. 80-87 Engels, F.M., Schuurmans, J.L.L., 1992. Relationship between structural development of cell walls and degradation of tissues in maize stems. J. Sci. Food Agric. 59: 45-51. Engels, F.M., Jung H.G., 2005. Alfalfa stem tissues: impact of lignifications and cell length on ruminal degradation of large particles. Anim. Feed Sci. Technol. 120: 309-321.

No results found