UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2013-2014
INCOGNITO SPREIDING VAN HET EQUINE HERPESVIRUS IN MUCOSALE MONOCYTAIRE
CELLEN VAN DE GASTHEER
door
Shana DUJARDIN
Promotoren: Prof. dr. Nauwynck H.
Laval K.
Literatuurstudie in het kader van de Masterproef
© 2014 Shana Dujardin
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2013-2014
INCOGNITO SPREIDING VAN HET EQUINE HERPESVIRUS IN MUCOSALE MONOCYTAIRE
CELLEN VAN DE GASTHEER
door
Shana DUJARDIN
Promotoren: Prof. dr. Nauwynck H.
Laval K.
Literatuurstudie in het kader van de Masterproef
© 2014 Shana Dujardin
VOORWOORD
In dit woord vooraf wil ik graag enkele mensen bedanken die me geholpen, gemotiveerd en geïnspireerd hebben bij het schrijven van deze literatuurstudie. Allereerst richt ik een woord van dank aan mijn promotor, professor doctor Hans Nauwynck voor het nalezen en verbeteren van mijn thesis.
Alsook voor de begeleiding en ruimdenkendheid bij de opbouw en verdere uitwerking van het werk.
Ook wil ik mijn medepromotor Kathlyn Laval hartelijk bedanken voor alle tijd die ze heeft vrijgemaakt om mij de wondere wereld van het EHV1 uit te leggen en haar visie hierover met mij te delen, evenals voor het aanreiken van gepaste literatuur en voor alle hulp en tips die ik van haar heb gekregen.
Hossein Bannazadeh Baghia wil ik bedanken voor de nuttige uitleg die ik heb gekregen over zijn onderzoek. Mijn lieve kotgenoten Sofie, Ylva en Femke bedank ik voor al hun hulp, emotionele bijstand en solidariteit. Graag wil ik mijn vriend Thomas bedanken voor het grondig nalezen van mijn thesis. Ten slotte wil ik mijn ouders en zus bedanken voor de onvoorwaardelijke steun tijdens het schrijven van deze literatuurstudie, maar vooral gedurende de hele studie diergeneeskunde.
INHOUDSTABEL
SAMENVATTING ... 1
INLEIDING ... 2
1 Equine Herpesvirus 1 ... 3
1.1 Historiek ... 3
1.2 Classificatie ... 3
1.3 Virion ... 4
1.4 Replicatiecyclus ... 6
1.5 Pathogenese en symptomen ... 8
1.5.1 Primaire replicatie ... 8
1.5.2 Celgeassocieerde viremie ... 9
1.5.3 Secundaire replicatie ... 10
1.5.4 Latentie ... 12
2 Belang van leukocyten bij EHV1 infectie ... 13
2.1 Target cel EHV1: CD172a+ ... 13
2.2 Het belang van adhesiemoleculen bij een EHV1-abortus ... 16
3 Immuniteit ... 17
3.1 Immuunrespons bij primaire EHV1 infectie ... 17
3.1.1 Humorale immuniteit ... 17
3.1.2 Cellulaire immuniteit ... 17
3.1.3 Cytokine immuunrespons ... 17
3.2 Immuunrespons bij secundaire EHV1 infectie ... 18
3.2.1 Humorale immuniteit ... 18
3.2.2 Cellulaire immuniteit ... 18
4 Immuno-evasie ... 18
4.1 Evasie humorale immuniteit ... 19
4.2 Evasie cellulaire immuniteit ... 20
4.3 Interferentie met cytokine en chemokine responsen ... 20
5 Vaccinatie/antivirale therapie ... 21
5.1 Vaccinatie ... 21
5.2 Antivirale therapie ... 23
BESPREKING ... 24
REFERENTIES... 25
Overzichtslijst afkortingen:
EHV1 equine herpes virus type 1
EHV4 equine herpes virus type 4
kbp kilobaseparen
ORFs open reading frames
C3 complement factor 3
vCKBP viral chemokine binding protein
IL interleukine
MIP1α macrophage inflammatory protein 1α
CCL3 CC chemokine ligand 3
HSV herpes simplex virus
TNF tumor necrosis factor
MHC I Major Histocompatibility Complex Class I PBMCs perifere bloed mononucleaire cellen
ER endoplasmatisch reticulum
SuHV1 suid herpesvirus type 1
BoHV1 boviene herpesvirus type 1
DCs dendritische cellen
CD cluster of differentiation
MHC II Major Histocompatibility Complex Class II
GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
eCG equine chorion gonadotrofine
LPS lipopolysaccharide
VN virus neutraliserende
CF complement fixerende
CTLs cytotoxische T-cellen
NK natural killer
TAP transporter associated with antigen processing
Equine herpesvirus type 1, lid van de Alphaherpesvirinae, is een belangrijk endemisch pathogeen bij paarden. Het is verantwoordelijk voor respiratoire aandoeningen, abortus, neonatale ziekte en neurologische stoornissen. Wereldwijd veroorzaken EHV1 infecties aanzienlijke verliezen in de paardenindustrie. Huidige vaccins induceren een virus-specifieke immuunrespons, doch bieden ze geen 100% bescherming. Zowel geïnactiveerde als levend geattenueerde vaccins reduceren respiratoire symptomen, maar slagen er niet in om een celgeassocieerde viremie en ernstige symptomen te voorkomen. Het EHV1 kan zich dus doorheen het lichaam verspreiden, ondanks de aanwezigheid van virus-neutraliserende antistoffen (van der Meulen, 2003). Dit fenomeen geeft duidelijk aan dat het EHV1 immuno-evasieve strategieën gebruikt om te ontsnappen aan het immuunsysteem. Voorgaande studies demonstreerden dat na replicatie ter hoogte van de bovenste ademhalingswegen, EHV1 individuele cellen gebruikt om de basale membraan te penetreren. Deze doelwitcellen zijn voornamelijk T-lymfocyten (CD3+) en monocytaire cellen (CD172a+) (Vandekerckhove, 2011; Gryspeerdt, 2011). Tegelijkertijd kan een celgeassocieerde viremie gedetecteerd worden, waarbij EHV1 gevonden wordt in zowel CD3+ als CD172a+ cellen (van der Meulen, 2003). Uiteindelijk werd aangetoond dat EHV1 interfereert met antistof-afhankelijke celdestructie door middel van verstoorde expressie van virale glycoproteïnen aan het celoppervlak (van der Meulen, 2006). Dit zou te wijten kunnen zijn aan een gerestricteerde replicatiecyclus in de doelcellen. Verscheidene studies suggereren dat monocytaire cellen, de voornaamste doelwitcellen van EHV1, in staat zijn om het immuunsysteem te omzeilen en fungeren als virusdragende cellen om het virus te transporteren naar de doelorganen. Het is dus essentieel om de volledige pathogenese van EHV1, de interactie met het gastheer-immuunsysteem en de interactie met de monocytaire cellen volledig te begrijpen, teneinde efficiënte vaccins en controlestrategieën te ontwikkelen.
