Proefopzet

Het proefwerk werd uitgevoerd op het Proefcentrum voor Sierteelt te Destelbergen. Op 02/10/2019 en 23/01/2020 werden 150 planten van respectievelijk ‘H. Vogel’ Pia en ‘Sachsenstern’ in forcerie geplaatst. Wanneer de planten kleurtonend waren, op 10 oktober 2019 voor ‘H. Vogel’ Pia en 6 februari 2020 voor ‘Sachsenstern’, werden de planten uit de forcerie gehaald en bewaard voor 1 en 2 weken bij drie verschillende temperaturen: 2°C, 7°C en 15°C (Tabel 2). Voor elke combinatie van temperatuur en bewaarduur werden er 20 planten in koeling gebracht, 10 planten voor de niet-destructieve metingen en 10 planten voor de destructieve metingen. Na bewaring werden de planten in huiskameromstandigheden geplaatst om de uitbloei te beoordelen. Als controle werden planten zonder bewaring rechtstreeks in huiskameromstandigheden geplaatst. De luchtvochtigheid (RV), de temperatuur en lichtintensiteit werden tijdens de forcerie, de bewaring en in de huiskamer tijdens de uitbloei opgevolgd met dataloggers.

De destructieve metingen bestonden uit het nemen van stalen van de bladeren en bloemen voor de bepaling van de suiker- en zetmeelinhoud. Er werden bladstalen genomen voor de bepaling van de stikstofinhoud en voor de bepaling van de waterinhoud. De niet-destructieve metingen werden gedaan op de planten die vervolgens in een huiskamer omgeving werden geplaatst voor de opvolging van de bloei. De niet-destructieve metingen waren het meten van de chlorofylfluorescentie, chlorofylconcentratie en bladreflectantiepatronen. Hierna werd de ontwikkeling van de bloei voor iedere bewaringsconditie opgevolgd door middel van bloeitellingen tot de bloemen verwelkten.

27

Tabel 2 Overzicht van de toegepaste bewaarduur en bewaartemperatuur

Behandeling Einde bewaring

‘Helmut Vogel’ Pia Sachsenstern

Object 1 0 weken bewaring - controle 10 oktober 6 februari

Object 2 1 week bewaring – 2°C 17 oktober 13 februari

Object 3 1 week bewaring – 7°C

Object 4 1 week bewaring – 15°C

Object 5 2 weken bewaring – 2°C 24 oktober 20 februari

Object 6 2 weken bewaring – 7°C

Object 7 2 weken bewaring – 15°C

3 Suiker- en zetmeelbepaling van blad en bloemknop

Wanneer planten in het donker bewaard worden, kunnen ze niet meer aan fotosynthese doen. Daarom moet de plant beroep doen op zijn suikerreserves om zijn metabolisme te laten doorgaan. Om te weten hoe ver de suikerreserves afgebroken werden tijdens de bewaarfase, werd de concentratie aan oplosbare koolhydraten en zetmeel bepaald. De suiker- en zetmeelconcentratie van het blad en de bloemknop werden destructief bepaald. Hiervoor werden zes planten gebruikt. De stalen van deze metingen werden onmiddellijk na bewaring genomen. Er werden telkens bladeren of bloemknoppen van twee planten samengevoegd om een mengstaal te maken. Dit werd driemaal uitgevoerd om drie stalen te bekomen. Voor de staalname van de bloemen werden de schubbetjes en de bloemstelen verwijderd. De bladeren of bloemen werden vervolgens elk in een vijzel met vloeibare stikstof verbrijzeld en in een cryobuisje bij -80°C bewaard tot de analyse.

3.1 Suikerbepaling

Voor het bepalen van de concentratie van de oplosbare suikers werd eerst 250 – 300mg van de stalen afgewogen in centrifugeerbuisjes. Na het toevoegen van 6ml ethanol 80% werden de stalen gemengd met een vortex en voor 3 uur in een waterbad van 45°C geplaatst voor extractie. Hierna werden de stalen opnieuw gemengd met de vortex en voor 5 minuten gecentrifugeerd bij kamertemperatuur op 5000rpm. Het supernatant werd in een beker gepipetteerd. De overblijvende pellet bevatte het onoplosbare zetmeel en werd opzij gezet voor het volgende deel van de extractie.

