Biologische organismen

In de beheersing van P. infestans is de toepassing van micro-organismen als biologisch bestrijdingsmiddel de laatste drie decennia steeds belangrijker geworden als mogelijke vervanger van fungiciden (Axel et al., 2012). Het grote nadeel van pesticiden is de angst van de consument voor het gebruik van agressieve chemicaliën in de voedselproductie die na gebruik toxische residuen in de knollen, in de bodem en in het water zouden achterlaten. Daarentegen zou de consument zich niet beangstigend moeten voelen, omdat de Europese registratie procedure voor bestrijdingsmiddelen van die aard is dat de consument niet kan blootgesteld worden aan toxische residugehaltes. Door de maatschappelijk druk om het pesticiden gebruik te verminderen, is de vraag naar biologische alternatieven echter groot (Axel et al., 2012).

Volgens Hunziker et al. (2015) wordt er te weinig onderzoek uitgevoerd naar de toepassing van micro-organismen voor gebruik bij de bestrijding van P. infestans en in het algemeen tegen

Tabel 3: Aanbod biologische aardappelrassen in 2019 (Bron:

29 oömyceten en worden er te weinig veldproeven uitgevoerd. Dit desondanks de wereldwijde verliezen die veroorzaakt worden door de oömyceten en in het bijzonder voor deze masterproef P. infestans.

In de volgende paragrafen worden er een aantal mogelijke alternatieven vermeld zoals bacteriën en schimmels die dienen als biologische bestrijding of ook biocontrole genoemd van

P. infestans.

1.4.4.1 Bacteriën

Caulier et al. (2018) hebben een proef uitgevoerd waarbij men voordeel wilde halen uit bacteriën die een milieuvriendelijk alternatief moeten bieden om P. infestans te bestrijden en de plaats van pesticiden moet innemen. In deze proef werden meer dan 2.800 soorten van de geslachten Bacillus en Pseudomonas geïsoleerd die afkomstig waren uit verschillende Belgische bodems en substraten die gelinkt waren met aardappel agrosystemen. Deze 2.800 geïsoleerde soorten werden getest op hun antagonistische activiteit tegen vijf aardappelziektes waaronder P. infestans. Hieruit werd een selectie gemaakt die bestond uit 52 Bacillus spp. en acht Pseudomonas spp., die een groeiremming van ten minste 50 % vertoonden onder in vitro condities tegen voornamelijk P. infestans. Er werden genen ontdekt die betrokken zijn bij de biosynthese van het secundaire metaboliet bacilysine. Bij Bacillus

pumilus-stammen was de productie van bacilysine gecorreleerd met sterke antagonistische

activiteit ten opzichte van P. infestans.

In Figuur 10 is het resultaat weergegeven van de potproeven uitgevoerd met vier

Pseudomonas species en zeven Bacillus species op het plaag gevoelige ras bintje. De 11

geselecteerde soorten werden gekozen op basis van hun antagonistische werking tegen P.

infestans. Deze proef werd uitgevoerd onder omstandigheden waarbij de bacteriën, de

schimmel en de plant optimaal konden groeien. De aardappelplanten werden een maand lang gegroeid in een groeikamer met cycli van 25/15 °C (dag/nacht) met een RV van 70 % en een fotoperiode van 16 licht:8 donker. De bladeren van de aardappelplanten werden geïnfecteerd met een verdunde suspensie met P. infestans bij een RV van 90 %. Na de infectie liet men de RV weer dalen. De bacteriën werden opgekweekt op lysogene broth (LB) platen voor 48 u bij 30 °C bij 120 rpm en werden gespoten op de aardappelbladeren (Caulier et al., 2018). Op Figuur 10 is duidelijk te zien dat er een hoge beschermingsindex wordt waargenomen van 50 % of hoger bij alle 11 de bacteriën.

30

Figuur 10: Beschermingsindex tegen de aardappelplaag waargenomen na bladbespuiting van Pseudomonas spp. (grijs) en Bacillus spp. (wit) op het gevoelige bintje ras (Bron: Caulier et al., 2018).

Als er dan gekeken word naar de uitgevoerde veldproef waarbij de resultaten op Figuur 11 zijn weergegeven, zien we dat de bacteriën toch niet zo goed scoren als er geen ideale omstandigheden heersen. Er zal dus nog een selectie moeten plaatsvinden om persistente bacteriestammen te bekomen die een breed temperatuurbereik hebben (Caulier et al., 2018). De belangrijkste bevinding was dat B. subtilis 30B-B6 de aardappelplaag gedurende het hele gewasseizoen aanzienlijk verminderde. In het algemeen toonde deze studie dus dat bacteriën een alternatief kunnen bieden als bestrijdingsmiddel tegen P. infestans (Caulier et al., 2018).

Figuur 11: Opbrengst bekomen na een veldproef met het challenger ras waarbij links de controle, daarna vier bacteriën en de laatste zijn twee fungiciden (Bron: Caulier et al., 2018).

