11 Absorptiespectrum en fluorescentie van bladkleurstoffen

A. Theoretische inleiding

Licht is een vorm van energie en wel elektromagnetische energie. Iedere soort licht is gekarakteriseerd door een bepaalde golflengte en energie-inhoud. Het voor ons zichtbare licht omvat een golflengtegebied van 400 nm tot 700 nm.

In vele gevallen gedraagt het licht zich als een golf (buiging, breking en verstrooiing van licht) in andere gevallen gedraagt het licht zich als een deeltje (elektrische stroom in een fotocel). Men neemt tegenwoordig aan dat licht uit golfdeeltjes bestaat, de zogenaamde fotonen. Einstein ontdekte dat deze fotonen energie-eenheden waren en noemde ze lichtquanten. De energie-inhoud van een lichtquant is bij een bepaalde frequentie (kleur) van het licht constant. Hoe hoger de frequentie (en dus hoe kleiner de golflengte) hoe groter de energie-inhoud van de lichtquanten of fotonen. De frequentie bepaalt de kleur van het licht bijvoorbeeld:

golflengte 395 nm kleur: violet golflengte 590 nm kleur: geel golflengte 650 nm kleur: rood

Stoffen, dat wil zeggen de moleculen van stoffen, kunnen licht en de daarbij behorende energie absorberen. Zo absorbeert water in geringe mate licht van alle golflengten en is daardoor kleurloos. De mate waarin een stof licht absorbeert hangt af van de bouw van het atoom en/of molecuul van die stof: dat wil zeggen van de elektronenconfiguratie rond de atoomkern, omdat het de elektronen zijn die de energie absorberen.

De elektronen zijn in een atoom op een bepaalde wijze in banen (schillen) rond de kern gerangschikt. Elektronen welke zich het dichtst bij de kern bevinden hebben een

geringere energie dan de elektronen welke zich ver van de kern bevinden. Om een elektron van een baan dichtbij de kern naar een verder af gelegen baan te brengen is energie nodig, omdat het negatief geladen elektron van de positieve kern weg moet. Als nu een lichtquant een molecuul of atoom, dat dit licht absorberen kan, treft zal een elektron deze lichtquant absorberen en daardoor zijn energie-inhoud verhogen.

Deze verhoging van energie kan voldoende zijn om dit elektron binnen het atoom naar een verder van de kern gelegen baan met grotere energie-inhoud te brengen.

Men spreekt dan van een atoom of molecuul in aangeslagen toestand. Een elektron springt slechts naar een verder van de kern gelegen baan indien een lichtquant wordt geabsorbeerd waarvan de energie-inhoud precies overeenkomt met het energieverschil tussen de baan met lagere energie-inhoud en de baan met hogere energie-inhoud. Dit betekent dat iedere atoomsoort slechts door licht met één bepaalde golflengte (bij atomen met meer dan 2 elektronenbanen meerdere bepaalde golflengten) kan worden aangeslagen. Deze golflengten verschillen van atoomsoort tot atoomsoort. De aangeslagen toestand kan dus slechts in een 'alles of niets reactie' door een lichtquant met een bepaalde energie-inhoud bewerkt worden.

Aangeslagen atomen of moleculen zijn instabiel. Het aangeslagen elektron kan uit het atoom geslingerd worden waardoor elektrische verschijnselen ontstaan (fotocel). Het aangeslagen elektron springt echter meestal terug in zijn oorspronkelijke baan waarbij de aanvankelijk opgenomen energie weer wordt afgestaan. Deze energie komt dan in de vorm van licht en/of warmte vrij. Indien deze energie vrijkomt in de vorm van licht + warmte spreekt men van fluorescentie. De golflengte van het gefluoresceerde licht is altijd groter dan die van het geabsorbeerde licht. Dit is een gevolg van het feit dat een gedeelte van de energie van de lichtquant als warmte vrijkomt.

De lichtabsorptie bij planten geschiedt door de bladkleurstoffen, waarbij chlorofyl a en b de belangrijkste zijn. Men kan de mate waarin een kleurstof licht absorbeert bij

Figuur 17. Door absorptie van een lichtquant wordt een elektron naar een verder weg gelegen schil van het atoom getransporteerd (op een hoger energieniveau gebracht).

Bij terugkeer in de oorspronkelijke toestand wordt energie als warmte of fluorescentie uitgestraald.

noemt men het absorptiespectrum (figuur 18). Metingen van de fotosynthese bij verschillende golflengten geeft in de grafische voorstelling een curve, die praktisch identiek is met het absorptiespectrum van chlorofyl. Hieruit mag tot een samenhang tussen de absorptie van licht door chlorofyl en de fotosynthetische activiteit van chlorofyl geconcludeerd worden.

Naast het chlorofyl komen in de cellen een aantal andere kleurstoffen voor:

carotenoïden. Het is nu gebleken dat deze stoffen in aangeslagen toestand hun energie overdragen aan chlorofyl a. Op deze wijze komt de energie-inhoud van licht, dat niet door chlorofyl geabsorbeerd kan worden, toch ten goede aan de fotosynthese.

Figuur 18. Absorptiespectrum van chlorofyl in ether (getrokken lijn) en fotosyntheseactiviteit bij verschillende golflengten (gestippelde lijn).

