Steroïd metabolisme in de chimere muis
Annelies DE SPAEY
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Van Eenoo Peter Vakgroep Klinische biologie, microbiologie en immunologie
Academiejaar 2010-2011
Deze pagina is niet beschikbaar omdat ze persoonsgegevens bevat.
Universiteitsbibliotheek Gent, 2021.
This page is not available because it contains personal information.
Ghent University, Library, 2021.
Voorwoord
Het maken van deze thesis was een heel leerrijke en uitdagende ervaring die ik zonder de hulp van enkele mensen niet had kunnen waarmaken.
Als eerste wil ik graag mijn promotor Prof. Dr. Peter Van Eenoo bedanken om mij de kans te geven mijn onderzoek uit te voeren in het DoCoLab en mij altijd bij te staan met raad.
In het bijzonder wil ik graag mijn begeleidster Dr. Leen Lootens bedanken die mij gedurende mijn hele stageperiode uitstekend heeft begeleid en mij altijd wist te motiveren. Zonder haar begeleiding, enthousiasme en adviezen was deze thesis nooit tot stand gekomen.
Verder wil ik ook graag alle medewerkers van het DoCoLab bedanken om altijd paraat te staan als ik hulp nodig had en voor de leuke momenten tijdens de koffie- en middagpauzes.
Mijn medethesisstudenten Diedelinde, Lore en Danica wil ik ook graag bedanken voor de ontspannende en leuke momenten in het labo.
Ik wil ook graag mijn mama bedanken die mij gedurende mijn hele opleiding altijd gesteund heeft. Zonder haar goede zorgen en financiële steun had ik deze thesis nooit kunnen waarmaken.
Ook mijn vriend wil ik graag bedanken om altijd te luisteren naar mijn frustraties en om mij altijd te motiveren en te steunen.
Verder wil ik ook mijn zus, broer en al mijn vrienden bedanken voor hun interesse in mijn thesis en hun steun gedurende de hele periode. Zij zorgden voor de ideale ontspanning tussen het maken van deze thesis door.
Stage gegevens
Stageperiode Oktober 2010 tot mei 2011
Stageplaats Universiteit Gent (UGent) – Faculteit Geneeskunde &
Gezondheidswetenschappen
Dopingcontrolelaboratorium (DoCoLab) Technologiepark 30B, 9052 Zwijnaarde Tel: 09 331 32 90 Fax: 09 331 32 99
Promotor: Prof. Dr. ir. Peter Van Eenoo Begeleider: Dr. Leen Lootens
Lijst met afkortingen
AAS Anabole androgene steroïden
C Koolstofatoom
CEVAC Centrum voor Vaccinologie
Da Dalton
diOH Dihydroxylgroep
DoCoLab Dopingcontrolelaboratorium
GC-MS Gaschromatografie-massaspectrometrie
IC Binnen competitie (in competition)
IS Inwendige standaard
LC-MS Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie
M1T Methyl-1-testosteron
min Minuten
MW Moleculair gewicht
m/z Massa/ladingverhouding
OH Hydroxylgroep
OOC Buiten competitie (out of competition)
PBS Phosphate buffered saline
QC Kwaliteitscontrole
rpm Toeren/minuut
RT Retentietijd
SCID Severe combined immune deficiency
SIM Selective Ion Monitoring
TMS Trimethylsilyl
uPA Urokinase type plasminogeen activator
WAADS World Association of Anti-Doping Scientists
WADA World Anti Doping Agency
Inhoudstafel
Samenvatting ... 1
1. Inleiding ... 2
1.1. Doping en sport ... 2
1.2. Anabole androgene steroïden ... 3
1.3. Steroïdmetabolisme ... 5
1.3.1. Fase 1 reacties ... 5
1.3.2. Fase 2 reacties ... 6
1.4. In vitro en in vivo modellen ... 7
1.5. Het muismodel ... 7
1.6. Detectie van steroïden... 9
1.7. Doel ... 10
1.8. Mibolerone ... 10
1.9. Methyl-1-testosteron ... 11
2. Materiaal en Methoden ... 12
2.1. Reagentia ... 12
2.2. Studieprotocol ... 12
2.3. Muizen ... 13
2.4. Extractieprocedure ... 13
2.5. Analyse met GC-MS ... 14
2.6. Fractie analyse ... 15
2.7. Referentieoplossing, QC-stalen en PBS-oplossing ... 16
3. Resultaten & bespreking ... 17
3.1. Mibolerone ... 17
3.1.1. Metabolisatie van mibolerone in de literatuur ... 17
3.1.2. Metabolisatie van mibolerone in het muismodel ... 19
3.1.3. Drievoudige urineanalyse ... 28
3.1.4. Fractie analyse ... 31
3.2. Methyl-1-testosteron ... 32
3.2.1. Metabolisatie van methyl-1-testosteron in de literatuur ... 32
3.2.2. Metabolisatie van methyl-1-testosteron in het muismodel... 34
3.2.3. Drievoudige urineanalyse ... 42
3.2.4. Fractie analyse ... 45
4. Algemeen besluit ... 46
5. Referentielijst ... 48
1
Samenvatting
Anabole androgene steroïden zijn wereldwijd de meest misbruikte prestatieverhogende drugs.
Om hun detectie in de routine dopingcontrole te verbeteren, is het noodzakelijk humane excretiestudies uit te voeren die bepalen tot welke componenten deze steroïden gemetaboliseerd worden in de lever en vervolgens geëxcreteerd worden in de urine. Wegens de vele neveneffecten van deze steroïden is het echter ethisch niet verantwoord deze excretiestudies uit te voeren op de mens. Het uPA+/+-SCID chimere muismodel is een goed alternatief voor deze humane excretiestudies. Deze muizen beschikken over een humane lever door de regeneratie met humane hepatocyten na inductie van een leverdeficiëntie. Bovendien zijn deze muizen immunodeficiënt waardoor de getransplanteerde humane hepatocyten niet afgestoten worden. In deze thesis zal het metabolisme van mibolerone en methyl-1-testosteron onderzocht worden met behulp van dit muismodel. Deze 17α-gemethyleerde steroïdcomponenten zijn allebei levertoxisch waardoor weinig humane excretiestudies zijn terug te vinden in de literatuur. Aan de hand van een vergelijking van de pre-administratie en post-administratie urines van zowel chimere als niet-chimere (controle) muizen, wordt getracht een profiel op te stellen van de gedetecteerde metabolieten. De toegediende componenten (mibolerone en methyl-1-testosteron) worden geëxtraheerd uit de muisurine met diethylether na enzymatische hydrolyse gevolgd door trimethylsilyl (TMS) derivatisatie.
Nadien vindt analyse plaats op GC-MS. Voor mibolerone werden 11 mogelijke metabolieten gedetecteerd. Naast mibolerone zelf werden een epimeer, een onbekende component, 3 gehydroxyleerde componenten (hydroxy A, B en C) en 5 dubbel gehydroxyleerde componenten (diOH A1, A2, A3, A4 en B) gedetecteerd. Voor sommige van deze metabolieten werd een tentatieve structuur opgesteld. Voor methyl-1-testosteron werden 7 mogelijke metabolieten gedetecteerd. Naast methyl-1-testosteron zelf werden 4 gehydroxyleerde componenten (hydroxy W, X, Y en Z) en 2 dubbel gehydroxyleerde (diOH Y en Z) componenten gedetecteerd. Hieruit kan geconcludeerd worden dat mibolerone en methyl-1-testosteron sterk gemetaboliseerd worden. Gezien de beperkte beschikbaarheid van humane data, werden de resultaten vergeleken ten opzichte van de niet-chimere controle muis.
Daarbij werd het volgende opgemerkt: voor mibolerone werden 5 en voor methyl-1- testosteron werden geen specifieke metabolieten exclusief in de chimere muis teruggevonden.
Om de data bekomen met het chimeer muismodel te ondersteunen en meer structuur indicaties van de metabolieten te verkrijgen, is het noodzakelijk om bij verdere experimenten ook in vitro modellen te gebruiken zoals bijvoorbeeld humane levercelfracties.