Key words: CD172a
+- EHV1 – Equine herpes virus - immuno-evasie - rhinopneumonie
INLEIDING
Equine herpesvirus type 1 is een belangrijk, endemisch pathogeen bij paarden. Het veroorzaakt ademhalingsstoornissen, abortus, neonatale sterfte en zenuwstoornissen. Hedendaagse vaccinatiestrategiëen reduceren de respiratoire symptomen en virusuitscheiding, maar leveren geen 100% bescherming tegen cel-geassocieerde viremie en spreiding naar de targetorganen. Het EHV1 maakt gebruik van immuno-evasieve strategieën om aan de immuniteit van de gastheer te kunnen ontsnappen (van der Meulen., 2003; Gryspeerdt., 2011). Na replicatie ter hoogte van het ademhalingsstelsel, zal het T-lymfocyten en monocytaire cellen infecteren. In deze cellen zal EHV1 de basale membraan penetreren en een celgeassocieerde viremie veroorzaken. Ondanks de aanwezigheid van hoge titers virus-specifieke antistoffen in het serum slaagt het EHV1 erin om, verborgen in de dragercellen, te spreiden naar het endotheel van zijn targetorganen (van der Meulen, 2003). Het EHV1 kan dus ernstige klinische symptomen veroorzaken bij reeds geïmmuniseerde paarden. In deze literatuurstudie zullen de belangrijkste factoren aangehaald en uitgediept worden welke van belang zijn om een nieuwe generatie effectief werkzame vaccins te kunnen ontwikkelen tegen EHV1. Zo moet men de volledige pathogenese en de immuno-evasieve strategieën van EHV1 achterhalen. Alsook de identificatie van de dragercellen en het interactiemechanisme van EHV1 met deze cellen is van groot belang. Ten slotte moet men begrijpen hoe het EHV1 spreidt naar en interageert met de endotheelcellen van zijn doelwitorganen.
LITERATUURSTUDIE
1 Equine Herpesvirus 1
1.1 Historiek
Het equine herpesvirus werd voor het eerst beschreven als oorzaak van abortus in 1933, in Kentucky (Dimock en Edwards, 1933). Een eerste isolatie en identificatie van EHV1 uit gevallen van abortus en zenuwstoornissen geschiedde in 1966, in Noorwegen (Saxegaard, 1966). Aanvankelijk werden EHV1 en EHV4 beschouwd als twee subtypes van één virus. In 1981 ontdekte men echter dat het om twee verschillende virussen ging die sterke genetische gelijkenis vertonen (Roizman et al.,1992). De twee virussen verschillen qua pathogeniteit: EHV4-infectie blijft meestal beperkt tot de bovenste luchtwegen, terwijl EHV1 een systemische infectie veroorzaakt en verscheidene ziektebeelden teweeg kan brengen. Deze variëren van milde ademhalingsstoornissen tot abortus en zenuwstoornissen (Patel en Heldens, 2005).
1.2 Classificatie
EHV1 behoort tot de orde van de Herpesvirales, familie van de Herpesviridae, subfamilie van de Alphaherpesvirinae, genus Varicellovirus (Davison, 2010).
Herpesvirussen beschikken over vier gemeenschappelijke en significante eigenschappen: (i) ze bezitten allemaal een groot aantal enzymen betrokken bij DNA-replicatie, (ii) in de celkern gebeurt de synthese van viraal DNA en het kapsied, (iii) een productieve infectie leidt steeds tot destructie van de gastheercel en (iv) herpesvirussen zijn in staat om latente infecties te veroorzaken in hun natuurlijke gastheer. Alle leden van de familie Herpesviridae hebben zich, omwille van een langdurige co-evolutie met hun gastheer, omgevormd tot succesvolle parasieten. Tevens kunnen herpesviridae bij de meeste diersoorten geïsoleerd worden. Leden van de subfamilie alphaherpesvirinae worden beschreven aan de hand van enkele typische kenmerken: ze vertonen een variabele gastheerspreiding, hebben een relatief korte reproductiecyclus, spreiden snel in een celcultuur, vernietigen efficiënt de geïnfecteerde cel en hebben het vermogen om latente infecties teweeg te brengen. Dit laatste gebeurt hoofdzakelijk, maar niet uitsluitend ter hoogte van de sensorische ganglia. Het fenomeen wordt namelijk ook beschreven in immuuncellen (Roizman en Pellett, 2001).
1.3 Virion
De morfologische opbouw van alle herpesvirussen is gelijkaardig. Het genoom bestaat uit lineair dubbelstrengig DNA en is omgeven door een eicosahedrale eiwitmantel: het kapsied. Beiden vormen samen het nucleokapsied, dat ingebed wordt door een eiwitachtige matrix: het tegument. Deze is op zijn beurt ingebed in een glycoproteïne-bevattende lipide-enveloppe (Davison, 2010).
Genoom
De volledige nucleotidesequentie van EHV1 is gekend. Het lineair dubbelstrengig DNA bestaat uit 150 kbp, welke coderen voor 76 unieke genen. Het genoom bevat namelijk 80 ORFs, waarvan er vier gedupliceerd zijn (Telford et al., 1998). De meeste genproducten kunnen onderverdeeld worden in één van volgende vier categorieën: (1) structurele eiwitten, (2) transmembranaire glycoproteïnen, (3) transactivators en transcriptie-regulatorische proteïnen en (4) virale proteïnen noodzakelijk voor DNA- replicatie, verpakking, morfogenese van het virus en vrijkomen van nieuwe viruspartikels (McGeoch et al., 1993). Equine alfaherpesvirussen beschikken over vijf genen waarvan geen structurele homologen voorkomen bij andere herpesvirussen. Genproducten van deze genen zouden hen in staat gesteld hebben om zich te adapteren aan hun natuurlijke gastheer. Aan de hand van genoomvergelijking stelde men vast dat er relatief weinig genetische verscheidenheid bestaat tussen verschillende isolaten van het virus (Allen et al., 1983; Kirisawa et al., 1993; Galosi et al., 1998). Wat virulentie en klinische symptomen betreft, onderscheidt men echter wel een relatief grote variatie tussen de verschillende isolaten (Patel et al., 1982). De genetische basis hieromtrent is nog niet gekend (Allen et al, 2004).
Kapsied
Het genoom wordt omgeven en beschermd door een eicosahedrale eiwitmantel, bestaande uit 162 kapsomeren. Genoom en kapsied vormen samen het nucleokapsied.
Tegument
Het nucleokapsied is omringd door een eiwitachtige matrix. Deze vult de ruimte tussen het nucleokapsied en de enveloppe.
Figuur 1. Structuur van een EHV1 virion: (a) schematische voorstelling (b) TEM beeld (Uit Vandekerckhove, 2011).
Enveloppe
De buitenste laag van het virion bestaat uit een dubbele fosfolipidenlaag, afkomstig van de celmembraan van een gastheercel (Shukla en Spear, 2001). In de enveloppe zitten verscheidene glycoproteïnen ingebed. Deze zijn van belang bij aanhechting, penetratie en celgemedieerde spreiding van het virus. Ze functioneren eveneens als antigenen die de immuunrespons van de gastheer induceren. Tot op heden zijn er voor EHV1 12 verschillende glycoproteïnen gekend (Telford et al., 1992). Glycoproteïne B is een essentieel glycoproteïne dat betrokken is bij de penetratie van het virus in de gastheercel, middels een binding aan het cellulaire heparaansulfaat. Net als de gB- homologen van andere herpesvirussen is het ook van belang bij celgemedieerde virus-spreiding (Wellington et al., 1996). Hoewel men het glycoproteïne als essentieel beschouwt, is gebleken dat gB- deletie mutanten van EHV1 nog steeds een restinfectiviteit behouden. Hierdoor is er nog enige onduidelijkheid omtrent de absolute behoefte aan gB in het spreidingsproces (Neubauer et al., 1997).
