3. Resultaten & bespreking
3.2.2. Metabolisatie van methyl-1-testosteron in het muismodel
Na analyse van alle muisurines op GC-MS worden de bekomen data geëvalueerd op basis van de vergelijking van de resultaten van de pre- en post-administratiestudies.
3.2.2.1. Chimere muis
A. Pre-administratie urine
De pre-administratie urines van alle muizen bleken behalve de aangerijkte IS geen componenten van methyl-1-testosteron te bevatten (Figuur 24) en kunnen dus als een negatieve urine beschouwd worden. Vervolgens zijn alle componenten die exclusief gedetecteerd worden in de post-administratie urine, afkomstig van de toediening van methyl-1-testosteron of de metabolisatie ervan. Ook hier worden de endogene steroïden afkomstig van de eigen productie van de muizen niet gedetecteerd via de gebruikte methode, wat een voordeel oplevert bij de evaluatie van de urinestalen.
13.30 13.40 13.50 13.60 13.70 13.80 13.90 14.00 14.10 14.20 14.30 14.40
0
Ion 446.00 (445.70 to 446.70): 1106BL.D Ion 431.00 (430.70 to 431.70): 1106BL.D Ion 356.00 (355.70 to 356.70): 1106BL.D Ion 194.00 (193.70 to 194.70): 1106BL.D
IS
Figuur 24: Chromatogram van de pre-administratie urine met de aangerijkte IS op RT 14.36 min.
35 B. Post-administratiestudie
De resultaten van alle chimere muizen zijn gelijklopend. Hierna worden de resultaten van slechts 1 chimere muis gegeven om meer in detail te bespreken.
Methyl-1-testosteron, de toegediende component, komt voor in de urine van alle chimere muizen als bewijs van een succesvolle toediening. Figuur 25 stelt het chromatogram voor van methyl-1-testosteron en de inwendige standaard.
Methyl-1-testosteron komt voor op retentietijd 13.39 min met als belangrijkste fragmentionen m/z 446 ([M]+), 431, 356, 206 en 194 (Figuur 26). Ion m/z 431 ontstaat door verlies van een methyl-groep [M-15]+ terwijl ion m/z 356 ontstaat door afsplitsing van een TMS-OH groep (-90 Da) [M-15-OTMS]+. Ionen m/z 206 en 194 wijzen op de verschillende plaatsen waar de A- en B-ring worden afgesplitst van de C- en D-ring [22]. De inwendige standaard 17α-methyltestosteron wordt gedetecteerd op retentietijd 14.36 min en heeft als belangrijkste fragmentionen m/z 446 en 301 (Figuur 27). Opnieuw worden de inwendige standaard en methyl-1-testosteron perfect van elkaar gescheiden, ondanks het feit dat ze dezelfde massa hebben. De componenten worden op een verschillende manier gefragmenteerd wat resulteert in massaspectra met verschillende abundanties van fragmentionen.
13.30 13.40 13.50 13.60 13.70 13.80 13.90 14.00 14.10 14.20 14.30 14.40 0
Ion 446.00 (445.70 to 446.70): 1106200U.D Ion 431.00 (430.70 to 431.70): 1106200U.D Ion 356.00 (355.70 to 356.70): 1106200U.D Ion 194.00 (193.70 to 194.70): 1106200U.D
Methyl-1-testosteron
IS
Figuur 25: Chromatogram van methyl-1-testosteron op RT 13.39 min en de IS op RT 14.36 min.
36 Figuur 26: Massaspectrum van methyl-1-testosteron (RT 13.39 min) met fragmentionen m/z 446, 431, 356, 206 en 194.
Figuur 27: Massaspectrum van de 17a-methyltestosteron (IS) (RT 14.36 min) met fragmentionen m/z 446 en 301.
37 Figuur 28 geeft een overzicht van 6 andere metabolieten die gedetecteerd worden in de muisurine na toediening van methyl-1-testosteron.