2
1. Inleiding
1.1. Doping en sport
Doping is een heel ruim begrip en impliceert o.a. het gebruik van stimulerende agentia om de sportprestaties te bevorderen. Het gebruik van doping is verboden omdat het fundamenteel in strijd is met de geest van de sport die gebaseerd is op fairplay. Ook kan het gebruik van doping ernstige gevolgen hebben voor de gezondheid van de atleet.
In 1999 werd het World Anti-Doping Agency (WADA) opgericht. Het WADA is een internationale, onafhankelijke organisatie die strijdt voor een sportwereld zonder doping. De missie van het WADA is het gevecht tegen doping in elke sporttak te promoten, te coördineren en op te volgen [1].
Jaarlijks stelt het WADA de “prohibited list” voor [2]. Deze lijst is een onderdeel van de wereld anti-doping code en geeft een overzicht van alle verboden stoffen en methoden in de sportwereld. Stoffen en methoden op de lijst voldoen aan minstens 2 van de 3 volgende criteria;
Ze zijn:
Prestatiebevorderend
Schadelijk voor de gezondheid
In strijd met de geest van de sport
Er wordt een onderscheid gemaakt tussen substanties die zowel binnen (IC) als buiten (OOC) competitie verboden zijn en substanties die enkel binnen competitie verboden zijn. De substanties die steeds verboden zijn (IC en OOC), worden onderverdeeld in 6 grote groepen:
0. Niet-goedgekeurde substanties: geneesmiddelen in (pre)klinische fase 1. Anabolica: methyltestosteron, mibolerone, nandrolone…
2. Peptidehormonen, groeifactoren en gerelateerde substanties: erythropoëse stimulerende agentia zoals EPO of CERA, insuline, corticotrofines…
3. β2-agonisten
4. Hormoon antagonisten en modulatoren: aromatase inhibitoren, selectieve estrogeen receptor modulatoren…
5. Diuretica en andere maskerende agentia: thiaziden, acetazolamide, intraveneuze administratie van albumine, dextraan, mannitol…
3
A B
C D
1 2
3
8
7 6 5 4
9 10
11 12
13
14 15
16 18
19
17
De substanties die enkel binnen competitie verboden zijn, omvatten de narcotica (morfine), stimulantia (efedrine), cannabinoïden (THC) en glucocorticosteroïden. Verder zijn alcohol en β-blokkers in sommige sporten verboden.
De verboden methoden omvatten het verhogen van de zuurstof transfer, chemische en analytische manipulatie en genetische doping [2].
Het dopingcontrolelaboratorium (DoCoLab) is één van de 34 wereldwijde laboratoria die geaccrediteerd zijn door het WADA. DoCoLab is verantwoordelijk voor de analyse van urine- en bloedstalen van atleten op verboden substanties. Daarnaast ontwikkelt DoCoLab ook nieuwe detectiemethoden voor het opsporen van verboden substanties en doet het onderzoek naar nieuwe substanties zoals voedingssupplementen, designersteroïden…[3].
DoCoLab is verbonden aan de faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen van de Universiteit Gent. Het muismodel (zie 1.5. Het muismodel) werd ontwikkeld in het Centrum voor Vaccinologie (CEVAC) dat eveneens verbonden is aan de faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen van de Universiteit Gent.
1.2. Anabole androgene steroïden
Anabole androgene steroïden (AAS), ook wel anabole steroïden genoemd, zijn wereldwijd de meest misbruikte prestatieverhogende drugs. Het zijn synthetische analogen van het endogene hormoon testosteron. De AAS hebben zowel anabole als androgene eigenschappen. De anabole eigenschappen veroorzaken een toename in spiervolume en –kracht terwijl de androgene eigenschappen virilisatie en agressie verhogen.
De basisstructuur van de steroïden is een ringsysteem dat bestaat uit vier ringen: de A-, B-, C- en D-ring. De koolstofatomen (C-atomen) van het ringsysteem krijgen ook een specifieke nummering die gebruikt wordt bij de benaming van de verschillende AAS (Figuur 1).
Figuur 1: Algemene structuurvoorstelling van de anabole androgene steroïden met de A-, B-, C- en D-ring en de nummering van de koolstofatomen (C1 C19).
4 De AAS kunnen onderverdeeld worden in 2 groepen namelijk de endogene en exogene steroïden. Endogene steroïden zoals testosteron, androstenedion… zijn hormonen die in het menselijke lichaam gevormd worden. Exogene steroïden komen van nature niet in het lichaam voor. Deze synthetische analogen van testosteron ontstaan door chemische modificaties aan te brengen aan de testosteronstructuur [4]. Aangezien atleten steroïden zullen innemen omwille van de anabole eigenschappen, wordt geprobeerd de ongewenste androgene eigenschappen te elimineren.
Het gebruik van doping is wegens de vele neveneffecten van de AAS schadelijk voor de atleet. De ernst van de neveneffecten is afhankelijk van het geslacht, het type steroïd of combinatie van steroïden, de grootte van de dosis en de periode van de toediening. Bij chronisch gebruik van AAS zijn de neveneffecten het grootst en kan een permanente schade van de gezondheid ontstaan. Tabel 1 geeft een overzicht van de organen of systemen die worden aangetast bij chronisch gebruik van AAS [5].
Tabel 1: Overzicht van de organen en systemen die worden aangetast bij chronisch gebruik van AAS.
Lever Bij langdurig gebruik van grote dosissen AAS wordt vaak leverschade waargenomen. Chronisch gebruik van vooral C17α-gealkyleerde steroïden leidt tot leverdysfuntie.
Psychologische effecten
Het gebruik van natuurlijke androgenen en hun synthetische analogen verhoogt de agressiviteit. Gewelddadig gedrag en psychosen worden ook vaak waargenomen.
Cardiovasculair systeem
AAS administratie verhoogt de concentratie aan low-density lipoproteïnen en verlaagt de concentratie high-density lipoproteïnen en apolipoproteïnen.
Hierdoor ontstaat een verhoogde kans op atherose en dus op coronaire hartziekten.
Prostaat Bij inname van grote dosissen AAS ontstaat de kans op ontwikkeling van een vergroting van het prostaat volume en BPH (=benigne prostaat hyperplasie).
Virilisatie Dit komt voor bij vrouwen en wordt gekenmerkt door o.a. een verdieping van de stem, clitorale hypertrofie en andere gynaecologische afwijkingen.
Amenorrhoea (uitblijven van de menstruatie), een verhoogd libido, een mannelijk patroon van beharing op gezicht en lichaam en kaalheid worden ook vaak waargenomen.
Andere Steroïd acne, gynaecomastie, infertiliteit, testiculaire atrofie, verstoring van de menstruele cyclus, secundaire amenorrhoea en impotentie.
5 Naast de gekende AAS bestaan er tegenwoordig ook designersteroïden. Deze steroïden worden speciaal ontwikkeld om dopingcontroles of de wetgeving die de verkoop van AAS verbiedt te omzeilen. Het nadeel van deze producten is dat ze niet geregistreerd zijn als farmaceutisch product of als voedingssupplement. De farmacodynamische, farmacokinetische en toxische eigenschappen van deze producten werden dus niet bepaald. Enkele voorbeelden van designersteroïden zijn madol, tetrahydrogestrinone en norbolethon [6].
1.3. Steroïdmetabolisme
Net zoals geneesmiddelen worden ook de meeste AAS afgebroken in het menselijk lichaam.
Deze metabole processen vinden voornamelijk plaats in de lever en kunnen onderverdeeld worden in 2 groepen: fase 1 en fase 2 reacties. Tijdens deze reacties ondergaan de A-, B-, C- of D-ring een aantal metabole veranderingen (Figuur 1). In de fase 1 reacties ondergaat het AAS een aantal enzymatisch gekatalyseerde reacties zoals oxidatie, reductie of hydroxylatie waardoor het AAS meer polair wordt en de renale excretie wordt bevorderd. In de fase 2 reacties of conjugatiereacties wordt het AAS of zijn metaboliet door een enzymatisch proces gekoppeld aan glucuronzuur of sulfaat. Deze conjugatiereacties bevorderen eveneens de eliminatie uit het lichaam [7].