Glycoproteïne D is het tweede essentiële glycoproteïne van EHV1. Het speelt een belangrijke rol in de penetratie van het virus in de gastheercel, het glycoproteïne zal hiertoe binden met een ‘entry receptor’
aanwezig op de gastheercel. Analoog aan andere alfaherpesvirus gD-homologen, is het van belang bij de celgemedieerde spreiding van het virus (Turner et al., 1998). Glycoproteïne C is een niet-essentieel glycoproteïne dat van belang is bij de initiële binding aan de gastheercel, met name door interactie met het cellulaire heparaansulfaat. Het speelt een immuno-evasieve rol vermits het funcioneert als receptor voor C3. Binding met C3 verhindert activatie van de complement-cascade reactie en voorkomt aldus een complement-gemedieerde cellyse van de geïnfecteerde cel (Huemer et al., 1995;
Favoreel et al, 2003; van de Meulen et al., 2006b). Glycoproteïne G is een immunomodulerend proteïne. Het fungeert als vCKBP, een chemokine-bindend proteïne (Van de Walle et al., 2008b). Het gG bestaat in drie verschillende isovormen, twee ervan zijn membraangebonden, een derde is een gesecreteerde vorm. Zowel de membraangebonden als de gesecreteerde vormen kunnen een hele reeks aan chemokines binden. Het glycoproteïne kan binden met IL-8 en zo de migratie van equine neutrofielen verhinderen. Voorts interfereert het met het pro-inflammatoire chemokine MIP1α, ook gekend als CCL3, waardoor de chemotactische functie van dit chemokine belet wordt. Glycoproteïne G moduleert aldus de virusreplicatie en ontstekingsreactie door binding van chemokines (Osterrieder en Van de Walle, 2010; Van de Walle et al., 2008b). Expressie van glycoproteïne N is vereist voor een goede vorming en transport van gM in de geïnfecteerde cel (Rudolph et al., 2002). Glycoproteïne M is op zijn beurt betrokken bij zowel de celpenetratie als de celgemedieerde spreiding van het virus (Osterrieder et al., 1996). Glycoproteïnen E en I vormen waarschijnlijk belangrijke virulentiefactoren van het virus. Ze zijn relevant bij de celgemedieerde spreiding en bepalen dus de plaquegrootte (Flowers en O’Callaghan, 1992). Dit laatste geldt ook voor glycoproteïne K. Dit proteïne is betrokken bij de celpenetratie van het virus en is mede verantwoordelijk voor de vorming van syncytia later tijdens de infectiecyclus. Bovendien is het noodzakelijk voor secundaire omhulling van het virus door een enveloppe en/of uittreden van het virion uit de cel (Neubauer en Osterrieder, 2004).
Glycoproteïnen H en L vormen een stabiel complex. Het gL is verantwoordelijk voor correcte opvouwing en positionering van gH (Hutchinson et al., 1992). Er wordt gesuggereerd dat het complex een rol speelt bij de virus-geïnduceerde celfusie. Het is echter mogelijk dat deze bewering niet geldt
voor alle leden van de herpesfamilie. Alsook het exacte werkingsmechanisme dient nog te worden onderzocht (Hutchinson et al., 1992; Turner et al., 1998). Tenslotte is het glycoproteïne 2 (gp2) een uniek glycoproteïne voor EHV1. Het is niet-essentieel en heeft, in tegenstelling tot bovengenoemde glycoproteïnen, geen analoge sequenties met glycoproteïnen van andere alfaherpesvirussen. De gehele functie van gp2 is nog niet geheel opgehelderd, doch is bewezen dat het een immunomodulerend proteïne is dat een rol speelt bij aanhechting van het virus aan de gastheercel en dat het van belang kan zijn bij de interactie met leukocyten. Glycoproteïne 2 deletiemutanten bleken veel minder virulent te zijn dan het wilde type virus. Dit impliceert dat het proteïne een belangrijke virulentiefactor vormt van het virus (Wellington et al., 1996).
Tabel 1. Functies van glycoproteïnen van EHV1 (Naar Osterrieder en Van de Walle, 2010).
Glycoproteïne Essentieel Functie
gB Ja Penetratie; celgemedieerde spreiding
gD Ja Penetratie; celgemedieerde spreading; endocytose in leukocyten
gC Neen Celbinding; immuno-evasie
gG Neen vCKBP
gN Neen Assemblage gM
gM Neen Penetratie; celgemedieerde spreiding
gE Neen Celgemedieerde spreiding
gI Neen Celgemedieerde spreiding
gK Neen Penetratie; celgemedieerde spreiding; uittreden virus uit cel; syncytiumvorming
gH Onbekend Onbekend
gL Onbekend Vouwing en positionering gH
gp2 Neen Celbinding; immunomodulatie
1.4 Replicatiecyclus
Figuur 2. De cyclus van een productieve HSV replicatie in een cel. Stappen van de reproductiecyclus zijn:
(1) receptorbinding en membraanfusie; (2) release van het virale nucleokapsied en tegument in het cytoplasma van de cel en transport van het nucleokapsied naar de kernporie; (3) release van viraal DNA in de kern; (4) transcriptie en translatie van de virale immediate early (IE) en early (E) genen; (5) virale DNA-synthese; (6) transcriptie en translatie van de virale late (L) genen; (7) assemblage van het kapsied en verpakking van het DNA; en (8) exocytose van nieuwe virions (Uit Taylor et al., 2002).
.
De replicatiecyclus van alle alfaherpesvirussen verloopt gelijkaardig volgens een cascade-systeem.
Uitgaande van gekende data omtrent het prototype van alfaherpesvirussen, namelijk het herpes simplex virus, zal de replicatie van EHV1 besproken worden (Vandekerckhove, 2011).
Binding en internalisatie
De productieve virusinfectie start met binding en internalisatie van het virus in de gastheercel. De initiële binding van het virus aan de gastheercel wordt bewerkstelligd door interactie van glycoproteïnen B en C in de virale enveloppe met het cellulaire heparaansulfaat glycosaminoglycaan (suiker). Deze binding is onstabiel en veroorzaakt een ‘rollen’ van het virus ten opzichte van de celmembraan. Een stabiele binding komt tot stand door interactie van glycoproteïne D met één van zijn zogenaamde ‘entry receptors’: herpesvirus entry mediator, een lid van de TNF-receptor familie;
nectine-1 of nectine-2, leden van de immunoglobuline superfamilie; of specifieke bindingsplaatsen gegenereerd in heparaansulfaat door inwerking van 3-O-sulfotransferase. Recent werd het MHC I erkend als een mogelijke entry receptor voor gD (Kurtz et al., 2010). Binding van gD met één van zijn receptoren activeert het fusioneringsproces tussen de membraan van de gastheercel en de virale enveloppe. Dit proces vereist zowel acties van gB, als van gD en het gH-gL complex (Shukla en Spear, 2001). Het is echter onbekend of het gH-gL complex eenzelfde essentiële rol vervult bij EHV1, zoals dit voor HSV het geval is (Turner et al., 1998). Vervolgens wordt de stabiele eiwitbinding gevolgd door binnentreden van het virus in de cel. Dit kan op twee verschillende manieren gebeuren, afhankelijk van het celtype. In epitheel- en endotheelcellen gebeurt fusie van de membranen en injectie van het nucleokapsied in de gastheercel. In PBMCs zal het virus de cel binnentreden door middel van endocytose, getriggerd door interactie van het RSD-motief in gD met cellulaire integrines. Dit RSD- motief is kenmerkend voor EHV1 en is afwezig in EHV4. Deze bevinding verklaart waarom EHV1 er in slaagt om PBMCs te infecteren, terwijl dit bij EHV4 niet of nauwelijks het geval is (Van de Walle et al., 2008a). Na penetratie van het virus bevindt het nucleokapsied zich in het cytoplasma van de gastheercel, het bindt aan microtubuli en wordt richting celkern getransporteerd met behulp van het microtubuli geassocieerde motorproteïne dyneine. Het cellulaire kinase Rho-associated coiled kinase speelt hierbij ook een belangrijke rol (Frampton et al., 2010). Het nucleokapsied zet zijn virale DNA vrij in de celkern via kernporiën, waardoor een leeg kapsied achterblijft in het cytoplasma (Roizman en Pellett, 2001).