Colau et al. (2018) hebben een gelijkaardig onderzoek gevoerd, zoals hierboven, naar de biocontrole van P. infestans via bacteriën. De geïsoleerde bacteriën kwamen uit de geslachten

Bacillus en Pseudomonas. In vitro werd de antagonistische werking van de bacteriën tegen P. infestans en A. solani beoordeeld. Men kwam tot de conclusie dat de stam 30B-B6 van Bacillus subtilus de groei remt van P. infestans en A. solani met respectievelijk 60 en 55 %. De

capaciteit van de 30B-B6 stam om P. infestans te bestrijden werd vervolgens getest in een veldproef. De conclusie was dat planten geïnoculeerd met de 30B-B6 stam een beschermingsindex van 22 % hadden in vergelijking met onbehandelde planten.

31 Er werd gekozen om de geslachten Bacillus en Pseudomonas te isoleren, omdat deze gekend zijn als geschikte kandidaten voor gebruik in de biocontrole. Dit doordat ze in verschillende omgevingen met overwicht aanwezig zijn, ook door hun veerkracht, hun overlevingsvermogen en ze zijn potentieel instaat om bioactieve secundaire metabolieten te produceren tegen P.

infestans (Caulier et al., 2018). Beide bacteriële geslachten bezitten ook andere belangrijke

eigenschappen zoals plantengroei bevorderende eigenschappen. In 1978 werd voor eerst de term Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR) geïntroduceerd om bacteriën aan te duiden die de rhizosfeer van de plant bezetten en de groei van de plant aanzienlijk bevordert. Inenting van B. Subtilis in wortelplanten deed de productie stijgen tot 48 % (Santoyo et al., 2012).

Microbiële genoomsequentie analyses van het geslacht Pseudomonas hebben genen onthuld die betrokken zijn bij de biosynthese van antibiotica. Er werden genclusters gevonden die coderen voor niet-ribosomale peptidesynthetasen (NRPS’s) die betrokken zouden zijn bij de synthese van cyclische lipopeptide antibiotica (CLP). Voor P. fluorescens, een modelstam in hedendaags onderzoek naar bacteriële evolutie, werd de productie van CLP vastgesteld. Deze productie zou een sleutelrol spelen in de motiliteit, biofilmvorming en bij de activiteit tegen zoösporen van P. infestans (De Bruijn et al., 2007). Morrison et al. (2017) hebben een nieuwe stam van P. fluorescens (LBUM636) kunnen isoleren die een antibiotische stof produceert, namelijk fenazine-1-carboxyzuur (PCA). Deze stof zou de groei van P. infestans significant remmen. De wild-type LBUM636 bleek de groei van P. infestans significant te remmen terwijl een mutant van de LBUM636 stam, die geen PCA produceert, de groei maar licht remde. Dit onderzoek werd in vitro uitgevoerd.

Zakharchenko et al. (2011) onderzocht de resistentie van de aardappelplant tegen P. infestans als binnen de rhizosfeer Pseudomonas aureofaciens aanwezig is. In vitro werd de rhizosfeer van aardappelplanten gekoloniseerd met de stam P. aureofaciens BS1393 waarna het bladerdek van de aardappelplant geïnfecteerd werd door P. infestans. Bij de controle bezetten de laesies na twee weken al 70-100 % van het bladoppervlak. Bij de aardappelplanten waar

P. aureofaciens BS1393 gekoloniseerd is in de rhizosfeer, toonden de planten geen teken van

ziekte.

Hunziker et al. (2015) deden onderzoek naar Pseudomonas stammen die vluchtige stoffen produceren die groeiremming veroorzaken bij P. infestans. Er werd geconcludeerd dat cyanogene Pseudomonas stammen het meest actief waren, wat leidde tot een volledige groeiremming van P. infestans. De vluchtige stof 1-unceen, die geproduceerd werd door de cyanogene Pseudomonas stammen, verminderde de myceliumgroei, de vorming van sporangium, de kieming en het vrijkomen van zoösporen. Er werden ook Actinobacteriën gevonden die de P. infestans groei remden via vluchtige stoffen, maar deze stoffen waren minder efficiënt dan deze van de cyanogene Pseudomonas stammen. Volgens Hunziker et al. (2015) zou de chitinewand van de oömyceten hen meer doorlaatbaar maken voor gasvormige stoffen.