1.3.1. Fase 1 reacties
Zoals reeds eerder vermeld, wordt de steroïd molecule door de fase 1 reacties (reductie, oxidatie, hydroxylatie) omgezet tot een meer polaire component. De fase 1 reacties kunnen doorgaan op de A-, B-, C- en D-ring. Een overzicht van de fase 1 reacties op de verschillende ringen van de steroïd structuur wordt gegeven in Tabel 2.
Tabel 2: Overzicht van de fase 1 reacties bij steroïdcomponenten.
A-ring B-ring C-ring D-ring
5α- en 5β- reductie 3α- en 3β-hydroxy- reductie
1,2-hydrogenatie 1,2-dehydrogenatie
6β-hydroxylatie 6,7-dehydrogenatie
12-hydroxylatie 17-oxidatie van de 17β- hydroxy groep
17β-hydroxylatie van 17-keto steroïden
16α- en 16β-hydroxylatie 16-oxidatie
17-epimerisatie 18-(19-) hydroxylatie
6 Bij metabolisatie van de A-ring is de reductie van de C-4,5 dubbele binding de initiële en snelheidsbepalende stap in het metabolisme van 3-keto-4-ene steroïden. Door deze reductie ontstaan 2 isomeren met een 5α- of 5β- configuratie. De enzymen die deze reactie katalyseren namelijk 5α-reductase en 5β-reductase bevinden zich voornamelijk in de lever. Als gevolg van deze irreversibele reductie wordt de 3-keto groep snel gereduceerd door het 3α- hydroxysteroïd dehydrogenase of 3β-hydroxysteroïd dehydrogenase. Enkele andere reacties die kunnen doorgaan op de A-ring zijn 1,2-hydrogenatie van 3-keto-androst-1,4-diene steroïden, 1,2-dehydrogenatie van 3-keto-4-ene steroïden en andere reacties op speciale A- ring gemodificeerde steroïden zoals oxymetholone, formebolone, metenolone en stanozolol.
Bij de metabolisatie van de B-ring is 6β-hydroxylatie de meest voorkomende metabole pathway. Deze pathway komt echter vooral voor bij 17β-hydroxyl-17α-methyl steroïden. 6,7- dehydrogenatie komt voornamelijk bij de metabolisatie van methandienone voor.
12-hydroxylatie is de enige gekende metabole pathway bij metabolisatie van de C-ring.
Bij de metabolisatie van de D-ring is 17-oxidatie van de 17β-hydroxy groep door 17β- hydroxysteroïd dehydrogenase de meest gekende metabole pathway. Door deze reactie worden 17-keto steroïden gevormd, de belangrijkste metabolieten van testosteron en AAS met een 17β-hydroxy groep. De 17-keto groep kan vervolgens terug omgezet worden naar een 17- hydroxy groep door hetzelfde enzym. De mate waarin dit gebeurt hangt af van de snelheid waarmee de opeenvolgende metabole stappen plaatsvinden. 16α- en 16β-hydroxylatie wordt beschreven bij een aantal AAS. 16-keto steroïden ontstaan dan weer door enzymatische oxidatie van de corresponderende 16α- en 16β-hydroxysteroïden. Enkele andere metabole pathways die worden beschreven bij metabolisatie van de D-ring zijn 17-epimerisatie en 18- (19-)hydroxylatie [7].
1.3.2. Fase 2 reacties
Tijdens fase 2 reacties of conjugatiereacties wordt glucuronzuur of sulfaat enzymatisch gekoppeld aan het AAS of aan een metaboliet van het AAS. Deze binding bevordert de excretie uit het lichaam. Bij de meeste steroïden is fase 1 metabolisatie reeds voldoende voor eliminatie. Deze steroïden worden niet geconjugeerd en worden dan ook niet-geconjugeerde of vrije steroïden genoemd. AAS die wel fase 2 metabolisatie ondergaan worden geconjugeerde steroïden genoemd [6,7]. De conjugatiereacties vinden voornamelijk plaats op de A- of D-ring. Op de A-ring is er voornamelijk glucuronidatie van de 3α-hydroxyl groep en sulfatatie van de 3β-hydroxyl groep. Op de D-ring vinden glucuronidatie en/of sulfatatie van de secundaire en tertiaire 17β-hydroxyl groep plaats [7].
7 Door de metabole veranderingen die het AAS ondergaat, wordt er weinig van de oorspronkelijke steroïdmolecule teruggevonden in de urine. Om de detectie van steroïden in urine bij dopingcontroles mogelijk te maken en om ook designersteroïden te kunnen opsporen, zijn dus excretiestudies nodig om de gevormde metabolieten te kunnen bepalen.
Door de vele neveneffecten van AAS en door het bestaan van designersteroïden is het ethisch niet verantwoord om deze excretiestudies op mensen uit te voeren. Het is bijgevolg noodzakelijk om geschikte alternatieven te ontwikkelen zoals in vitro en in vivo modellen waarbij de gevormde metabolieten zo goed mogelijk de humane metabolieten benaderen.
1.4. In vitro en in vivo modellen
In vitro modellen geven via een minder complexe benadering een goede indicatie van wat er in vivo verwacht mag worden. Andere mogelijke voordelen zijn een grote beschikbaarheid van het model en een lage kost. In vitro culturen hebben echter ook een aantal nadelen zoals een beperkte levensduur en de nood aan een specifieke cultuuromgeving waardoor hun gebruik enigszins beperkt is. Het meest populaire in vitro model zijn humane levermicrosomen. Deze hebben een grote beschikbaarheid, zijn goedkoop en het best gekarakteriseerd. Humane lever cytosol fracties zijn nuttig voor het bestuderen van fase 2 biotransformatie maar worden minder gebruikt. Humane hepatocyten zijn ook een populair modelsysteem omwille van hun betere overeenkomst met de in vivo situatie. Een nadeel van dit model is het gradueel verlies van leverspecifieke functies. Ondanks de talrijke in vitro modellen blijft het moeilijk om een methode te ontwikkelen die de in vivo situatie volledig benadert [8]. In vivo modellen zoals proefdieren bieden een andere mogelijkheid. Data bekomen van deze proefdieren mogen echter niet zomaar geëxtrapoleerd worden naar de mens en dezelfde ethische vragen rijzen bij het gebruik van o.a. primaten. Er is dus nood aan een in vivo model dat de humane situatie zo goed mogelijk benadert.
1.5. Het muismodel
De uPA+/+-SCID muis met gehumaniseerde lever (chimere muis) is in theorie een goed alternatief voor in vitro modellen en proefdieren. Dit muismodel werd oorspronkelijk ontwikkeld voor het bestuderen van virale hepatitis. De muizen zijn drager van het muis urokinase-type plasminogeen activator (uPA) gen dat onder controle staat van de muis albumine enhancer/promotor. Lever-specifieke overexpressie van het uPA gen leidt tot een ernstige levertoxiciteit waardoor chronische leverinsufficiëntie ontstaat. Door deze
8 leverinsufficiëntie is het mogelijk de muizenlever te regenereren met humane hepatocyten [9].
Enkel muizen die homozygoot (+/+) zijn voor het uPA transgen zijn goede ontvangers voor de transplantatie. Bij heterozygote muizen treedt er immers kort na de geboorte somatische deletie op van het transgen in een klein deel van de afgestorven hepatocyten. Deze hepatocyten hebben een normaal fenotype en hebben een groeivoordeel op de transgen geëxpresseerde cellen. Er treedt dus competitie op tussen de humane hepatocyten en de muis hepatocyten.
Aangezien de muizen immunodeficiënt (SCID) zijn, worden de getransplanteerde humane cellen niet afgestoten. Transplantatie van primaire humane hepatocyten in een homozygote uPA-SCID muis leidt tot een uitgesproken en stabiele engraftment waarbij de afgestorven muis hepatocyten bijna volledig vervangen zijn door de humane hepatocyten.