Replicatie
De transcriptie van het herpesvirus genoom verloopt via een strikt gereguleerd cascade-systeem:
eerst worden immediate-early (IE), dan early (E) en tenslotte late (L) genen afgelezen. Replicatie en transcriptie verlopen beiden in de celkern. Vervolgens wordt het gevormde messenger-RNA naar het cytoplasma getransporteerd, waar translatie tot proteïnen plaatsvindt. Het eerste gen dat tot expressie gebracht wordt is het immediate-early gen IR1. Het codeert voor meerdere IE polypeptiden, waaronder het major IE polypeptide (IE1), een regulatorisch proteïne dat de expressie moduleert van zowel vroege als late genen in de celkern en tevens zijn eigen promotor onderdrukt (Smith et al., 1992). De zogenaamde vroege genen coderen voor eiwitten die van belang zijn bij DNA-replicatie,
zoals het DNA polymerase en thymidine kinase. Vervolgens zullen deze virale proteïnen de DNA- replicatie promoten en de expressie van late genen stimuleren, welke coderen voor structurele virale proteïnen zoals kapsied-eiwitten, tegument-eiwitten en enveloppe glycoproteïnen (Vandekerckhove, 2011).
Assemblage en exocytose virion
De nieuwgevormde kapsiedproteïnen migreren naar de celkern, waar de assemblage van het kapsied en incorporatie van het virale DNA plaatsgrijpt. Het ontstane nucleokapsied zal vervolgens de celkern verlaten. Door middel van primaire budding doorheen de binnenste nucleaire membraan naar de perinucleaire ruimte, verkrijgt het nucleokapsied een primaire enveloppe. Deze gaat weer verloren na fusie met de buitenste nucleaire membraan. Het nucleokapsied komt in het cytoplasma terecht en ontvangt zijn secundaire en definitieve enveloppe ter hoogte van het Golgi-apparaat. Ondertussen worden de enveloppeproteïnen reeds co-translationeel getransporteerd naar het ER en vervolgens geïncorporeerd in verschillende membraanstructuren van de gastheercel, onder andere het Golgi- apparaat en de plasmamembraan. Tenslotte zal het nieuwgevormde virion de cel verlaten via vesiculair-gemedieerde exocytose (Mettenleiter, 2002).
1.5 Pathogenese en symptomen
1.5.1 Primaire replicatie
Het EHV1 is weinig resistent in de buitenwereld en relatief warmtegevoelig. Bovendien raakt het gemakkelijk geïnactiveerd door detergenten en de meeste desinfectantia. In gedroogde toestand zou het virus echter enkele dagen kunnen overleven in de omgeving (Allen et al., 2004). Infectie met EHV1 gebeurt voornamelijk door direct contact met infectieuze weefsels/secreten of door inhalatie van Figuur 3. Aangepast schematisch overzicht van de pathogenese van EHV1. 1) Aanhechting/penetratie van virus in epitheelcellen van de bovenste ademhalingswegen; 2) virusreplicatie in epitheelcellen door middel van plaquevorming; 3) virusspreiding doorheen de basale membraan door individueel geïnfecteerde leukocyten; 4) spreiding van geïnfecteerde leukocyten naar vasculaire endotheelcellen (4a) en drainerende lymfeknopen (4b); 5) leukocytgeassocieerde viremie in CD172a+ cellen; 6) virusoverdracht van geïnfecteerde leukocyten naar endotheliale cellen van targetorganen; 7) replicatie en spreiding van virus in targetorganen. Volle pijl: mechanisme gekend; gestippelde pijl: mechanisme onbekend (Uit Gryspeerdt, 2011).
aërosolen. Dieren die zelf een acute of reactiverende infectie doormaken kunnen virus excreteren via nasale sekreten en deze overbrengen naar andere paarden (Lunn et al., 2009). Afhankelijk van de gastheer, zal de uitscheidingsduur van EHV1 variëren. Paarden die voor het eerst geïnfecteerd raken, kunnen tot ongeveer 15 dagen na infectie virus uitscheiden (Gibson et al., 1992). Bijgevolg zullen pasgespeende veulens een belangrijke spreidingsbron vormen van EHV1 (Lunn et al., 2009). Bij paarden die alreeds een primaire infectie doormaakten zal de uitscheidingsduur maar enkele dagen aanhouden en zal de hoeveelheid virusexcretie gereduceerd zijn (Burrows en Goodridge, 1975). Een alternatieve mogelijkheid voor infectie met het EHV1 is door middel van contact met een geaborteerde foetus of placenta (Lunn et al., 2009).
Virusreplicatie start ter hoogte van het epitheel van de bovenste luchtwegen, met aantasting van nasofarynx, trachea en bronchi. Alsook het conjunctivaal epitheel kan geïnfecteerd raken (Allen et al., 2004). EHV1 spreidt zich plaquegewijs doorheen het epitheel, dit gebeurt op een louter laterale manier en niet in de diepte. De virusplaques zullen aldus de basale membraan niet penetreren. Dit is in tegenstelling tot andere nauwverwante alfaherpesvirussen, zoals SuHV1, HSV1 en BoHV1, die wel plaquegewijs spreiden in de diepte en de basale membraan op een agressieve manier doorboren door middel van proteasen (Glorieux et al., 2009, 2011; Steukers et al., 2012). EHV1 veroorzaakt multipele erosies in de nasofaryngeale mucosae vanaf 24 uur na infectie, deze resulteren in rhinopharyngitis en tracheobronchitis. De incubatieperiode voor het optreden van respiratoire symptomen bedraagt ongeveer twee dagen, maar kan verlengd zijn tot tien dagen (Allen en Bryans, 1986; Gibson et al., 1992; Harless en Pusterla, 2006). Initieel is de neusvloei sereus, maar deze kan al snel evolueren tot mucoïde en vervolgens mucopurulente neusvloei op dag vijf tot zeven na infectie, meestal ten gevolge van een secundaire bacteriële infectie. Conjunctivitis en sereuze ooguitvloei behoren mogelijks tot het symptomenbeeld. Lymfadenopathie van hoofdzakelijk de submandibulaire en eventueel de retrofaryngeale lymfeknopen komt voor, deze zetten op en kunnen daarom palpabel zijn (Allen et al., 2004). Jonge immunologisch naïeve paarden vertonen duidelijke respiratoire stoornissen, welke klinisch ernstig en van aanzienlijke duur zijn. Ze ontwikkelen koorts en hebben gezwollen drainerende lymfeknopen. Bij oudere paarden daarentegen, kan de respiratoire infectie mild tot subklinisch verlopen (Gibson et al., 1992; Coggins, 1979).