De metabolieten hydroxy W (Figuur 29), hydroxy X (Figuur 30), hydroxy Y (figuur 31) en hydroxy Z (Figuur 32) komen voor op retentietijden 14.60 min, 15.60 min, 15.86 min en 16.01 min respectievelijk. De massaspectra van metabolieten hydroxy W, X en Z komen sterk overeen met elkaar met kleine verschillen in de verhoudingen van de ionen. De belangrijkste fragmentionen van metaboliet hydroxy W zijn m/z 534, 444, 429, 339 en 206 terwijl hydroxy X als belangrijkste fragmentionen m/z 534, 519, 444 en 339 heeft. De ionen m/z 469, 454, 398 en 383 zijn afkomstig van een andere component die ook voorkomt in de pre-administratie urine van de muizen (interferentie). Metaboliet hydroxy Z heeft als belangrijkste fragmentionen m/z 534, 519, 429, 339, 231, 218 en 194. De aanwezigheid van ion m/z 534 doet vermoeden dat methyl-1-testosteron tijdens de metabolisatie gehydroxyleerd wordt.
Enkel bij metaboliet hydroxy Z zijn ionen m/z 218 en 231 duidelijk aanwezig wat een indicatie is voor hydroxylatie op de C16 positie [22]. Bij hydroxy W en X zijn ionen m/z 218 en 231 slechts in geringe mate aanwezig waardoor niet met zekerheid gesteld kan worden dat er sprake is van een C16-hydroxylatie. Door sylilatie van de extra OH-groep wordt het MW van m/z 534 ([M]+) bereikt. Ion m/z 519 ontstaat door afsplitsing van een methylgroep [M-15]+ terwijl ion m/z 444 ontstaat door afsplitsing van een TMS-OH groep [M-OTMS]+. Ionen m/z 429 en 339 ontstaan door afsplitsing van tweemaal een TMS-OH groep. Ion m/z 206 en 194 wijzen opnieuw op de plaatsen van afsplitsing van de A- en B-ring [20]. Metaboliet hydroxy Y heeft als belangrijkste fragmentionen m/z 532 en 517. Dit metaboliet ontstaat
14.60 14.80 15.00 15.20 15.40 15.60 15.80 16.00 16.20 16.40
0
Ion 534.00 (533.70 to 534.70): 1106200U.D Ion 519.00 (518.70 to 519.70): 1106200U.D Ion 622.00 (621.70 to 622.70): 1106200U.D Ion 607.00 (606.70 to 607.70): 1106200U.D Ion 624.00 (623.70 to 624.70): 1106200U.D Ion 609.00 (608.70 to 609.70): 1106200U.D
Hydroxy W
Figuur 28: Chromatogram van metabolieten hydroxy W, X, Y en Z en dihydroxy Y en Z.
38 waarschijnlijk door een hydroxylatie en een extra dubbele binding. Ionen m/z 218 en 231 komen ook hier slechts in geringe mate voor waardoor een C16-hydroxylatie niet met zekerheid bevestigd wordt.
Figuur 29: Massaspectrum van hydroxy W (RT 14.60 min) met fragmentionen m/z 534, 444, 429, 339 en 206.
.
Figuur 30: Massaspectrum van hydroxy X (RT 15.60 min) met fragmentionen m/z 534, 519, 444 en 339.
39 Figuur 31: Massaspectrum van hydroxy Y (RT 15.86 min) met fragmentionen m/z 532 en 517.
Figuur 32: Massaspectrum van hydroxy Z (RT 15.98 min) met fragmentionen m/z 534, 519, 429, 339, 218, 231 en 194.