Twee weken na de geboorte van de muizen worden de humane hepatocyten van hoge kwaliteit in de milt van de muis geïnjecteerd. Via de bloedcirculatie bereiken ze de lever waar ze zich diffuus zullen verspreiden in de hepatische sinusoïden. De humane hepatocyten die zich nu in de lever van de muis bevinden, zijn functioneel en secreteren een aantal hepatische proteïnen zoals albumine, α1-antitripsine… De normale farmacologische respons blijft behouden waardoor het humane metabolisme bestudeerd kan worden [9]. Enkele weken na de transplantatie wordt de concentratie van humaan albumine bepaald in het plasma van de muis.
Aan de hand van deze concentratie kan bepaald worden in welke mate de lever geregenereerd is met humane hepatocyten.
Hoewel het chimere muismodel enkele beperkingen heeft zoals de kleine hoeveelheid urine die geproduceerd wordt, de beperkte dosis steroïd die kan worden toegediend en de kost van het model zijn de voordelen die het model biedt veel groter [10].
Verschillende excretiestudies hebben reeds aangetoond dat het muismodel het humane metabolisme benadert. Zo werd enerzijds de werking van de CYP enzymen nagegaan [11] en anderzijds werd het metabolisme bestudeerd van een aantal steroïden die op de verboden lijst van het WADA staan [10,12,13].
9
1.6. Detectie van steroïden
Gaschromatografie in combinatie met massaspectrometrie (GC-MS) is een frequent gebruikte methode bij de detectie van doping en verboden substanties in de urine van de atleet. De methode heeft een hoge sensitiviteit, selectiviteit en kan voor verschillende doeleinden gebruikt worden [14]. Een nadeel van GC-MS is de duur van de derivatisatiestap die noodzakelijk is bij de staalvoorbereiding. Door de derivatisatie worden de AAS immers vluchtiger, thermo-stabieler en verbeteren hun chromatografische eigenschappen. AAS worden opgespoord op basis van hun specifiek massaspectrum en specifieke retentietijd. Om een eenduidige confirmatie te krijgen worden de data van de AAS vergeleken met een referentiestandaard [15].
De GC-MS bestaat uit 2 belangrijke onderdelen: de gaschromatograaf en de massaspectrometer [16].
Wanneer een staal wordt geanalyseerd, komt de inhoud van het staal eerst terecht in de liner.
In deze liner wordt het staal verdampt zodat het in de gasfase of mobiele fase komt.
Vervolgens stroomt het gas door naar de capillaire kolom waar de componenten gescheiden worden op basis van een interactie tussen de stationaire en mobiele fase. Door deze interactie komen alle componenten op een verschillend tijdstip (retentietijd) uit de kolom. Bij GC-MS wordt gebruik gemaakt van een temperatuursgradiënt om de scheiding van de verschillende componenten te optimaliseren. Vervolgens bereiken ze de massaspectrometer waar ze gebombardeerd worden door vrije elektronen die geëmitteerd zijn door een filament. Hierdoor ontstaan geïoniseerde fragmenten. Deze methode wordt elektron ionisatie (EI) genoemd en is een harde ionisatie techniek. De moleculen gaan door een quadrupool en bereiken vervolgens de detector.
Analyse met GC-MS kan op 2 manieren gebeuren namelijk in full scan of in selective ion monitoring (SIM). Bij full scan wordt een brede range aan massafragmenten gedetecteerd. De techniek wordt voornamelijk gebruikt voor kwalitatieve analyse maar is minder gevoelig. Bij SIM worden slechts een beperkt aantal ionen geanalyseerd die karakteristiek zijn voor de te analyseren component. Deze methode is gevoeliger dan full scan en kan gebruikt worden voor zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyse. Voor het bepalen van ongekende componenten wordt vooral full scan gebruikt [16] .
10 Naast GC-MS wordt ook vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) vaak gebruikt in de routine analyse van urinestalen. Een groot voordeel van LC-MS is dat er geen derivatisatiestap nodig is. Bovendien kunnen niet alle verboden middelen zoals sommige diuretica gedetecteerd worden met GC-MS. Bij LC-MS wordt de mobiele fase (het te onderzoeken staal) over een stationaire fase getransporteerd. Aan de hand van verschillende interacties met deze stationaire fase worden de componenten gescheiden. Deze scheiding kan gebeuren door verschillende polaire-apolaire interacties of door het variëren van de pH waardoor de verschillende componenten op verschillende tijdstippen de kolom zullen verlaten en vervolgens gedetecteerd zullen worden [17].
1.7. Doel
Het doel van deze thesis is de metabolisatie van mibolerone en methyl-1-testosteron te onderzoeken met behulp van het chimere muismodel. Beide steroïdcomponenten zullen worden toegediend aan zowel chimere als niet-chimere muizen waarna de urine van de muizen onderzocht zal worden met behulp van GC-MS. Er zal getracht worden een profiel van de metabolieten van beide componenten op te stellen die de detectie van beide componenten in het routine onderzoek zullen bevorderen.
Zowel mibolerone als methyl-1-testosteron zijn 17α-gemethyleerde componenten. Door deze 17α-methylatie wordt de afbraak van de component in de lever verhinderd (first-pass-effect) waardoor de component langer aanwezig blijft in het lichaam. Op die manier wordt de orale beschikbaarheid van de component groter [5,7,18]. Door de 17α-methylatie vergroot echter de levertoxiciteit van de component [18].
1.8. Mibolerone
Mibolerone (Figuur 2) werd ontwikkeld als geneesmiddel voor veterinair gebruik om de estrus bij vrouwelijke honden en katten te voorkomen. Mibolerone is een 17α-gemethyleerd derivaat van testosteron waarbij de methylgroep op C19 verplaatst is naar C7. Mibolerone (17β-hydroxy-7α,17α-dimethylestr-4-ene-3-one) heeft een moleculair gewicht van 302,45 Da.
Het bevindt zich op de prohibited list van het WADA onder de categorie van de exogene anabole androgene steroïden. Hoewel het veterinair geneesmiddel niet goedgekeurd is voor gebruik bij mensen, wordt mibolerone toch misbruikt door atleten als spieropbouwend middel en om hun agressie net voor een wedstrijd op te drijven. Aangezien mibolerone heel toxisch is
11 voor de lever zijn er slechts een beperkt aantal humane metabole studies rond te vinden.
Bovendien is het geneesmiddel niet meer te verkrijgen op de markt [19, 20].
Figuur 2: Structuurvoorstelling van 17β-hydroxy-7α,17α-dimethylestr-4-ene-3-one (mibolerone).
1.9. Methyl-1-testosteron
Methyl-1-testosteron (17β-hydroxy-17α-methyl-5α-androst-1-ene-3-one) heeft zoals mibolerone een moleculair gewicht van 302,45 Da (Figuur 3). Het bevindt zich sinds 2006 op de prohibited list van het WADA onder de categorie van de exogene anabole androgene steroïden. Methyl-1-testosteron heeft krachtige anabole eigenschappen en is zeer levertoxisch [21].
Figuur 3: Structuurvoorstelling van 17β-hydroxy-17α-methyl-5α-androst-1-ene-3-one (methyl-1-testosteron).
O CH3
CH3 OH CH3
O
CH3 OH CH3 CH3
12
2. Materiaal en Methoden
2.1. Reagentia
Mibolerone was een gift van Upjohn (Michigan, VS). Methyl-1-testosteron werd aangekocht bij het NMI (Pymble, Australië). De inwendige standaard (IS) 17α-methyltestosteron is afkomstig van Organon (Oss, Nederland).
Phosphate buffered saline (PBS) is afkomstig van Invitrogen (Merelbeke, België). Ethanol (96%) is afkomstig van Biosolve (Valkenswaard, Nederland). Methanol, diethylether en NaHCO3 werden aangekocht bij Fisher Scientific (Loughborough, Verenigd Koninkrijk).