1.5.2 Celgeassocieerde viremie
Vanaf één dag na infectie treft men nabij de virus-geïnduceerde plaques individueel geïnfecteerde cellen aan onder de basale membraan (Vandekerckhove, 2011). Een in vitro onderzoek aan de hand van equine nasale mucosa-explanten, evenals een in vivo studie identificeerden deze cellen voornamelijk als CD3+ T-lymfocyten en CD172a+ monocytaire cellen (Gryspeerdt, 2011;
Vandekerckhove, 2011). Derhalve penetreert EHV1 de basale membraan via deze individueel geïnfecteerde immuuncellen afkomstig uit het respiratoir epitheel. De geïnfecteerde cellen spreiden door het bindweefsel, de lamina propria en de drainerende lymfeknopen. Vervolgens bereikt het EHV1 de bloedbaan, wat resulteert in een celgeassocieerde viremie die 9 tot 23 dagen kan aanhouden (Vandekerckhove, 2011). van der Meulen et al (2000) demonstreerden aan de hand van een in vitro studie met geïsoleerde equine PBMCs dat de monocytaire cellen (CD172a+) hierbij de belangrijkste
celfractie vormen. Verder werd aangetoond dat mitogeenstimulatie het aantal geïnfecteerde T- lymfocyten (CD3+) aanzienlijk doet stijgen. Mitogeenstimulatie activeert de celproliferatie en induceert clustervorming, waardoor celgeassocieerde virusspreiding begunstigd wordt (van der Meulen et al., 2002). In vitro studies toonden aan dat de EHV1-geïnfecteerde PBMCs geen expressie vertonen van virale glycoproteïnen op hun celoppervlak. Door deze immuno-evasieve strategie voorkomt het EHV1 antistof-gemedieerde cellyse van geïnfecteerde cellen. Bijgevolg kan het virus ongehinderd spreiden in de gastheer en bereikt het zijn target-organen (van der Meulen et al., 2003).
Uit zowel in vivo als in vitro onderzoek is gebleken dat de mutatie die neurovirulentie van EHV1 veroorzaakt ook effect uitoefent op de invasieve kinetiek van EHV1. Neurovirulente stammen invaderen sneller doorheen de basale membraan dan de niet-neurovirulente stammen. Deze laatste zijn meer geneigd tot replicatie in epitheelcellen, terwijl neurovirulente stammen beter zijn in het infecteren van immuuncellen. Dit verklaart waarom niet-neurovirulente stammen meer plaques genereren en een tragere spreiding doorheen de basale membraan kennen. Neurovirulente stammen daarentegen genereren minder plaques, maar penetreren al vroeger de basale membraan. Ze infecteren hierbij significant meer immuuncellen, wat resulteert in een hogere graad van viremie (Vandekerckhove et al., 2010).
1.5.3 Secundaire replicatie
De geïnfecteerde leukocyten adhereren aan endotheelcellen door middel van een tot op heden onbekende receptor (Allen et al., 2004). Transfer van het virus vanuit geïnfecteerde leukocyten naar endotheelcellen kan enkel optreden indien beide celtypes geactiveerde adhesiemoleculen tot expressie brengen. Het specifieke weefseltropisme van het virus wordt aldus beperkt tot weefsels die deze adhesiemoleculen tot expressie brengen. Expressie van adhesiemoleculen op het endotheel schijnt enerzijds gereguleerd te worden door hormonale inwerking en anderzijds middels virus- gemedieerde cytokinerelease uit geïnfecteerde cellen nabij het endotheel (Smith et al., 2002).
De drachtige uterus
Het EHV1 wordt aanzien als één van de meest belangrijke infectieuze oorzaken van abortus. Tot 95%
van de EHV1-geïnduceerde abortussen doen zich voor gedurende het laatste trimester van de dracht (Doll, 1952; Allen en Bryans, 1986; van Maanen, 2002). In deze periode suggereert men een toenemende expressie van de adhesiemoleculen op de leukocyten en de endotheelcellen, welke de uterus vatbaarder maken voor infectie (Lunn et al., 2009). Cytokine inwerking en hormonale veranderingen naar het einde van de dracht toe initiëren de expressie van geactiveerde adhesiemoleculen (Smith et al., 2002; Lunn et al., 2009). EHV1 infecteert de endotheelcellen en repliceert erin, dit leidt tot multifocale vasculitis, trombose, necrose van de microcotyledonen, ischemische schade aan het endometrium en eventuele replicatie in foetaal weefsel. Naargelang de omvang van de vasculaire schade doen verschillende situaties zich voor. Een uitgebreide infectie van endotheelcellen in de maternale placenta leidt tot ernstige vasculitis en trombose. De foetus sterft ten gevolge van verstikking en de merrie aborteert van een virus-negatief veulen (Smith et al., 1992; Allen et al., 2004). Ook de release van prostaglandinen, geassocieerd met trombose ter hoogte van het
endometrium zou kunnen bijdragen tot de initiatie van abortus (Allen et al., 2004). Wanneer de endometriale schade beperkt blijft, transmigreert EHV1 focaal doorheen de utero-placentale barrière en repliceert in foetale weefsels. In dit geval is de foetus virus-positief en zal abortus zich voordoen ten gevolge van uitgebreide schade en letsels aan het veulen (Smith et al., 1993; Smith, 1997).
Meestal wordt de placenta samen met de foetus in het amnionmembraan uitgedreven (Allen et al., 2004). Bij het optreden van een late abortus kan men macroscopische laesies waarnemen bij de foetus. Deze omvatten subcutaan oedeem, pleurale vochtaccumulatie, pulmonair oedeem en congestie, een vergrote milt en multifocale hepatische necrose. Foeti die vroeg tijdens de dracht geaborteerd worden, zijn meestal erg geautolyseerd (van Maanen, 2002). EHV1 kan een ware abortusstorm veroorzaken in een groep drachtige merries, meestal gaat het echter om individuele gevallen. Geïnfecteerde merries aborteren plotseling, zonder opvallende voorafgaande symptomen.
Ze vertonen geen duidelijk ziektebeeld en respiratoire stoornissen worden meestal niet waargenomen.
De incubatieperiode van EHV1-geïnduceerde abortus varieert sterk: deze kan variëren van negen dagen tot enkele maanden na infectie of zelfs jaren na infectie bij reactivatie van latent aanwezig virus.
De merries zijn normaal vruchtbaar na de abortus en zullen zelden opnieuw aborteren in de daaropvolgende jaren. Ze kunnen eventueel wel opnieuw geïnfecteerd raken, wat weerom kan leiden tot abortus (Allen et al., 2004). Occasioneel zal het veulen niet geaborteerd, maar normaal ter wereld gebracht worden doordat de infectie optreedt kort nabij de partus. Zulke veulens zijn zeer zwak en ontwikkelen meestal ernstige ademhalingsstoornissen en icterus. Ze sterven doorgaans binnen een week na de partus vanwege uitgebreide virale schade (Allen en Bryans 1996; Murray et al., 1998).