Metabolieten dihydroxy-methyl-1-testosteron (diOH) Y en Z komen voor op respectievelijke retentietijden 15.95 min en 16.48 min (Figuur 28). Metaboliet diOH Y (Figuur 33) heeft een MW van 624 Da en ontstaat door een dubbele hydroxylatie en een reductie in de A-ring van methyl-1-testosteron. De belangrijkste fragmentionen zijn m/z 624 [M]+ en 609. Ion m/z 609 ontstaat door afsplitsing van een methylgroep [M-15]+. Metaboliet diOH B (Figuur 34) heeft een MW van 622 Da en ontstaat door een dubbele hydroxylatie van methyl-1-testosteron. De belangrijkste fragmentionen zijn m/z 622 ([M]+), 607, 532, 517, 427, 231, 218 en 206. Ion m/z 607 ontstaat door afsplitsing van een methyl-groep [M-15]+, ion m/z 532 ontstaat door afsplitsing van een TMS-OH groep [M-OTMS]+. Ion m/z 517 ontstaat door afsplitsing van een methyl- en TMS-OH groep [M-15-OTMS]+ en ion m/z 427 ontstaat door afsplitsing van een methylgroep en 2 TMS-OH groepen [M-15-(OTMS)2]+. Ionen m/z 231 en 218 wijzen op een C16-hydroxylatie en ion m/z 206 is een indicatie voor de plaats van afsplitsing van de A- en B-ring [22].
40 Figuur 33: Massaspectrum van diOH Y (RT 15.95 min) met fragmentionen m/z 624 en 609.
Figuur 34: Massaspectrum van diOH Z (RT 16.48 min) met fragmentionen m/z 622, 607, 532, 517, 427, 231, 218 en 206.
3.2.2.2. Niet-chimere muis
De niet chimere muizen worden gebruikt als een controle om te bepalen welke metabolieten gevormd worden door muis en/of humane hepatocyten. Aangezien de humanisatie van de muislever geen 100% is (maximum 80%), moet hiervoor immers gecorrigeerd worden.
Bij vergelijking van het chromatogram van de chimere muis (Figuur 25) met dat van de niet-chimere muis (Figuur 35) worden zowel methyl-1-testosteron als de inwendige standaard 17α-methyltestosteron gedetecteerd. Ook hier valt op dat methyl-1-testosteron in een veel lagere hoeveelheid gedetecteerd wordt dan bij de chimere muis. Alle muizen werden nochtans op hetzelfde tijdstip gegaveerd met dezelfde steroïdoplossing.
41 Bij vergelijking van het chromatogram van de chimere muis (Figuur 28) met het chromatogram van de niet-chimere muis (Figuur 36) valt op dat alle metabolieten die gedetecteerd werden bij de chimere muis, ook voorkomen bij de niet-chimere muis. De concentratie waarmee deze metabolieten voorkomen, is voor sommige metabolieten echter veel lager dan bij de chimere muis. Zo wordt metaboliet hydroxy A nauwelijks gedetecteerd.
Metabolieten hydroxy C en D worden eveneens in een veel lagere hoeveelheid gedetecteerd.
Metaboliet hydroxy B echter wordt in een veel grotere hoeveelheid gedetecteerd dan bij de chimere muis.
3.2.3.
13.30 13.40 13.50 13.60 13.70 13.80 13.90 14.00 14.10 14.20 14.30 14.40 14.50 0
Ion 446.00 (445.70 to 446.70): K3200UL.D Ion 431.00 (430.70 to 431.70): K3200UL.D Ion 356.00 (355.70 to 356.70): K3200UL.D Ion 194.00 (193.70 to 194.70): K3200UL.D
Methyl-1-testosteron
IS
Figuur 35: Chromatogram van methyl-1-testosteron en de IS in de niet-chimere muis.
Figuur 36: Chromatogram van metabolieten hydroxy W, X, Y en Z en diOH Y en Z bij de niet-chimere muis.
