2.1 Sampling van P. infestans isolaten
Het doel van deze proef was inzicht krijgen in de aanwezige P. infestans genotypen in Vlaanderen. Er werden bij deze proef geïnfecteerde aardappelbladeren verzameld in de regio Knokke-Heist en regio Brugge. Het was ook de bedoeling om nog geïnfecteerd bladmateriaal te verkrijgen van andere regio’s, via het PCA, maar door de lage infectiedruk konden zij geen stalen bezorgen.
2.1.1 Inzamelen geïnfecteerd plantenmateriaal
Vanaf midden juli 2019 tot het moment vóór de loof-doding (midden september 2019) werd gezocht naar P. infestans symptomen op aardappel. Niet alleen aardappelpercelen, maar ook percelen en afvalhopen waar opslagaardappelen aanwezig waren, werden geobserveerd. Dit werd gedaan tijdens het aardappelseizoen, maar ook vooral na het aardappelseizoen, wanneer de weersomstandigheden opnieuw gunstig waren, i.e. vochtig weer, voor een P.
infestans uitbraak. Veel landbouwers telen graansoorten, zoals wintertarwe, gerst, …, na het
telen van aardappelen, om deze reden werd er vooral na het aardappelseizoen gekeken naar graanpercelen waar er eventueel opslagaardappelplanten zouden bovenkomen. Het zoeken van geïnfecteerde aardappelplanten werd gedaan door random in de spuitsporen van het veld te lopen en te zoeken naar bladeren waar er reeds laesies op aanwezig zijn. Indien laesies aanwezig waren, werd gekeken naar de onderkant van het blad om na te gaan of P. infestans aan het sporuleren is. Dit kan men zien door het aanwezig zijn van ‘wit pluis’ aan de onderkant van het geïnfecteerd blad (Figuur 7). Het is belangrijk dat de sporulatie nog aan de gang is, want deze sporen zijn nodig om het genotype te kunnen identificeren en om de oömyceet te kunnen uitplaten voor verder onderzoek.
Bij het vinden van een sporulerend blad, werd de stengel met een twee tot viertal blaadjes afgeknipt en in een doorzichtig afsluitbaar plastieken zakje gebracht. Op dit zakje werden de datum, het perceelnummer, het nummer van het staal en de exacte coördinaten geschreven. Per perceel werden een viertal stalen genomen. De stalen werden bij 7 °C bewaard bij 100 % relatieve vochtigheid. Preferentieel wordt het staal de dag na verzamelen gebruikt voor verdere isolatie in het labo. Verder werden de teeltgegevens (ras, bespuitingsschema, bemesting en rotatietijd) bij de landbouwer opgevraagd.
2.1.2 Isolaten bekomen
In het labo werd het geïnfecteerd plantenmateriaal eerst microscopisch bekeken om na te gaan als er al dan niet sporen aanwezig zijn. Het is uiteindelijk de bedoeling om de sporen, aanwezig op het blad, uit te platen en dit meerdere malen om tot een zuiver P. infestans isolaat te komen. Dit gebeurde op twee manieren onder de laminaire flow. Bij de eerste manier werd er met een micropipet 20 µl gedestilleerd water op de onderkant van het blad gepipetteerd en daarna terug opgezogen, dit een tiental keer om zoveel mogelijk sporen mee te hebben. Nadien werd de 20 µl sporenoplossing in het midden van een petriplaat met agar gebracht. De petriplaat werd afgesloten met parafilm en in een groeikamer geplaatst bij 18 °C met een fotoperiode van 16 u om P. infestans op te kweken. Bij de tweede manier werd de petriplaat
36 met agar vervangen door een envelop gemaakt uit aardappel (een P. infestans gevoelig ras). De aardappelen worden 2 min in een 0,5 % NaOCl oplossing gedompeld om ze steriel te maken. Daarna wordt de aardappel op een steriel papier gelegd waarna het m.b.v. een steriel mes en pincet eerst ontdaan wordt van de schil. Afhankelijk van de grootte van de aardappel worden 1 of meerdere “envelopvormen” gesneden uit de geschilde aardappel met een dikte van ongeveer 10 mm en een lengte van 3 tot 4 cm. De 20 µL water-sporenoplossing werd tussen de twee aardappel helften gebracht. Er groeide echter geen P. infestans uit, daarom werd de methode gewijzigd. In de aardappelenveloppe werd nu niet gewerkt met een sporenoplossing, maar werd er een stukje van 1 cm op 1 cm van het geïnfecteerd blad gesneden en tussen de aardappelhelften geplaatst. Bij beide methoden werd de aardappelenveloppe in een steriel doosje gestoken en toegebonden met parafilm. Deze doosjes werden geïncubeerd bij 20 °C met een 12 u licht, 12 u donker ritme om de oömyceet te laten groeien (Figuur 12).