Het zenuwstelsel
Infectie van endotheelcellen door geïnfecteerde monocytaire cellen en de daarmee gepaard gaande vasculitis is eveneens de pathogenese voor het ontstaan van zenuwsymptomen veroorzaakt door EHV1. In tegenstelling tot andere alfaherpesvirussen, zoals HSV, BoHV1 en SuHV1, is het EHV1 geen neurotroop virus. Schade aan het zenuwstelsel wordt aldus niet veroorzaakt door virusreplicatie in de neuronen (Patel et al., 1982; van Maanen, 2002). De zenuwstoornissen worden meestal voorafgegaan door andere symptomen zoals koorts en neusvloei, maar kunnen zich ook voordoen zonder eerdere ziekteverschijnselen (van Maanen, 2002). Replicatie in het endotheel leidt tot ernstige schade aan de microvasculatuur van het centraal zenuwstelsel. Vasculitis, trombose en hemorragieën resulteren in een ischemische degeneratie van hersenen en ruggenmerg (Allen et al., 2004; Lunn et al., 2009). Transfer van het virus naar de endotheelcellen van het centrale zenuwstelsel en ontwikkeling van equine herpesvirus myeloencephalopathy (EHM) is niet zo’n frequent gebeuren.
Tijdens een EHM uitbraak zal slechts 10% van de paarden neurologische symptomen ontwikkelen (Lunn et al., 2009). De incubatieperiode voor het optreden van zenuwverschijnselen betreft zes tot tien dagen (van Maanen, 2002; Allen et al., 2004). De aard en ernst van de stoornissen zijn afhankelijk van de locatie en uitgebreidheid van de neurologische schade. De meest voorkomende klinische symptomen variëren van milde ataxie tot complete paralyse. Bijkomend kunnen oedeem van het scrotum of distale ledematen, staartverlamming, incontinentie en verlies van perineaal gevoel zich voordoen (Goehring en Sloet van Oldruitenborgh-Oosterbaan, 2001; van Maanen, 2002). In 24% van
de gevallen detecteert men cerebrale aandoeningen zoals blindheid, torticollis en ernstige apathie (van der Meulen et al., 2003). De prognose voor paarden met ataxie ten gevolge van EHV1 is gunstig, zij zullen meestal volledig herstellen. Paarden die niet meer recht geraken daarentegen, zullen sterven of geëuthanaseerd moeten worden omwille van ernstige complicaties (Goehring en Sloet van Oldruitenborgh-Oosterbaan, 2001; van Maanen, 2002). Recent werd door Nugent et al. (2006) aangetoond dat de neuropathogeniteit van een stam gekenmerkt wordt door een nucleotide- polymorfisme dat resulteert in een aminozuurvariatie in het EHV1 DNA-polymerase. Bij neuropathogene stammen is asparagine (N) vervangen door asparaginezuur (D) op aminozuurpositie 752. De niet-neuropathogene stammen (N752 DNA pol genotype) komen meer voor in een EHV1 populatie, wat verklaart waarom zenuwsymptomen minder frequent worden aangetroffen in een populatie paarden (Goodmann et al., 2007).
1.5.4 Latentie
Net zoals andere herpesvirussen, veroorzaakt EHV1 een latente infectie bij de gastheer. Het gehele genoom is hierbij aanwezig in de geïnfecteerde cellen, maar er wordt geen infectieus virus gevormd.
Slechts een beperkt deel van het genoom wordt getranscripteerd, wat leidt tot vorming van ‘lattency- associated-transcripts’ (Roizman et al., 1992). Het latent aanwezig EHV1 verbergt zich in neuronen van het ganglion trigeminale (Edington et al., 1994; Slater et al., 1994), de lymfoïde weefsels van het ademhalingsstelsel (Welch et al., 1992; Edington et al., 1994; Slater et al., 1994) en in PBMCs (Welch et al., 1992; Chesters et al., 1997; Smith et al., 1998; Banbura et al., 2000). In het slachthuis kan men latentie aantonen bij 60 tot 80% van een willekeurig geselecteerde groep paarden. Dit wijst erop dat latentie een algemeen voorkomend fenomeen is bij paarden (Edington et al., 1994; Smith et al., 1998).
Latentie speelt een belangrijke rol in de epidemiologie van EHV1, aangezien reactivatie klinische symptomen en virusuitscheiding kan veroorzaken (Lunn et al., 2009; Patel en Heldens, 2005).
A B
C
A. Replicatie in respiratoir epitheel
B. Replicatie in centraal zenuwstelsel
C., D. Replicatie in drachtige uterus
Celgeassocieerde viremie in PBMCs
D
Figuur 4. Pathogenese van een acute EHV-1 infectie en EHV1-gerelateerde symptomen. A: respiratoire stoornissen; B: zenuwstoornissen; C: abortus; D: neonatale sterfte (Naar Laval, 2014, unpublished data; Gryspeerdt, 2011).
2 Belang van leukocyten bij EHV1 infectie 2.1 Target cel EHV1: CD172a+
Sommige pathogenen gebruiken de bovenste ademhalingswegen als intredepoort om de gastheer te invaderen. Hierbij vormt de nasale mucosa een eerste barrière die de micro-organismen moeten overwinnen (Vairo et al., 2013). Omwille van de voortdurende blootstelling aan omgevingsantigenen, gaande van onschuldig tot potentieel schadelijk, staat deze mucosa onder strikte controle van professionele APCs zoals macrofagen en dendritische cellen (Hossein et al., 2014). DCs zijn monocytaire cellen afkomstig uit het beenmerg. Zij maken waarschijnlijk als eerste contact met verscheidene invaderende pathogenen. Bijgevolg spelen ze een belangrijke rol in de pathogenese van virale infecties (Klagge en Schneider-Schaulies, 1999). Immature DCs zijn verspreid in perifere weefsels zoals huid en slijmvliezen. Ze staan in voor het sampelen van de omgeving en opname van pathogenen (Banchereau en Steinman, 1998). Mucosale DCs zijn gespecialiseerd in het induceren van een lokale IgA respons en dus lokale immunologische bescherming (Hossein et al., 2014). In het immature stadium zijn het slechts zwakke stimulatoren van de cellulaire immuniteit (Zhou en Tedder, 1995; Banchereau en Steinman, 1998; Klagge en Schneider-Schaulies, 1999). Na opname van een antigen zullen de cellen matureren: ze mobiliseren en gaan chemokines en cytokines produceren, waaronder IL-12. Gedurende de migratie via de lymfevaten naar de lymfeklieren verliezen ze het vermogen om antigenen op te nemen, maar verwerven ze antigeen-presenterende capaciteit door opregulatie van peptide-MHC II complexen (Pierre et al., 1997), adhesiemoleculen en costimulatoire moleculen zoals CD86 (Mc-lellan et al., 1995). Ook maturatiemerker CD83 wordt opgereguleerd (Mc- lellan et al., 1995; Zhou en Tedder, 1995). In de lymfoïde organen activeren de DCs naïeve T-cellen door presentatie van antigen-MHC-complexen, tezamen met co-stimulerende moleculen (Klagge en Schneider-Schaulies, 1999).
Sommige pathogene micro-organismen, onder andere alfaherpesvirussen, kidnappen mucosale monocytaire cellen ter hoogte van de nasale mucosa om de basale membraan te penetreren.
Bijkomend onderzoek en nieuwe technieken zijn noodzakelijk om de replicatiemechanismen en invasieve methoden van deze virussen ter hoogte van de bovenste luchtwegen beter te begrijpen.