4 ml van het supernatant werd in een centrifugeerbuisje gebracht met 200 mg PVPP (50mg/ml). Na het mengen met een vortex werden de buisje opnieuw gecentrifugeerd voor 5 minuten op 5000rpm. 2 ml van het supernatant werd in een schaaltje gebracht en in een trekkast geplaatst voor overnachting, om de ethanol te laten verdampen. De volgende dag werd 2 ml gedestilleerd water in de schaaltjes gebracht om alle suikers opnieuw in oplossing te brengen. 1 ml van de vloeistof werd vervolgens in een kolfje van 5 ml gebracht en aangelengd met gedestilleerd water. De oplossing werd gefilterd door een 0,22 μm filter in een cupje van de HPCL autosampler. De verdere analyse via high-performance liquid

chromatography (HPLC) kon door het ingaan van de Coronamaatregelen niet uitgevoerd worden.

28

3.2 Zetmeelbepaling

De eerste stap is de zure hydrolyse van zetmeel naar glucose. De pellet na extractie van de oplosbare suikers bevat het onoplosbare zetmeel en wordt gebruikt bij de verdere analyse. De pellet werd 3 maal met 1,5 ml ethanol 80% gewassen om alle resterende oplosbare koolhydraten te verwijderen. Na elke wasbeurt werden de centrifugeerbuisjes gecentrifugeerd. Wanneer alle opgeloste koolhydraten verwijderd waren, werden ze aan de lucht gedroogd gedurende de nacht. De volgende dag werd 5 ml HCl toegevoegd en werden de buisjes gedurende 2 uur in een warmwaterbad van 95°C geplaatst voor extractie. Na het mengen met een vortex werden ze opnieuw gecentrifugeerd voor 5 minuten op 5000rpm. Het supernatant werd in een beker gepipetteerd en de pellet werd nog eens gewassen met HCl. Beide supernatant werden samengebracht. De vloeistof in de beker werd door titratie met NaOH op pH 7,6 gebracht en overgegoten in een 10 ml kolfje. De beker werd met gedestilleerd water nagespoeld en het kolfje werd aangelengd, geschud en bewaard in de koelkast.

Voor de verdere analyse zijn enkele reagentia nodig. Deze werden als volgt klaargemaakt. Voor de Tra buffer werd 14g triethanolamine met 250mg MgSO4.7H2O gemengd en

aangelengd met 75ml water. De pH werd aangepast tot 7,6 met NaOH en aangelengd met gedestilleerd water tot 100ml. Voor de NADP-oplossing werd 100mg NADP-Na2 opgelost in

10ml gedestilleerd water. Tot slot werd voor de ATP-oplossing 50mg ATP-Na2A2 met 500mg

NaHCO3 opgelost in 10ml water. Deze werden samengevoegd tot één buffer.

Hierop volgt de zetmeelbepaling, uitgedrukt in glucose-equivalenten. In elke cuvet werd 1200μl buffer gepipetteerd. De stalen werden op kamertemperatuur gebracht en toegevoegd in de cuvet. Vervolgens werd gedestilleerd water bijgevoegd, zodat de hoeveelheid staal en water samen 1920μl bedroeg. Ook een blanco (1200μl buffer + 1920μl gedestilleerd water) en standaard glucoseoplossing (1g/l ; 1200μl buffer + 100 μl glucose oplossing + 1820 μl gedestilleerd water) werden bereid.

Voor elke cuvet werd de absorbantie A1 van de oplossing bij 340nm gemeten. Hierna werd aan elke cuvet 20 μl van het enzymmengsel hexokinase(HK)glucose-6- fosfaatdehydrogenase (G6P-DH) toegevoegd en werd na 15 minuten de absorbantie A2 bij 340nm bepaald.

Voor het berekenen van de zetmeelconcentratie (c) werd volgende formule gebruikt: c(g/l) = 𝛥𝐴∗(𝑉∗𝑀𝑊)

(𝜀∗𝑑∗𝑣∗1000)

V = eindvolume (3.14ml) v = volume staal (ml)

MW = moleculaire gewicht van de te analyseren molecule (staal: 162.1 g/mol ; standaard glucose: 180.16 g/mol) d = lichtpad (1cm)

ε = extinctiecoëfficiënt ( 6.3 l/mmol*cm) ΔA = (A2-A1)staal – (A2-A1)Blanco

29