Na2SO4, K2CO3 en NH4I zijn afkomstig van Merck (Darmstadt, Duitsland). β-glucuronidase van Escherichia coli K12 (E. coli) werd aangekocht bij Roche (Mannheim, Duitsland) en β- glucuronidase van Helix pomatia (H. pomatia) werd aangekocht bij Sigma (St-Louis, Verenigd Koninkrijk). N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide (MSTFA) is afkomstig van Karl Bucher (Waldstetten, Duitsland). Ethaanthiol (97%) is van Acros (Geel, België).
2.2. Studieprotocol
Het project werd goedgekeurd door de Ethische Commissie Dierproeven van de Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen van de Universiteit Gent (ECD 06/09). Voor de metabole studie wordt gebruik gemaakt van zowel chimere als niet-chimere muizen.
Mibolerone (50 mg/ml) wordt opgelost in een 70% PBS, 20% ethanol, 10% methanol oplossing en methyl-1-testosteron (10 mg/ml) wordt opgelost in een 90% PBS en 10%
ethanol oplossing. Deze dosissen werden in een pre-studie bepaald waarbij verschillende concentraties van de steroïdcomponent werden toegediend aan de muizen. Vooreerst worden de muizen gedurende 24 uur in de metabole kooien (Tecniplast, Someren, Nederland) geplaatst om een blanco urine te verkrijgen. Deze metabole kooien zijn speciaal ontwikkeld voor kleine dieren en maken het mogelijk urine en faeces afzonderlijk op te vangen.
Vervolgens wordt 150 μl van de mibolerone oplossing of 200 μl van de methyl-1-testosteron oplossing via orale gavatie toegediend aan de muizen waarna ze opnieuw in de metabole kooien worden geplaatst. Aangezien de muizen slechts een beperkte hoeveelheid urine produceren ( 1,5 ml/24 uur) wordt de urine telkens na 24 uur gecollecteerd waarna deze bewaard wordt in de diepvriezer bij -20°C tot het moment van analyse. Door de geringe
13
Urine Enzymatische hydrolyse
Vloeistof-
vloeistofextractie Derivatisatie GC-MS
urineproductie is het niet mogelijk een excretieprofiel op te stellen waarbij urinecollectie plaatsvindt na 1, 2, 4, 6… uur.
2.3. Muizen
Voor de metabole studie van mibolerone werden 8 chimere en 3 niet-chimere muizen gebruikt terwijl voor de metabole studie van methyl-1-testosteron 4 chimere en 3 niet-chimere muizen werden gebruikt. De transplantatie methodologie van de muizen werd ontwikkeld door Professor Meuleman van het CEVAC [9]. In de metabole kooien hebben de muizen ad libitum toegang tot water en voedsel in poedervorm. De hoeveelheid aan humane hepatocyten in de muis werd bepaald door het gehalte aan humaan albumine te bepalen in het plasma van de muis.
2.4. Extractieprocedure
De extractieprocedure van de urinestalen wordt voorgesteld in onderstaande flowchart (Figuur 4). Deze extractieprocedure is nodig om de steroïdcomponenten te isoleren uit de urine. De hieronder beschreven procedure is gebaseerd op de routine procedure die gebruikt wordt in DoCoLab bij de analyse van urinestalen.
Figuur 4: Schematische voorstelling van de extractieprocedure van anabole steroïden uit muisurine.
Nadat de urine ontdooid is, wordt 100 μl van de muisurine overgebracht in een kleine, gelabelde sovirelbuis (Pyrex, Staffordshire, Verenigd Koninkrijk). Vervolgens wordt 50 μl van de inwendige standaard, 17α-methyltestosteron, toegevoegd. Deze structuurgerelateerde steroïdcomponent wordt toegevoegd als controle. Op die manier kan gecorrigeerd worden voor fouten ontstaan tijdens de staalvoorbereiding of fouten ontstaan door variaties in efficiëntie van de steroïd derivatisatie. Voor de enzymatische hydrolyse wordt 50 μl β-
14 glucuronidase (E. coli) toegevoegd met 1 ml fosfaatbuffer pH 7. De stalen worden gevortexd en vervolgens gedurende 2,5 uur in de oven geplaatst bij 56 5°C. Wanneer de stalen afgekoeld zijn tot kamertemperatuur wordt voor de vloeistof-vloeistof extractie 1 g vaste buffer NaHCO3/K2CO3 en 5 ml diethylether toegevoegd aan het staal. De stalen worden gedurende 20 minuten gerold waarna ze gedurende 5 minuten gecentrifugeerd worden aan 2000-2500 toeren/minuut (rpm). De organische fase wordt vervolgens afgenomen en in een kleine sovirelbuis overgebracht waar 1 g Na2SO4 aan wordt toegevoegd. Vervolgens wordt de organische fase opnieuw overgebracht in een kleine sovirelbuis waarna ze ingedampt wordt met stikstof bij 40 5°C tot droog. De residuen worden vervolgens nog 10 minuten extra in de oven geplaatst bij 80 5°C. Vervolgens wordt 100 μl MSTFA/NH4I/ethaanthiol (trimethylsilyl (TMS)-derivatiseringsoplossing) toegevoegd waarna de stalen gedurende 1 uur in de oven geplaatst worden bij 80 5°C. Door de derivatisatie worden de hydroxyl- en ketogroepen van de componenten gesilyeerd tot respectievelijk TMS ether en TMS enolderivaten. Hierdoor verandert het moleculair gewicht van de component. Het moleculair gewicht van zowel mibolerone als methyl-1-testosteron wordt m/z 446 na derivatisatie met de TMS-derivatiseringsoplossing.
2.5. Analyse met GC-MS
Voor analyse met GC-MS wordt 50 μl van elk staal overgebracht in een autosampler vial en afgesloten met een aluminium cap. Analyse met GC-MS gebeurde in full scan op een Agilent 6890 gaschromatograaf die gekoppeld is aan een 5973 massa selectieve detector (Palo Alto, VS). De GC-kolom was een HP-Ultra 1 (J&W, Folsom, CA, VS), 100% methyl silicone kolom met een lengte van 17 meter, een interne diameter van 0,2 mm en een filmdikte van 0,11 μm. Het oventemperatuur programma van mibolerone was als volgt: initiële temperatuur bedraagt 120°C, 60°C/minuut (min) 183°C, 3°C/min 232°C, 40°C/min 310°C. De totale analysetijd bedraagt 22,33 min. Voor methyl-1-testosteron werd volgend temperatuurprogramma gebruikt: de initiële temperatuur bedraagt 120°C, 70°C/min 180°C, 4°C/min 234°C, 30°C/min 300°C. De totale analysetijd bedraagt 18,76 min. Het draaggas was helium aan een constante flowsnelheid van 0,5 ml/min. De elektron energie was vastgesteld op 70 eV en de ionenbron temperatuur was 250 °C. Het injectie volume was 0,5 μl, splitless.
15
2.6. Fractie analyse
Zoals reeds besproken worden de componenten voornamelijk in de lever gemetaboliseerd door fase 1 en fase 2 reacties om de excretie uit het lichaam te bevorderen. Wanneer een component een fase 1 reactie ondergaat, wordt de component gedetecteerd in zijn vrije vorm.
Wanneer de component echter een fase 2 reactie ondergaat, wordt deze geglucuronideerd of gesulfateerd uitgescheiden in de urine. Op de urinestalen wordt een studie uitgevoerd om te bepalen in welke fractie de componenten worden uitgescheiden.
Er wordt gestart met 100 μl urine welke vervolgens 3 procedures ondergaat om respectievelijk de vrije, geglucuronideerde (gegluc.) en gesulfateerde (gesulf.) componenten te extraheren.
Tijdens de eerste procedure worden de vrije componenten geëxtraheerd uit de urine. Bij deze procedure is er geen enzymatische hydrolyse met andere woorden er wordt tijdens de extractieprocedure (zie punt 2.4. Extractieprocedure) onmiddellijk gestart met de vloeistof- vloeistofextractie. De organische fase bevat nu enkel de vrije componenten terwijl zich in de urine de geglucuronideerde en gesulfateerde componenten bevinden. Tijdens de tweede procedure worden de geglucuronideerde componenten geëxtraheerd uit de urine.