Vanwege de hoge kost en ethische overwegingen van in vivo experimenten, zijn er alreeds verscheidene ex vivo systemen ontwikkeld (Vairo et al., 2013). Glorieux et al. (2007), Vandekerckhove et al. (2009) en Steukers et al. (2011) ontwikkelden ex vivo explanten door respiratoire mucosae te cultiveren op gaasmodellen. Vandekerckhove (2011) collecteerde weefsels van paarden in het slachthuis die representatief zijn voor het gehele bovenste ademhalingsstelsel: het vestibulaire en diepe intranasale deel van het septum, de nasofarynx en de trachea. Mucosa werd uit deze weefsels gesneden met behulp van chirurgische messen en op een fijnmazig gaas aangebracht met de epitheliale zijde bovenaan om vervolgens 96 uur gecultiveerd te worden. Deze in vitro modellen bleken succesvol te zijn om meer inzicht te verkrijgen betreffende de invasiemechanismen van alfaherpesvirussen op niveau van de bovenste luchtwegen en om zo potentiële vaccins en behandelingen tegen alfaherpesvirussen te kunnen ontwikkelen (Steukers et al., 2012;
Vandekerckhove, 2011). Een belangrijk nadeel van deze modellen is dat men hierbij nooit uitsluitend
de epitheliale zijde van de mucosa kan inoculeren. Alle zijden van de explant worden blootgesteld aan het virus en het fenomeen van de epitheliale barrière wordt tenietgedaan. Hierdoor verschillen de vroeg pathogene invasiemechanismen voor sommige virussen ex vivo ten opzichte van de in vivo situatie (Vairo et al., 2013). Om dit probleem op te lossen ontwikkelden Vairo et al. (2013) een nieuw type model dat de in vivo situatie beter nabootst: een explant waarin een gepolariseerde agarose is ingebed zodat de equine nasale en nasofaryngeale mucosae cultiveerbaar zijn in een semi-gesloten systeem. Hierdoor zal uitsluitend de epitheliale zijde van de explant blootgesteld worden bij virusinoculatie. Hoewel gepolariseerde mucosale explanten al meer de werkelijke fysiologische situatie benaderen, zijn ze alleen geschikt voor het bestuderen van de vroege stappen in de pathogenese van virussen. Andere processen zoals de invasie van de bloedbaan kunnen niet worden weergegeven. Derhalve kunnen mucosale explanten niet alle virus-gastheer interacties representeren (Vairo et al., 2013).
Betere kennis van de immuno-biologie van nasale mucosale DC-infecties en van de manier waarop DCs gemanipuleerd worden door virussen, zijn essentieel om effectieve preventiestrategieën tegen deze virussen te kunnen ontwikkelen. Hiertoe zijn in de loop der jaren technieken ontwikkeld om equine DCs te cultiveren en karakteriseren (Hossein et al., 2014). Siedek et al. (1997) waren de eersten die niet-adhererende cellen isoleerden uit perifeer bloed en deze trachtten te verrijken tot DC.
Na enkele dagen waren echter alle cellen dood vanwege de afwezigheid van juiste DC-stimulerende factoren. Later werd aangetoond dat de differentiatie van monocyt tot DC afhankelijk is van GM-CSF en IL-4 (Peters et al., 1996). Mauel et al. (2006) slaagden er uiteindelijk in om monocyten afkomstig uit de bloedbaan te differentiëren tot DCs, door deze bloot te stellen aan recombinant equine IL-4 en recombinant equine GM-CSF. DCs vormen echter geen uniforme celpopulatie, ze vertonen een grote mate aan heterogeniteit (Banchereau en Steinman, 1998; Shortman en Liu, 2002). Subtypes van DCs kunnen geïdentificeerd worden aan de hand van hun lokalisatie, fenotype en immuunfunctie (Romani et al., 2003). De aard van de adaptieve immuunrespons wordt gedetermineerd door het subtype DC, het immunologisch micro-milieu en de activatietoestand van de DC. Vanwege de pivotale rol in de modulatie van de immuunrespons en de grote variëteit aan subtypes van DCs, is het van belang om het juiste subtype te bestuderen en karakteriseren. Aangezien nasale DCs essentieel zijn in de pathogenese van EHV1, moet men deze trachten te isoleren. Aan de hand van een nieuwe techniek zijn Hossein et al. (2014) hier recentelijk in geslaagd. Eerst worden nasale mucosale fragmenten blootgesteld aan collagenase, een enzyme dat eiwitbindingen breekt. Hierna wordt het supernatans gecentrifugeerd en ondergaan de cellen magnetic activating cell sorting. Hierbij zal men een bepaalde celpopulatie labelen met magnetische partikels gecoat met anti-CD172a+ antistoffen. Vervolgens worden de cellen gewassen en kan men de gelabelde cellen selecteren doordat deze aan de wand van een magnetische kolom blijven plakken. Uiteindelijk worden de geïsoleerde CD172a+ cellen gekarakteriseerd op basis van morfologie, fenotype en functie. Hierbij worden DCs, bekomen door stimulatie van monocyten uit bloed met IL-4- en GM-CSF, gebruikt ter vergelijking. Wanneer de CD172a+ cellen een dag gecultiveerd worden, ziet men grote, langwerpige cellen met uitstekende dendrieten. Na 72 uur worden ze rond tot driehoekig en bevatten ze vacuoles en pseudopodia.
Fenotypische karakterisatie gebeurt door merkerexpressie aan het celoppervlak. Zo is de aanwezigheid van CD1c+ beduidend hoger bij CD172a+ cellen uit de nasale mucosa dan bij DCs bekomen uit de bloedbaan. Dit is in overeenstemming met alreeds gekende bevindingen bij de mens, waarbij CD1c positieve DCs zich in de lamina propria en het epitheel van het ademhalingsstelsel bevinden (Jahnsen et al., 2004). Alsook is bekend dat DCs met merker CD1c+ antigenen aanbieden aan CD8+ T-cellen (Jongbloed et al., 2010; Mittag et al., 2011). Saalmuller et al. (2005) toonden aan dat antistoffen tegen humane CD83 en andere merkers ook bruikbaar zijn bij equine DCs. De expressie van CD83 bij equine nasale CD172a+ cellen is iets hoger dan bij immature bloed-afkomstige DCs. Uitgaande van deze vaststelling kan men aannemen dat de CD172a+ cellen een semi-mature celpopulatie vormen. De nasale DCs, zowel CD172a+ als CD172a-, hebben lage gehaltes aan MHC II in vergelijking tot de monocytair bekomen DCs. Dit beaamt opnieuw dat de nasale CD172a+ geen mature celpopulatie is. Van immature DCs is gekend dat ze antigenen opnemen via receptor- gemedieerde endocytose en macropinocytose (Von Garnier et al., 2005). De capaciteit van immature DCs om antigenen op te nemen wordt gemeten aan de hand van de opname van fluorescent gelabelde FITC-OVA peptiden. De antigen-opname door CD172a+ cellen is drie keer zo groot als deze van CD172a- cellen. Verder is de antigenopname door bloed-afkomstige DCs steeds hoger dan deze van nasale mucosale DCs. Het lijkt erop dat de nasale mucosale CD172a+ cellen onder steady-state condities veel antigenen sampelen en internaliseren, doch niet steeds MHC II-peptide complexen tot expressie brengen (Hossein et al., 2014).
Fenotypische en functionele karakterisatie van de cellen wijst erop dat de celpopulatie voornamelijk bestaat uit immature DCs. De nieuwe techniek maakt het mogelijk om de immunobiologie van de nasale DCs te bestuderen en betere notie te krijgen van de interactie tussen virussen en deze belangrijke celpopulatie (Hossein et al., 2014).