Figuur 12: Schimmelpluis uitgegroeid tussen twee aardappelhelften.
2.1.3 FTA-kaarten
FTA-kaarten (Figuur 13) werden gebruikt om het genotype van geïnfecteerd plantenmateriaal te weten te komen. Bij het vinden van geïnfecteerd plantenmateriaal werd zoals hierboven eerst gecontroleerd of er al dan niet sporen aanwezig zijn, daarna werd een stukje van één op één cm van het sporulerend deel van het blad afgesneden in het labo. Dit afgesneden bladstukje werd met het sporulerend deel (bladonderzijde) naar boven op de één van de vier vakjes op de FTA-kaart gelegd. Boven dit vakje werd het perceel en staal nummer geschreven. Hierna werd de FTA-kaart opgeplooid en werd het bladstukje fijn gedrukt met een vijzel opdat het plant en oömyceet DNA op het filterpapier zou absorberen. De FTA-kaarten kunnen daarna opgestuurd worden om de P. infestans isolaten via merkers (zie sectie 1.2.2.1) te identificeren. Gezien er echter slechts op twee percelen isolaten gevonden werden, en dit onvoldoende is om een populaties studie voor Vlaanderen uit te voeren werden de kaarten niet opgestuurd.
37
Figuur 13: FTA kaart.
2.2 Proef myceliumgroeisnelheden bij verschillende temperaturen
Om het effect van temperatuur op myceliumgroei van P. infestans na te gaan, werd deze geënt op rogge medium. Dit medium werd volgens het volgende protocol gemaakt: Laat 60 g roggezaden weken in gedistilleerd water gedurende 24 h bij kamertemperatuur. De granen staan juist onder water en de beker wordt goed met aluminiumfolie afgesloten. Giet het supernatans van de kiemende zaden af en bewaar het. Voeg opnieuw gedistilleerd water aan de granen toe zodat ze een 2-tal cm onder water staan, kook de granen gedurende 1 h (vermaal de granen niet!). Sluit de beker goed af met aluminiumfolie en controleer regelmatig het waterniveau tijdens het koken. Filtreer het geheel door 4 lagen kaasdoek en knijp de zaadpulp voorzichtig uit. Gooi het kaasdoek en graanpulp weg. Voeg aan dit filtraat het afgegoten supernatans toe. Voeg 20 g suiker en 0.05 g ß-sitosterol toe en breng het volume op 1 l. Voeg 15 g agar toe. Voeg een magnetische roerstaaf toe aan de fles. Autoclaveer het medium gedurende 20 minuten bij 121 °C.
De proef werd opgezet met vier isolaten (Blue, Pink, EU1 en EU37) in vier herhalingen onder vier temperatuur regimes. Na het gieten en enten van de platen met de vier isolaten, werden de platen geïncubeerd bij 4 °C, 12 °C, 20 °C (labo) en 26 °C voor zes dagen. Na het incuberen werd de mycelium diameter gemeten zowel in de breedte als in de lengte richting. Doordat de begindiameter geweten is, kan de groeisnelheid berekend worden per isolaat en temperatuur, dit werd gedaan via de functie ‘RICHTING’ in Excel.