Enzymatische hydrolyse vindt hier plaats met β-glucuronidase afkomstig van E. coli volgens de beschreven extractieprocedure (2.4. Extractieprocedure). De hieropvolgende vloeistof- vloeistofextractie zal enkel de door de hydrolyse vrijgestelde steroïden selectief extraheren.
Als laatste procedure worden de gesulfateerde componenten geëxtraheerd uit de urine.
Enzymatische hydrolyse vindt plaats met β-glucuronidase afkomstig van H. pomatia in combinatie met een acetaatbuffer (pH 5). In de organische fase bevinden zich nu de door de hydrolyse vrijgestelde steroïden.
Vervolgens worden alle fracties afzonderlijk gederivatiseerd met de TMS- derivatiseringsoplossing waarna analyse plaatsvindt op GC-MS. Figuur 5 geeft een overzicht van de 3 procedures van de fractie analyse.
16
2.7. Referentieoplossing, QC-stalen en PBS-oplossing
Vooreerst wordt een referentieoplossing gemaakt van mibolerone en methyl-1-testosteron. De steroïdcomponenten worden afzonderlijk opgelost in methanol tot de gewenste concentratie (werkoplossing). Daaruit wordt vervolgens een kleine hoeveelheid ingedampt met stikstof gevolgd door derivatisatie met de TMS-derivatiseringsoplossing waarna het staal geanalyseerd wordt met GC-MS. De referentieoplossing wordt gemaakt om het massaspectrum en de retentietijd van de component te bepalen. Ook wordt er gecontroleerd of het referentiemateriaal niet gecontamineerd is met andere componenten die ontstaan bij de productie van de component.
Er worden ook kwaliteitscontroles (QC’s) gemaakt waarbij blanco muisurine aangerijkt wordt met de desbetreffende steroïdcomponent. De QC’s laten toe het steroïd te detecteren bij een achtergrond van urine (matrix) en om eventuele interferentie met componenten uit de urine te bepalen.
Na het maken van de PBS-oplossing die het steroïd bevat, wordt deze oplossing geanalyseerd volgens de extractieprocedure (zie 2.4. Extractieprocedure). Op die manier kan achteraf bepaald worden welke pieken in de spectra afkomstig zijn van de PBS-oplossing.
Figuur 5: De 3 procedures van de fractie analyse.
17
3. Resultaten & bespreking
3.1. Mibolerone
3.1.1. Metabolisatie van mibolerone in de literatuur
Wegens de hepatische toxiciteit en het niet beschikbaar zijn van mibolerone als humaan geneesmiddel zijn er in de literatuur weinig humane metabole studies van de component voorhanden. In het artikel van Zhang et al. [20] wordt een dosis van 14,5 mg mibolerone toegediend aan één mannelijke vrijwilliger. In de urine van de man worden vervolgens met behulp van GC-MS/MS 4 componenten gedetecteerd. De eerste is mibolerone zelf met als belangrijkste fragmentionen massa/lading (m/z) 446, 431, 341 en 301. Een tweede metaboliet is dihydromibolerone, welke ontstaat door een 5α- of 5β-reductie, met als belangrijkste fragmentionen m/z 448, 358, 343 en 304. De derde metaboliet die gedetecteerd wordt, is tetrahydromibolerone met fragmentionen m/z 450, 435, 360 en 345. De vierde metaboliet is dihydroxy-mibolerone met als fragmentionen m/z 624, 534, 444, 354, 231 en 218. De ionen m/z 218 en 231 wijzen op de aanwezigheid van een 16α- of 16β-hydroxy structuur [22]. In het artikel van Bowers [19] wordt 1 mg mibolerone toegediend aan één vrijwilliger waarna 2 metabolieten gedetecteerd worden. De eerste metaboliet is mibolerone zelf met als belangrijkste fragmentionen m/z 446, 431, 341 en 301. De tweede metaboliet is tetrahydro- mibolerone met als belangrijkste fragmentionen m/z 360 en 270. Schänzer [7] behandelt slechts zeer kort het metabolisme van mibolerone waarbij dezelfde resultaten als Bowers [19]
worden bekomen.
In de artikels is slechts weinig informatie beschikbaar en afhankelijk van de studie worden verschillende resultaten verkregen. Enkel bij het artikel van Zhang et al. [20] worden de massaspectra, verkregen via GC-MS/MS, gegeven. Zowel in het artikel van Zhang et al. [20]
als in het artikel van Bowers [19] wordt slechts één proefpersoon gebruikt. Tabel 3 geeft een overzicht van de gedetecteerde metabolieten van mibolerone beschreven in de literatuur.
18 Tabel 3: Overzicht van de metabolieten van mibolerone beschreven in de literatuur.
Component Structuur m/z Zhang
[20]
Bowers [19]
Schänzer [7]
Mibolerone 446
431 341 301
x x x
Dihydro- mibolerone (intermediair bij vorming van DIOL metaboliet)
448 433 343 358
x
Tetrahydro- mibolerone (= DIOL metaboliet)
450 435 360 270
x x x
Dihydroxy- mibolerone
624 534 444 231 218
x
O CH3
CH3 OH CH3
O CH3
CH3 OH CH3
HO CH3
CH3 OH CH3
O CH3
CH3 OH CH3
OH
OH
19
3.1.2. Metabolisatie van mibolerone in het muismodel
Na analyse van alle muisurines op GC-MS worden de bekomen data geëvalueerd op basis van de vergelijking van de resultaten van de pre- en post-administratiestudies.
3.1.2.1. Chimere muis A. Pre-administratie urine
De pre-administratie urines van alle muizen bleken behalve de aangerijkte IS geen componenten van mibolerone te bevatten (Figuur 6) en kunnen dus als een negatieve urine beschouwd worden. Alle componenten die exclusief gedetecteerd worden in de post- administratie urine zijn dus mogelijkerwijs afkomstig van de toediening van mibolerone of de metabolisatie ervan. De endogene steroïden afkomstig van de eigen productie van de muizen worden via de gebruikte methode niet gedetecteerd, wat een voordeel oplevert bij de evaluatie van de urinestalen.
15.00 15.50 16.00 16.50 17.00 17.50 18.00
0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 100000 110000 120000
Time-->
Abundance
Ion 446.00 (445.70 to 446.70): K1100BL1.D Ion 461.00 (460.70 to 461.70): K1100BL1.D Ion 341.00 (340.70 to 341.70): K1100BL1.D Ion 301.00 (300.70 to 301.70): K1100BL1.D
IS
Figuur 6: Chromatogram van de pre-administratie urine met de aangerijkte IS op RT 15.67 minuten.
20 B. Post-administratie urine
De resultaten van alle chimere muizen zijn gelijklopend. Hierna worden de resultaten van slechts 1 chimere muis gegeven om meer in detail te bespreken. Alle chromatogrammen en massaspectra zijn bekomen na derivatisatie van de steroïden tot TMS-enol-TMS-ether derivaten.
Mibolerone, de toegediende component, komt voor in de urine van alle chimere muizen als bewijs van een succesvolle toediening. Figuur 7 stelt het chromatogram voor van mibolerone, het epimeer en de inwendige standaard.
Mibolerone komt voor op retentietijd (RT) 15.12 min en de belangrijkste fragmentionen zijn m/z 446 ([M]+), 431, 341 en 301 (Figuur 8). Ion m/z 431 ontstaat door verlies van een methyl groep [M-15]+ terwijl ion m/z 341 ontstaat door afsplitsing van een TMS-OH groep (-90 Da) [M-15-OTMS]+. De inwendige standaard 17α-methyltestosteron komt voor op retentietijd 15.67 min en heeft als belangrijkste fragmentionen m/z 446 en 301 (Figuur 9). Hoewel mibolerone en de inwendige standaard exact dezelfde massa hebben, worden ze perfect van elkaar gescheiden en bovendien worden ze op een verschillende manier gefragmenteerd. Dit resulteert in massaspectra met verschillende abundanties van fragmentionen (Figuur 8,9).
