2.1. Reagentia
Mibolerone was een gift van Upjohn (Michigan, VS). Methyl-1-testosteron werd aangekocht bij het NMI (Pymble, Australië). De inwendige standaard (IS) 17α-methyltestosteron is afkomstig van Organon (Oss, Nederland).
Phosphate buffered saline (PBS) is afkomstig van Invitrogen (Merelbeke, België). Ethanol (96%) is afkomstig van Biosolve (Valkenswaard, Nederland). Methanol, diethylether en NaHCO3 werden aangekocht bij Fisher Scientific (Loughborough, Verenigd Koninkrijk).
Na2SO4, K2CO3 en NH4I zijn afkomstig van Merck (Darmstadt, Duitsland). β-glucuronidase van Escherichia coli K12 (E. coli) werd aangekocht bij Roche (Mannheim, Duitsland) en β-glucuronidase van Helix pomatia (H. pomatia) werd aangekocht bij Sigma (St-Louis, Verenigd Koninkrijk). N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide (MSTFA) is afkomstig van Karl Bucher (Waldstetten, Duitsland). Ethaanthiol (97%) is van Acros (Geel, België).
2.2. Studieprotocol
Het project werd goedgekeurd door de Ethische Commissie Dierproeven van de Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen van de Universiteit Gent (ECD 06/09). Voor de metabole studie wordt gebruik gemaakt van zowel chimere als niet-chimere muizen.
Mibolerone (50 mg/ml) wordt opgelost in een 70% PBS, 20% ethanol, 10% methanol oplossing en methyl-1-testosteron (10 mg/ml) wordt opgelost in een 90% PBS en 10%
ethanol oplossing. Deze dosissen werden in een pre-studie bepaald waarbij verschillende concentraties van de steroïdcomponent werden toegediend aan de muizen. Vooreerst worden de muizen gedurende 24 uur in de metabole kooien (Tecniplast, Someren, Nederland) geplaatst om een blanco urine te verkrijgen. Deze metabole kooien zijn speciaal ontwikkeld voor kleine dieren en maken het mogelijk urine en faeces afzonderlijk op te vangen.
Vervolgens wordt 150 μl van de mibolerone oplossing of 200 μl van de methyl-1-testosteron oplossing via orale gavatie toegediend aan de muizen waarna ze opnieuw in de metabole kooien worden geplaatst. Aangezien de muizen slechts een beperkte hoeveelheid urine produceren ( 1,5 ml/24 uur) wordt de urine telkens na 24 uur gecollecteerd waarna deze bewaard wordt in de diepvriezer bij -20°C tot het moment van analyse. Door de geringe
13
Urine Enzymatische hydrolyse
Vloeistof-vloeistofextractie Derivatisatie GC-MS
urineproductie is het niet mogelijk een excretieprofiel op te stellen waarbij urinecollectie plaatsvindt na 1, 2, 4, 6… uur.
2.3. Muizen
Voor de metabole studie van mibolerone werden 8 chimere en 3 niet-chimere muizen gebruikt terwijl voor de metabole studie van methyl-1-testosteron 4 chimere en 3 niet-chimere muizen werden gebruikt. De transplantatie methodologie van de muizen werd ontwikkeld door Professor Meuleman van het CEVAC [9]. In de metabole kooien hebben de muizen ad libitum toegang tot water en voedsel in poedervorm. De hoeveelheid aan humane hepatocyten in de muis werd bepaald door het gehalte aan humaan albumine te bepalen in het plasma van de muis.
2.4. Extractieprocedure
De extractieprocedure van de urinestalen wordt voorgesteld in onderstaande flowchart (Figuur 4). Deze extractieprocedure is nodig om de steroïdcomponenten te isoleren uit de urine. De hieronder beschreven procedure is gebaseerd op de routine procedure die gebruikt wordt in DoCoLab bij de analyse van urinestalen.
Figuur 4: Schematische voorstelling van de extractieprocedure van anabole steroïden uit muisurine.
Nadat de urine ontdooid is, wordt 100 μl van de muisurine overgebracht in een kleine, gelabelde sovirelbuis (Pyrex, Staffordshire, Verenigd Koninkrijk). Vervolgens wordt 50 μl van de inwendige standaard, 17α-methyltestosteron, toegevoegd. Deze structuurgerelateerde steroïdcomponent wordt toegevoegd als controle. Op die manier kan gecorrigeerd worden voor fouten ontstaan tijdens de staalvoorbereiding of fouten ontstaan door variaties in efficiëntie van de steroïd derivatisatie. Voor de enzymatische hydrolyse wordt 50 μl
β-14 glucuronidase (E. coli) toegevoegd met 1 ml fosfaatbuffer pH 7. De stalen worden gevortexd en vervolgens gedurende 2,5 uur in de oven geplaatst bij 56 5°C. Wanneer de stalen afgekoeld zijn tot kamertemperatuur wordt voor de vloeistof-vloeistof extractie 1 g vaste buffer NaHCO3/K2CO3 en 5 ml diethylether toegevoegd aan het staal. De stalen worden gedurende 20 minuten gerold waarna ze gedurende 5 minuten gecentrifugeerd worden aan 2000-2500 toeren/minuut (rpm). De organische fase wordt vervolgens afgenomen en in een kleine sovirelbuis overgebracht waar 1 g Na2SO4 aan wordt toegevoegd. Vervolgens wordt de organische fase opnieuw overgebracht in een kleine sovirelbuis waarna ze ingedampt wordt met stikstof bij 40 5°C tot droog. De residuen worden vervolgens nog 10 minuten extra in de oven geplaatst bij 80 5°C. Vervolgens wordt 100 μl MSTFA/NH4I/ethaanthiol (trimethylsilyl (TMS)-derivatiseringsoplossing) toegevoegd waarna de stalen gedurende 1 uur in de oven geplaatst worden bij 80 5°C. Door de derivatisatie worden de hydroxyl- en ketogroepen van de componenten gesilyeerd tot respectievelijk TMS ether en TMS enolderivaten. Hierdoor verandert het moleculair gewicht van de component. Het moleculair gewicht van zowel mibolerone als methyl-1-testosteron wordt m/z 446 na derivatisatie met de TMS-derivatiseringsoplossing.