2.3 Proef sporenkieming bij verschillende temperaturen
Het effect van temperatuur op sporenkieming werd nagegaan door de optische densiteit, als maat voor sporenkieming, te meten. Hiervoor werd per well van een 96-well plaat 20 µL
38 sporenoplossing (5 x 104 sporen/µL) en 200 µL vloeibaar rogge medium (idem als medium uit
2.2, maar zonder agar) gepipetteerd volgens het opzet in Figuur 14, per isolaat werden dus 24 herhalingen per temperatuur voorzien. Er was ook een controle waarbij 200 µL medium + 20 µL gedestilleerd water werd gepipetteerd. De 96-well platen werden gedurende één week bij verschillende temperaturen (4 °C, 12 °C, 20 °C, 26 °C) geïncubeerd waarna de OD (620 nm) gemeten werd. De P. infestans isolaten die gebruikt werden, waren respectievelijk Blue, Pink en EU1. De gemiddelde OD van de controle werd afgetrokken van de gemiddelde OD van 24 herhalingen per isolaat om zo een netto OD te bekomen die gebruikt zal worden in de berekeningen.
Figuur 14: Opzet proef om effect temperatuur op sporenkieming te meten.
2.4 Rasgevoeligheid
Om de rasgevoeligheid na te gaan werd een Detached leaf assay (DLA) opgezet. Bij deze proefopzet werden aardappelen van verschillende rassen (Frieslander, Ratte, Jelly, Mona Lisa, Melody, Nicola, Charlotte, Challenger en Bintje) geplant in 4 L potten en opgegroeid in een serre voor ongeveer 30 dagen. Per ras werden vier samengestelde bladeren afgeknipt en op een stuk isomo bevestigd dat drijft in een bak met water. Vijf enkelvoudige bladeren van elk samengesteld blad werden geïnoculeerd met een 20 µL sporenoplossing (isolaat Bleu, (5 x 104 sporen/µL)). De laesies werden gescoord via een ordinaal scoringssysteem van 0–9,
waarbij 0 geen aansting voorsteld en 9 wanneer het volledige blad aangetast is. Op basis van de scores per blad werd de ziekte-index (%) per samengesteld blad berekend als in onderstaande formule, met ni het aantal laesies in klasse i en n het totaal aantal gescoorde
laesies. 𝑧𝑖𝑒𝑘𝑡𝑒 − 𝑖𝑛𝑑𝑒𝑥 = ∑ 𝑖 𝑥 𝑛𝑖 𝑖=9 𝑖=1 𝑛 𝑥 9 𝑥 100
2.5 Data verwerking
Om de data te verwerken, werd gebruik gemaakt van het programma ‘R’. Vooreerst werden de voorwaarden voor een ANOVA, normaliteit en homoscedasticiteit, gecontroleerd met
39 respectievelijk een Shapiro-Wilk test en een Levene Test. Een Two-way ANOVA werd gebruikt om de hoofdeffecten en interactie-effect van twee factoren (temperatuur en isolaat) op de myceliumgroeisnelheid te evalueren. Als de p-waarde kleiner is dan 0,05 dan is het effect significant bij een significantieniveau van α = 0.05. Als het interactie-effect significant was, werd er gekeken per temperatuur welke isolaten significant verschillen in groeisnelheid, en per isolaat werd gekeken tussen welke temperaturen er significante verschillen waren in groeisnelheid. Dit werd gedaan door gebruik te maken van One-way ANOVA’s. Bij een One- way ANOVA geeft een significante p-waarde (< 0,05) aan als er significante verschillen zijn tussen de isolaten, om te weten waar de verschillen zich situeren moet een Tukey HSD-test uitgevoerd worden (p-waarde < 0,05 is significant).
Bij de analyse van de OD-waarden werd gebruik gemaakt van een one-way ANOVA om het effect van temperatuur op sporenkieming na te gaan (het effect van isolaat werd hier niet nagegaan gezien er maar één gemiddelde OD-waarde was per temperatuur en per isolaat). Als effect van temperatuur significant was, werd er via de Tukey HSD-test gekeken tussen welke temperaturen er significante verschillen in sporenkieming waren.
Verder werden ook de groeisnelheid en OD uitgezet in functie van de temperatuur en werd de best passende parabolische kromme gefit. Door de afgeleide 0 te nemen van de curve kan de optimale temperatuur voor myceliumgroei en sporenkieming gevonden worden.
De analyse van de ziekte-index uit DLA werd eveneens geanalyseerd met een one-way ANOVA gevolgd door een Tukey HSD-test om na te gaan welke rassen significant van elkaar verschillen wat betreft gevoeligheid voor P. infestans aantasting.
40