Een tweede metaboliet die wordt gedetecteerd, bevindt zich op retentietijd 18.13 min en heeft als belangrijkste (fragment)ion m/z 431 (Figuur 10). Er wordt vermoed dat dit een epimeer is van mibolerone maar gezien het spectrum weinig informatief is (slechts 1 abundant ion), is het moeilijk meer structuurinformatie te halen uit het spectrum.
Figuur 7: Chromatogram van mibolerone op RT 15.12 min, 17α-methyltestosteron (IS) op RT 15.67 min en het epimeer op RT 18.13 min.
1 5 . 0 0 1 5 . 5 0 1 6 . 0 0 1 6 . 5 0 1 7 . 0 0 1 7 . 5 0 1 8 . 0 0 0
2 0 0 0 0 4 0 0 0 0 6 0 0 0 0 8 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 1 4 0 0 0 0
T im e -->
A b u n d a n c e
I o n 4 4 6 . 0 0 (4 4 5 . 7 0 t o 4 4 6 . 7 0 ): 1 1 0 0 1 5 0 1 . D I o n 4 3 1 . 0 0 (4 3 0 . 7 0 t o 4 3 1 . 7 0 ): 1 1 0 0 1 5 0 1 . D I o n 3 4 1 . 0 0 (3 4 0 . 7 0 t o 3 4 1 . 7 0 ): 1 1 0 0 1 5 0 1 . D I o n 3 0 1 . 0 0 (3 0 0 . 7 0 t o 3 0 1 . 7 0 ): 1 1 0 0 1 5 0 1 . D
mibolerone
IS
Epimeer
21 Figuur 8: Massaspectrum van mibolerone (RT 15.12 min) met fragmentionen m/z 446, 431, 341 en 301.
Figuur 9: Massaspectrum van 17α-methyltestosteron (IS) (RT 15.67 min) met belangrijkste fragmentionen m/z 446 en 301.
Figuur 10: Massaspectrum van het epimeer van mibolerone (RT 18.13 min) met (fragment)ion m/z 431.
22 Figuur 11 geeft een overzicht van 8 andere metabolieten die gedetecteerd worden in de muisurine na de administratie van mibolerone.
Figuur 11: Chromatogram van metabolieten hydroxy A, B en C en dihydroxy A1, A2, A3, A4 en B.
De metabolieten hydroxy A (Figuur 12), hydroxy B (Figuur 13) en hydroxy C (Figuur 14) komen voor op retentietijden 16.37 min, 16.50 min en 18.62 min respectievelijk. Deze 3 metabolieten beschikken over een sterk gerelateerd massaspectrum met kleine verschillen in de verhoudingen van de ionen. De belangrijkste fragmentionen van hydroxy A zijn m/z 534, 519, 444, 429 en 339 terwijl hydroxy B als belangrijkste fragmentionen m/z 534, 519, 444, 419 en 389 heeft. Metaboliet hydroxy C heeft als fragmentionen m/z 534, 519, 429 en 339.
De aanwezigheid van ion m/z 534 bij deze 3 componenten doet vermoeden dat mibolerone tijdens de metabolisatie gehydroxyleerd wordt. Op welke positie deze extra OH-groep komt, is onduidelijk. Veel voorkomende plaatsen van hydroxylatie zijn positie C6, C12 en C16 (zie 1.3.1. Fase 1 reacties). Indien deze extra OH-groep op positie C16 zou komen, zouden ionen m/z 218 en 231 ook moeten verschijnen in het massaspectrum [22]. Een extra OH-groep op positie 12 vereist de aanwezigheid van ion m/z 170 in het massaspectrum [7]. Door de afwezigheid van ionen m/z 218, 231 en 170 kan hydroxylatie op C12 en C16 bijna met zekerheid worden uitgesloten. De extra OH-groep wordt ook gesilyleerd door de derivatisatie waardoor het MW van mibolerone toeneemt tot m/z 534 [M]+. Ion m/z 519 ontstaat door afsplitsing van een methylgroep [M-15]+. Ion m/z 444 ontstaat door afsplitsing van een TMS- OH groep (-90 Da). Ionen m/z 429 en 339 ontstaan door afsplitsing van tweemaal een TMS- OH groep.
16.00 16.20 16.40 16.60 16.80 17.00 17.20 17.40 17.60 17.80 18.00 18.20 18.40 18.60 18.80 0
20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 180000 200000 220000 240000 260000 280000 300000
Time-->
Abundance Ion 534.00 (533.70 to 534.70): 11001501.D
Ion 444.00 (443.70 to 444.70): 11001501.D Ion 389.00 (388.70 to 389.70): 11001501.D Ion 622.00 (621.70 to 622.70): 11001501.D Ion 624.00 (623.70 to 624.70): 11001501.D Ion 607.00 (606.70 to 607.70): 11001501.D
diOHA1 Hydroxy A Hydroxy B
diOHA2
Hydroxy C
diOHA3 diOHA4
diOH B
23 Figuur 12: Massaspectrum van hydroxy A (RT 16.37 min) met fragmentionen m/z 534, 519, 444, 429 en 339.
Figuur 13: Massaspectrum van hydroxy B (RT 16.50 min) met fragmentionen m/z 534, 519, 444, 429 en 389 en 299.
Figuur 14: Massaspectrum van hydroxy C (RT 18.62) met fragmentionen m/z 534, 519, 429 en 339.
24 Metabolieten dihydroxy-mibolerone (diOH) A1, A2, A3 en A4 (Figuur 11) liggen op respectievelijke retentietijden 16.04 min, 18.33 min, 18.91 min en 19.03 min. De belangrijkste fragmentionen van deze 4 metabolieten zijn m/z 622, 607, 517, 427 en 337 (Figuur 15). Mibolerone wordt tijdens de metabolisatie 2 keer gehydrolyseerd met andere woorden er komen 2 extra OH-groepen op mibolerone wat het MW van 622 Da [M]+ verklaart. Opnieuw is het onduidelijk op welke posities deze extra OH-groepen komen. Ion m/z 244 is in geringe mate aanwezig in de spectra van diOH A1, A3 en A4 wat kan wijzen op een C16-ketostructuur [22]. Enkel bij metaboliet diOH A2 (Figuur 16) zijn fragmentionen m/z 218 en 231 aanwezig in het massaspectrum wat een indicatie is voor een hydroxylatie op positie C16 [22]. Ion m/z 607 ontstaat door afsplitsing van een methylgroep [M-15]+. Ionen m/z 517, 427 en 337 ontstaan telkens door afsplitsing van een TMS-OH groep.
Figuur 15: Massaspectrum van metabolieten diOH A1, A3 en A4 met fragmentionen m/z 622, 607, 517, 427, 337 en 244.
Figuur 16: Massaspectrum van metaboliet diOH A2 met fragmentionen m/z 622, 607, 231 en 218.
25 Metaboliet diOH B (Figuur 17) heeft een MW van 624 Da [M]+ en komt voor op retentietijd 18.80 min. De belangrijkste fragmentionen zijn m/z 624 en 609. Dit metaboliet ontstaat door een dubbele hydroxylatie en tevens vindt een reductie plaats in de A-ring. De aanwezigheid van fragmentionen m/z 218 en 231 is een indicatie voor de aanwezigheid van een C16-OH groep. Dit laatste metaboliet komt sterk overeen met de dihydroxy-mibolerone metaboliet gerapporteerd in het artikel van Zhang et al. [20]. In het massaspectrum van deze metaboliet is echter een grote piek van ion m/z 129 aanwezig, iets wat niet gedetecteerd wordt in het massaspectrum van metaboliet diOH B bij de muis. Het is niet duidelijk of deze piek afkomstig is van interferentie. Bovendien komt de voorgestelde structuur van de metaboliet in het artikel van Zhang et al. [20] niet overeen met hun bekomen massaspectrum. Ondanks dit verschil kan vermoedelijk geconcludeerd worden dat het toch om dezelfde metaboliet gaat.