14.60 14.80 15.00 15.20 15.40 15.60 15.80 16.00 16.20 16.40
0
Ion 534.00 (533.70 to 534.70): K3200UL.D Ion 519.00 (518.70 to 519.70): K3200UL.D Ion 622.00 (621.70 to 622.70): K3200UL.D Ion 607.00 (606.70 to 607.70): K3200UL.D Ion 624.00 (623.70 to 624.70): K3200UL.D Ion 609.00 (608.70 to 609.70): K3200UL.D
Hydroxy W
42
3.2.3. Drievoudige urineanalyse
De urines van 3 chimere muizen en 1 niet-chimere muis werden in drievoud geanalyseerd volgens de besproken extractieprocedure. Dit gebeurt om te corrigeren voor toevalligheden in de extractie en om de herhaalbaarheid/robuustheid van de methode aan te tonen. Er wordt een kwantitatie rapport opgesteld waarbij de responsen (R) van de verschillende metabolieten bepaald worden. Vervolgens worden deze responsen gedeeld door de respons van de inwendige standaard (RIS). Er wordt ook gecorrigeerd voor het urinevolume geproduceerd in die 24 uren (Vurine) (R/RIS x Vurine). De grafieken geven een overzicht van de verschillende metabolieten van methyl-1-testosteron (M1T) en hun abundanties (Figuur 37). Opnieuw is er een verschil tussen de chimere muizen. Het gehalte aan humaan albumine is bij chimere muis 1 het grootst, gevolgd door chimere muis 2 en tenslotte chimere muis 3. Aangezien het gehalte aan humaan albumine bij chimere muis 3 het laagst is, zou het profiel van deze muis ongeveer moeten overeenkomen met het profiel van de niet-chimere muis. Dit is hier niet het geval.
Na analyse van de resultaten van de excretiestudie van methyl-1-testosteron is er op zich niet veel verschil op te merken tussen de chimere en niet-chimere muis, waardoor geen typisch humane metabolieten gedetecteerd worden. Relatief gezien wordt er weinig van de parent compound (methyl-1-testosteron) teruggevonden. Methyl-1-testosteron wordt in het muismodel voornamelijk gehydroxyleerd.
43
Figuur 37: Overzicht van de responsen van de metabolieten na analyse van de urines van 3 chimere en 1 niet-chimere muis in 3-voud na toediening met methyl-1-testosteron.
44 Tabel 6 geeft een overzicht van de verschillende metabolieten van methyl-1-testosteron na metabolisatie in de muis.
Tabel 6: Overzicht van de verschillende metabolieten van methyl-1-testosteron gedetecteerd in de muis.
Metaboliet m/z Retentietijd (min)
45 Alle metabolieten werden zowel in de chimere als niet-chimere muis gedetecteerd. Na vergelijking van de resultaten beschikbaar bij de mens (Tabel 5), worden slechts weinig overeenkomsten teruggevonden. Hierbij moet opgemerkt worden dat de metabolieten α en β diol gedetecteerd door DoCoLab in het WAADS excretiestaal, enkel gedetecteerd werden in SIM mode en dit in zeer kleine hoeveelheden. Alle muisurinestalen werden in SCAN geanalyseerd. Bij pogingen om de urines ook met de SIM methode te analyseren bij de muis, werden slechts bij 1 chimere muis sporen van de α en β diol metabolieten teruggevonden. De andere metabolieten gedetecteerd door Parr et al. [21] werden niet in de chimere muizen gedetecteerd alsook niet in het humaan WAADS excretiestaal.
Ook hier werd geprobeerd om een tentatieve structuur op te stellen voor de gedetecteerde metabolieten aan de hand van de massaspectrometrische data (Tabel 6).
3.2.4. Fractie analyse
Uit de studies van de verschillende fracties is gebleken dat methyl-1-testosteron, metabolieten hydroxy Z, diOH Y en diOH Z zowel in de vrije vorm als geglucuronideerd worden uitgescheiden. Metabolieten hydroxy W, X en Y daarentegen worden voornamelijk vrij uitgescheiden.
In de literatuur is geen informatie terug te vinden over hoe de verschillende humane metabolieten worden uitgescheiden. Na analyse van het humaan WAADS excretiestaal bleek dat methyl-1-testosteron zelf voornamelijk vrij en in mindere mate geglucuronideerd wordt uitgescheiden.
46