Zuiver geïsoleerd chlorofyl zat na belichting fluoresceren. Dit betekent dat de chlorofyl-moleculen door de absorptie van lichtquanten in aangeslagen toestand zijn geraakt. Doordat de geabsorbeerde energie niet in chemische energie wordt omgezet komt deze in de vorm van licht en warmte weer vrij. In levende cellen verliezen de aangeslagen chlorofylmoleculen hun energie niet in de vorm van licht en warmte, maar reageren als 'fotocellen': het energierijke elektron wordt uitgestoten en langs een ketting van

elektronendragers getransporteerd. Deze electronendragers vertonen grote

overeenkomst met de enzymen uit de ademhaling in de mitochondriën. Langs deze ketting komt het elektron weer terug in het chlorofylmolecuul; de vrijkomende energie wordt onder andere gebruikt voor de vorming van ATP uit ADP + P. ATP is de universele energieoverdragende stof bij levende organismen; het is een organisch molecuul dat zeer veel energie bevat en dit door afsplitsen van fosforzuur vrij kan maken: chemische bindingsenergie.

Figuur 19. Het omzetten van lichtenergie in chemische bindingsenergie door een aangeslagen chlorofylmolecuul. De elektronen worden via een kringloop weer in het molecuul teruggebracht. Aan deze kringloop is de vorming van ATP gebonden (cyclische fotofosforylering).

(n. Lehninger, 1970).

B. Experimenten

Bij de volgende experimenten wordt gebruik gemaakt van benzeen. Van deze stof is een carcinogene werking aangetoond: het inademen van benzeen dient dan ook te worden vermeden.

Eveneens wordt gebruik gemaakt van 3 cuvetten. Van de in de handel verkrijgbare cuvetten kan de kitsubstantie oplossen in benzeen. Het verdient aanbeveling zelf cuvetten te maken. Men klemt 2 glasplaatjes met wasknijpers aan weerszijden van een U-vormig gebogen stuk plastic slang.

a. Extractie van bladkleurstoffen

 vul een reageerbuis voor de helft met ethanol en verwarm deze in een waterbad. Ethanol is brandbaar: verwarmen op een elektrisch kookplaatje is beter dan verwarmen op een open gasvlam.

 versnipper in de warme ethanol een hoeveelheid bladeren (geschikt in de winter is diepvriesspinazie).

 als de bladkleurstof grotendeels in de ethanol is opgelost wordt afgefiltreerd.  neem de helft van het filtraat en meng dit met een gelijke hoeveelheid benzeen.

Chlorofyl lost op in benzeen; xanthofyl niet, deze blijft in de ethanol.

Goed schudden en daarna de fracties scheiden en overbrengen in de cuvetten. (Benzeen heeft een hogere soortelijke massa dan ethanol, zodat de

chlorofylfractie zich onderin bevindt.)

 vul nu de drie cuvetten als volgt: één met ethanol en bladkleurstof; één met benzeen en chlorofyl en één met ethanol en xanthofyl.

 eventueel de fracties wat in laten dampen om hogere concentraties kleurstoffen te krijgen.

b. Het absorptiespectrum (zie figuur 20).

 beeld met behulp van een positieve lens (L1) de gloeidraad van een brandende (heldere) gloeilamp (LA) scherp af op een scherm (SS), waarin zich een spleet bevindt en plaats dit scherm vervolgens zodanig dat het beeld van de gloeidraad scherp op de spleet komt.

Opmerking:

Als de spleet te smal is laat deze voor het vervolg van de proef te weinig licht door; als de spleet te breed is resulteert dit in mengkleuren en krijgt men geen spectrum.

Figuur 20. Proefopstelling voor het bepalen van het absorptiespectrum van chlorofyl.

 maak met behulp van een tweede positieve lens (L2) van de verlichte spleet in SS een scherp beeld op een scherm S.

 plaats nu een prisma (P) in de stralengang tussen L2 en S. Stel het prisma in op de minimum-deviatie.

Opmerking:

In plaats van een prisma kan men ook gebruik maken van een prismatisch cuvet gevuld met zwavelkoolstof (CS2).

Opmerking:

Het is gewenst een rechtziend prisma te gebruiken. Het scherm behoeft dan niet verplaatst te worden en het spectrum is nu breed.

 plaats nu in de lichtbundel tussen L2 en P achtereenvolgens het cuvet met bladkleurstoffen, het cuvet met chlorofyl en het cuvet met xanthofyl. Vragen en opdrachten:

1. Hoe ziet het spectrum er uit met en zonder bladkleurstoffen? 2. Welk pigment absorbeert welke lichtsoort?

3. Geef uw waarnemingen met behulp van kleurpotlood in onderstaande rechthoek weer.

4. Vergelijk uw waarnemingen met figuur 18.

c. Fluorescentie

- plaats het cuvet met bladkleurstof in ethanol in een sterke lichtbundel van bijvoorbeeld een diaprojector.

- verduister het lokaal.

- kijk loodrecht op de lichtbundel in het cuvet.

- herhaal dit experiment met het cuvet met chlorofyl in benzeen. Vragen:

5. Welke golflengte wordt door de bladkleurstof geabsorbeerd? 6. Welke golflengte wordt door het chlorofyl geabsorbeerd? 7. Tracht verschillen te verklaren.

8. Wat doet het chlorofyl met het geabsorbeerde licht?