Fragkaki et al. [23] rapporteren immers een metaboliet (7α, 17α-dimethyl-5β-estrane- 6β,16β,17β-triol-3-one) met eveneens een MW van 624 Da en een 16-hydroxylatie (Tabel 4).
De door Fragkaki et al. [23] gerapporteerde metaboliet is gebaseerd op dezelfde publicatie van Zhang et al. [20].
Figuur 17: Massaspectrum van metaboliet diOH B met fragmentionen m/z 624, 609, 231 en 218.
26 De laatste metaboliet die kan worden gedetecteerd is een onbekende component op retentietijd 15.46 min met als belangrijkste fragmentionen m/z 420, 330, 315, 446, 356 en 275 (Figuur 18, 19). De structuur van deze component is onbekend. Ion m/z 394 komt voor in het spectrum maar bevindt zich ook in de blanco urine van de muizen en ligt niet onder de piek van de onbekende component (Figuur 18).
Figuur 18: Chromatogram van de onbekende component op RT 15.46 min.
Figuur 19: Massaspectrum van de onbekende component met fragmentionen m/z 420, 330 en 315.
15.36 15.38 15.40 15.42 15.44 15.46 15.48 15.50 15.52 15.54 15.56 15.58
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 13000 14000 15000 16000 17000 18000 19000 20000 21000 22000 23000 24000 25000 26000
Time-->
Abundance
Ion 420.00 (419.70 to 420.70): 11001501.D Ion 330.00 (329.70 to 330.70): 11001501.D Ion 315.00 (314.70 to 315.70): 11001501.D Ion 446.00 (445.70 to 446.70): 11001501.D Ion 394.00 (393.70 to 394.70): 11001501.D Ion 275.00 (274.70 to 275.70): 11001501.D
m/z 394 15.46 min
27
15.00 15.50 16.00 16.50 17.00 17.50 18.00
0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 180000
Time-->
Abundance
Ion 446.00 (445.70 to 446.70): 24811501.D Ion 431.00 (430.70 to 431.70): 24811501.D Ion 341.00 (340.70 to 341.70): 24811501.D Ion 301.00 (300.70 to 301.70): 24811501.D
Mibolerone IS
Epimeer 3.1.2.2. Niet-chimere muis
De niet-chimere muizen worden gebruikt als een controle om te bepalen welke metabolieten gevormd worden door muis en/of humane hepatocyten. Aangezien de humanisatie van de muislever geen 100% is (maximum 80%), moet hiervoor immers gecorrigeerd worden.
Bij vergelijking van het chromatogram van de chimere muis (Figuur 7) met dat van de niet- chimere muis (Figuur 20) valt onmiddellijk op dat mibolerone in een veel lagere hoeveelheid voorkomt in de niet-chimere muis. Alle muizen werden nochtans op hetzelfde tijdstip gegaveerd met dezelfde steroïdoplossing. De inwendige standaard 17α-methyltestosteron is zichtbaar op retentietijd 15.67 min alsook het epimeer van mibolerone op retentietijd 18.13 min (Figuur 20).
Figuur 20: Chromatogram van mibolerone, de IS en het epimeer in de niet-chimere muis.
Bij vergelijking van het chromatogram van de chimere muis (Figuur 11) met het chromatogram van de niet-chimere muis (Figuur 21) valt op dat enkele metabolieten niet gedetecteerd worden in de niet-chimere muis. Metabolieten hydroxy A, hydroxy B, hydroxy C en diOH B worden niet gedetecteerd. Metabolieten diOH A1, A2, A3 en A4 worden wel gedetecteerd. De concentraties van de gedetecteerde metabolieten diOH A1, A2 en A3 zijn echter veel lager dan de gedetecteerde concentraties bij de chimere muis met uitzondering van metaboliet diOH A4. Blijkbaar wordt mibolerone in de niet-chimere muis zeer snel afgebroken/gemetaboliseerd tot voornamelijk diOH metabolieten en het epimeer.
28 De onbekende metaboliet wordt niet gedetecteerd bij de niet-chimere muis (Figuur 22).
Figuur 22: Chromatogram van de onbekende component bij de niet-chimere muis. De metaboliet wordt niet gedetecteerd. Enkel de interferentie van ion m/z 394 is zichtbaar.
3.1.3. Drievoudige urineanalyse
De urines van 3 chimere muizen en 1 niet-chimere muis werden in drievoud geanalyseerd volgens de besproken extractieprocedure (Figuur 23). Dit gebeurt om te corrigeren voor toevalligheden in de extractie en om de herhaalbaarheid/robuustheid van de methode aan te tonen. Er wordt een kwantitatie rapport opgesteld waarbij de responsen (R) van de verschillende metabolieten bepaald worden. Vervolgens worden deze responsen gedeeld door de respons van de inwendige standaard (RIS). Er wordt ook gecorrigeerd voor het urinevolume
15.36 15.38 15.40 15.42 15.44 15.46 15.48 15.50 15.52 15.54 15.56 15.58
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000 22000 24000 26000 28000 30000
Time-->
Abundance
Ion 420.00 (419.70 to 420.70): 24811501.D Ion 330.00 (329.70 to 330.70): 24811501.D Ion 315.00 (314.70 to 315.70): 24811501.D Ion 446.00 (445.70 to 446.70): 24811501.D Ion 394.00 (393.70 to 394.70): 24811501.D Ion 275.00 (274.70 to 275.70): 24811501.D
m/z 394
16.000 16.20 16.40 16.60 16.80 17.00 17.20 17.40 17.60 17.80 18.00 18.20 18.40 18.60 18.80 20000
40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 180000 200000 220000 240000 260000 280000 300000 320000 340000
Time-->
Abundance
Ion 534.00 (533.70 to 534.70): 24811501.D Ion 444.00 (443.70 to 444.70): 24811501.D Ion 389.00 (388.70 to 389.70): 24811501.D Ion 622.00 (621.70 to 622.70): 24811501.D Ion 624.00 (623.70 to 624.70): 24811501.D Ion 607.00 (606.70 to 607.70): 24811501.D
diOHA1 diOHA2
diOHA3 diOHA4
Figuur 21: Chromatogram van metabolieten diOH A1, A2, A3 en A4 bij de niet-chimere muis.
29 02
46 108 1214 1618 20
Chimere muis 1
1 2 3 Analyse
02 46 108 1214 1618 20
Chimere muis 2
1 2 3 Analyse
02 46 108 1214 1618 20
Chimere muis 3
1 2 3 Analyse
02 46 108 1214 1618 20
Niet-chimere muis
1 2 3 Analyse geproduceerd in die 24 uren (Vurine) (R/RIS x Vurine). De grafieken geven een overzicht van de
verschillende metabolieten en hun abundanties. Aan de hand van deze grafieken worden de verschillen tussen de chimere en niet-chimere muizen nog duidelijker. Daarbij zijn tussen de chimere muizen onderling ook een aantal verschillen waarneembaar. Dit is te verklaren door de verschillen in concentratie van humaan albumine bij de chimere muizen. Hierbij is de concentratie van humaan albumine het grootst bij chimere muis 1, gevolgd door chimere muis 2 en als laatste chimere muis 3. Hoe groter de concentratie aan humaan albumine, hoe meer de lever geregenereerd is met humane hepatocyten en hoe dichter het profiel dus aanleunt bij het humane profiel [9]. Aangezien chimere muis 3 de laagste concentratie aan humaan albumine heeft, zou het profiel van deze muis het best moeten overeenkomen met het profiel van de niet-chimere muis. Met uitzondering van de metabolieten die niet gedetecteerd worden in de niet-chimere muis, komen deze profielen ongeveer overeen.
Figuur 23: Overzicht van de responsen van de metabolieten na analyse van de urines van 3 chimere en 1 niet- chimere muis in 3-voud.