2.5. Analyse met GC-MS
Voor analyse met GC-MS wordt 50 μl van elk staal overgebracht in een autosampler vial en afgesloten met een aluminium cap. Analyse met GC-MS gebeurde in full scan op een Agilent 6890 gaschromatograaf die gekoppeld is aan een 5973 massa selectieve detector (Palo Alto, VS). De GC-kolom was een HP-Ultra 1 (J&W, Folsom, CA, VS), 100% methyl silicone kolom met een lengte van 17 meter, een interne diameter van 0,2 mm en een filmdikte van 0,11 μm. Het oventemperatuur programma van mibolerone was als volgt: initiële temperatuur bedraagt 120°C, 60°C/minuut (min) 183°C, 3°C/min 232°C, 40°C/min 310°C. De totale analysetijd bedraagt 22,33 min. Voor methyl-1-testosteron werd volgend temperatuurprogramma gebruikt: de initiële temperatuur bedraagt 120°C, 70°C/min 180°C, 4°C/min 234°C, 30°C/min 300°C. De totale analysetijd bedraagt 18,76 min. Het draaggas was helium aan een constante flowsnelheid van 0,5 ml/min. De elektron energie was vastgesteld op 70 eV en de ionenbron temperatuur was 250 °C. Het injectie volume was 0,5 μl, splitless.
15
2.6. Fractie analyse
Zoals reeds besproken worden de componenten voornamelijk in de lever gemetaboliseerd door fase 1 en fase 2 reacties om de excretie uit het lichaam te bevorderen. Wanneer een component een fase 1 reactie ondergaat, wordt de component gedetecteerd in zijn vrije vorm.
Wanneer de component echter een fase 2 reactie ondergaat, wordt deze geglucuronideerd of gesulfateerd uitgescheiden in de urine. Op de urinestalen wordt een studie uitgevoerd om te bepalen in welke fractie de componenten worden uitgescheiden.
Er wordt gestart met 100 μl urine welke vervolgens 3 procedures ondergaat om respectievelijk de vrije, geglucuronideerde (gegluc.) en gesulfateerde (gesulf.) componenten te extraheren.
Tijdens de eerste procedure worden de vrije componenten geëxtraheerd uit de urine. Bij deze procedure is er geen enzymatische hydrolyse met andere woorden er wordt tijdens de extractieprocedure (zie punt 2.4. Extractieprocedure) onmiddellijk gestart met de vloeistof-vloeistofextractie. De organische fase bevat nu enkel de vrije componenten terwijl zich in de urine de geglucuronideerde en gesulfateerde componenten bevinden. Tijdens de tweede procedure worden de geglucuronideerde componenten geëxtraheerd uit de urine.
Enzymatische hydrolyse vindt hier plaats met β-glucuronidase afkomstig van E. coli volgens de beschreven extractieprocedure (2.4. Extractieprocedure). De hieropvolgende vloeistof-vloeistofextractie zal enkel de door de hydrolyse vrijgestelde steroïden selectief extraheren.
Als laatste procedure worden de gesulfateerde componenten geëxtraheerd uit de urine.
Enzymatische hydrolyse vindt plaats met β-glucuronidase afkomstig van H. pomatia in combinatie met een acetaatbuffer (pH 5). In de organische fase bevinden zich nu de door de hydrolyse vrijgestelde steroïden.
Vervolgens worden alle fracties afzonderlijk gederivatiseerd met de TMS-derivatiseringsoplossing waarna analyse plaatsvindt op GC-MS. Figuur 5 geeft een overzicht van de 3 procedures van de fractie analyse.
16
2.7. Referentieoplossing, QC-stalen en PBS-oplossing
Vooreerst wordt een referentieoplossing gemaakt van mibolerone en methyl-1-testosteron. De steroïdcomponenten worden afzonderlijk opgelost in methanol tot de gewenste concentratie (werkoplossing). Daaruit wordt vervolgens een kleine hoeveelheid ingedampt met stikstof gevolgd door derivatisatie met de TMS-derivatiseringsoplossing waarna het staal geanalyseerd wordt met GC-MS. De referentieoplossing wordt gemaakt om het massaspectrum en de retentietijd van de component te bepalen. Ook wordt er gecontroleerd of het referentiemateriaal niet gecontamineerd is met andere componenten die ontstaan bij de productie van de component.
Er worden ook kwaliteitscontroles (QC’s) gemaakt waarbij blanco muisurine aangerijkt wordt met de desbetreffende steroïdcomponent. De QC’s laten toe het steroïd te detecteren bij een achtergrond van urine (matrix) en om eventuele interferentie met componenten uit de urine te bepalen.
Na het maken van de PBS-oplossing die het steroïd bevat, wordt deze oplossing geanalyseerd volgens de extractieprocedure (zie 2.4. Extractieprocedure). Op die manier kan achteraf bepaald worden welke pieken in de spectra afkomstig zijn van de PBS-oplossing.
Figuur 5: De 3 procedures van de fractie analyse.
17