32 Volgens Axel et al. (2012) zou het gebruik van melkzuurbacteriën als biocontrolemiddel tegen

P. infestans een interessant gegeven zijn. Door de grote diversiteit aan schimmelwerende

metabolieten die melkzuurbacteriën kunnen produceren, zou deze schimmelwerende werking gebruikt kunnen worden tegen P. infestans. Melkzuurbacteriën hebben hun schimmelwerende werken al bewezen tegen een breed spectrum van schimmels waaronder, Alternaria,

Aspergillus, Botrytis, Fusarium, enz. Melkzuur en azijnzuur zijn de belangrijkste

fermentatieproducten afkomstig van melkzuurbacteriën, maar daarnaast produceren ze ook verbindingen met een laag moleculair gewicht zoals organische zuren, kooldioxide, diacetyl, waterstofperoxide, cyclische dipeptiden en andere eiwithoudende verbindingen die een antischimmelwerking hebben. Dezer dagen worden melkzuurbacteriën vooral gebruikt om microbieel bederf te voorkomen in de bakkerij- en brouwerijindustrie, wijnfermentatie en verwerkte zuivelproducten.

Guo et al. (2014) onderzocht de bovenstaande hypothese. In het onderzoek werd het anti- oömyceet potentieel van Lactobacillus amylovorus tegen P. infestans onderzocht. Vijf melkzuurbacterie stammen die een sterke schimmelwering hebben tegen Penicillium,

Aspergillus en menselijke dermatofyten werden geselecteerd en getest tegen Ierse stammen

van P. infestans. Alle vijf de geselecteerde melkzuurbacteriën toonden een antimicrobiële activiteit tegen P. infestans. De metabolieten geproduceerd door de melkzuurbacteriën beïnvloeden de myceliumgroei van de aardappelplaag. De sterkste remming werd waargenomen door Lactobacillus amylovorus JG2. De negatieve Lactobacillus amylovorus DSM20531 stam toonde geen antimicrobiële activiteit, dit is dus stamafhankelijk. Er zal dus een selectie moeten plaatsvinden naar stammen die wel een antimicrobiële activiteit hebben tegen P. infestans.

1.4.4.2 Schimmels

Yao et al. (2016) hebben onderzoek uitgevoerd naar het geslacht Trichoderma behorend tot het rijk van de fungi (schimmels). In dit onderzoek werd bewezen dat het geslacht

Trichoderma, meer bepaald isolaat HNA14, instaat is om de ziektedruk van P. infestans te

verminderen en het gewicht en stengelhoogte van de aardappelplanten te verhogen. Het onderzoek gaf aan dat de metabolieten gevormd door isolaat HNA14 een antischimmelwerking hadden, waardoor de groei van de P. infestans hypen geremd werd. Trichoderma gaat andere schimmelgroei gaan tegenwerken via vier mechanismen: competitie, parasitisme, geïnduceerd resistentie en antibiose. Antibiose omvat de productie van verschillende antimicrobiële verbindingen die functioneren als hyfen groeiremmers van de plantpathogeen (Bae et al., 2016). Eén van deze vier mechanismen kan overheersen waarbij de andere drie een belangrijke rol kunnen spelen. In het onderzoek leek P. infestans opgedroogd en uitgeput door gebrek aan essentiële voedingsstoffen bij aanwezigheid van Trichoderma. De hypen van het HNA14 isolaat wikkelden zich vast rondom de hyfen van P. infestans en vormde verschillende appressoria die de hypen van de ziekteverwekker penetreerden (Yao et al., 2016).

In het onderzoek uitgevoerd door Erayya et al. (2018) werd het antagonistisch effect van

33 werd geconcludeerd dat de ziektedruk van P. infestans door Trichoderma spp. werd verlaagd in de orde van 36 tot 60 % door de 25 bestudeerde Trichoderma isolaten. De maximale vermindering van de P. infestans hyfen groei werd geregistreerd met isolaat TCMS-64. Dit onderzoek werd in vitro uitgevoerd.

Het geslacht Trichoderma behoord tot ascomycetische bodemschimmels en zijn bekende biologische bestrijdingsorganismen. Zo worden Trichoderma harzianum, T. virens en T. viride momenteel op de markt gebracht als biologische controle middelen (Bae et al., 2016). Tabel 4 geeft een overzicht van de hierboven aangehaalde alternatieven die zouden gebruikt kunnen worden als alternatieve bestrijdingstechniek tegen P. infestans.

Tabel 4: Overzicht van mogelijke alternatieven om P. infestans via biologische organismen te bestrijden.

Micro-organisme Werkwijze Referentie

Bacillus subtilis (30B-B6) Antagonistisch activiteit (Caulier et al., 2018) (Colau et al., 2018)

Bacillus pumilus Via metabolieten, namelijk bacilysine

(Caulier et al., 2018)

Pseuomonas fluorescens (LBUM636)

Via metabolieten, namelijk fenazine-1-carboxyzuur

(Morrison et al., 2017)

Pseudomonas aureofaciens

BS1393

Antagonistisch activiteit (Zakharchenko et al., 2011)

Cyanogene Pseudomonas spp. Via vluchtige metabolieten, namelijk 1-unceen

(Hunziker et al., 2015)

Lactobacillus amylovorus (JG2) Via metabolieten (Guo et al., 2014)

Trichoderma spp. (HNA14) Antagonistisch activiteit (Erayya et al., 2018) (Yao et al., 2016)