Figuur 5. Monocyt-afgeleide DCs en equine nasale mucosale CD172a+ cellen. PBMNs werden geïncubeerd voor twee uur bij 37°C. Na wassen werden de adherende cellen gecultiveerd voor vijf dagen in aanwezigheid van rEq GM-CSF (20 ng/ml) en rEq IL-4 (10 ng/ml). Equine nasale mucosale CD172a+ cellen werden geïsoleerd uit nasale mucosa door digestie, magnetic activating cellsorting en cultivatie voor vijf dagen in afwezigheid van cytokines. Schaal: 20 µm (Uit Hossein et al., 2014).
2.2 Het belang van adhesiemoleculen bij een EHV1-abortus
Adhesiemoleculen spelen een essentiële rol in de pathogenese van het EHV1. Ze zorgen voor adhesie van geïnfecteerde leukocyten aan endometriale endotheelcellen zodat virusoverdracht kan plaatsvinden. Replicatie in endotheelcellen leidt tot vasculaire letsels, eventueel gevolgd door infectie van de foetus. Om de rol van adhesiemoleculen bij infectie van endotheelcellen te kunnen bestuderen, ontwikkelden Smith et al. (2002) een in vitro flow systeem dat de in vivo situatie weerspiegelt. Equine bloedvaten werden postmortem verzameld en blootgesteld aan bepaalde mediatoren. Hierdoor kwamen adhesiemoleculen tot expressie in zowel de halsslagader als in bloedvaten afkomstig van de baarmoeder, eileider en mesenterium. Dit indiceert dat de expressie van adhesiemoleculen een algemene en inherente capaciteit is van endotheelcellen. Nochtans toonde Smith (2000) voordien aan dat de in vivo opregulatie van adhesiemoleculen een karakteristieke eigenschap is die plaatsvindt ter hoogte van het endotheel van het equine voortplantingsstelsel gedurende de dracht. Adhesie van leukocyten en aldus het weefseltropisme is beperkt tot weefsels die de adhesiemoleculen tot expressie brengen. Het in vitro systeem toonde aan dat factoren zoals eCG en 17-β oestradiol de expressie van adhesiemoleculen activeren. In vivo zijn deze stoffen werkzaam ter hoogte van het voortplantingsstelsel, wat dus overeenstemt met het weefseltropisme van EHV1 (Smith et al., 2002).
In tal van andere systemen is het belang van cytokines als mediatoren voor de activatie van adhesiemoleculen op endotheelcellen al eerder bewezen. Onder andere IL-1, TNF-α en het bacteriële endotoxine LPS blijken hiertoe in staat te zijn (Bevilacqua., 1987). Het effect van equine ontstekingsmediatoren kan echter niet getest worden aan de hand van het in vitro flow systeem omwille van een gebrek aan geschikte preparaten. Nochtans is het wel alreeds aangetoond dat het humane recombinant IL-2 de expressie van adhesiemoleculen op equine cellen genereert (Smith et al., 2002).
Figuur 6. Sectie van equine a uterina, 48u na in vitro cultivatie met eCG. Autologe PBMCs werden toegevoegd in het flow-systeem na 24u incubatie met IL-2. Kleuring met monoklonaal anti-EHV1 en FITC anti- muis IgG geeft de viruspositieve (pijl; groen signaal) PBMCs aan die adhereren aan het endotheel. Een massa viruspositieve cellen (A) bij de viruspositieve PBMCs (pijl) indiceren dat aangrenzende cellen besmet zijn geraakt, deze cellen zijn mogelijk cellen van endotheliale oorsprong. x 1200 (Uit Smith et al., 2002).
Figuur 7. Vorming van een celaggregaat in een orgaancultuur van equine a uterina, 72u nadat de PBMCs geactiveerd werden met IL-2 en de endotheelcellen met LPS. De enkelvoudige sectie toont het hoofdgedeelte van de samengeklonterde cellen, gescheiden van de ‘voet’ die verbonden is met de endotheelcellen. Aankleuring met konijnenserum B toont dat de leukocyten in het hoofdgedeelte van het aggregaat (pijlen) adhesiemoleculen tot expressie brengen. Ook de endotheelcellen waarop de leukocyten aanhechten brengen adhesiemoleculen tot expressie (gestippelde pijl). x 1000 (Uit Smith et al., 2002).
3 Immuniteit
3.1 Immuunrespons bij primaire EHV1 infectie
Een EHV1-infectie genereert een systemische immuunrespons in de bloedbaan en een lokale immuunrespons ter hoogte van de primaire vermeerderingsplaats, namelijk de bovenste luchtwegen.
Beiden bestaan ze uit een humorale en een cellulaire component (van der Meulen, 2003).
3.1.1 Humorale immuniteit
Na infectie van virusnaïeve paarden kunnen IgA, IgG en IgM antistoffen aangetoond worden ter hoogte van de respiratoire mucosa. Virus-specifiek IgA vormt hierbij het voornaamste antistof-isotype.
Eén of twee weken na infectie ziet men occasioneel dat virus-specifiek IgG de bovenhand neemt. Dit is vermoedelijk te wijten aan exsudatie van serumantistoffen doorheen het ontstoken ademhalingsepitheel (Breathnach et al., 2001). Ongeveer twee weken na infectie treedt seroconversie op in het bloed. Zowel VN als CF antilichamen kunnen worden aangetoond. IgG en IgM titers nemen hierbij beiden toe. Als eerste stijgen de VN antistoffen (Stokes et al., 1991), deze blijven tot een jaar na infectie aanwezig en zijn grotendeels type-specifiek. Ze zijn voornamelijk gericht tegenover het virale gB en gC (Allen et al., 1992). CF antistoffen blijven slechts drie maanden aantoonbaar en vertonen kruisreactiviteit tussen EHV1 en EHV4 (Crabb en Studdert, 1993).
3.1.2 Cellulaire immuniteit
Een primaire EHV1 infectie induceert proliferatie van lymfocyten. Zowel een antigen-specifieke als een non-specifieke lymfocytaire respons worden uitgelokt (Dutta et al., 1980). CD8+ celpopulaties nemen proportioneel meer toe in het bloed en in de longen dan de CD4+ celpopulaties (Lunn et al., 1991). De CD8+ cellen zijn MHC I-gerestricteerde T-lymfocyten, namelijk CTLs (Allen et al., 1995). CTLs herkennen geen natieve eiwit antigenen. APCs moeten de antigenen eerst verwerken tot korte peptiden en vervolgens presenteren met MHC I moleculen aan de CTLs alvorens deze de antigenen kunnen herkennen (MHC I-gerestricteerde antigen herkenning). Deze MHC I moleculen zijn zeer polymorf: verschillende MHC I haplotypen presenteren andere epitopen (Soboll et al., 2003). Het best gekarakteriseerde en meest polymorfe klasse I gen bij paarden wordt gecodeerd door de ELA-A locus (Antczak, 1992). Aangezien het herkennen van epitopen door CTLs afhankelijk is van het MHC I haplotype, is het mogelijk dat een CTL respons wordt opgewekt bij paarden met een bepaald ELA-A haplotype en niet bij andere paarden met een verschillend ELA-A haplotype. Studies omtrent EHV1- CTL epitopen moeten de ELA-A restrictie van specifieke CTL responsen bepalen. Hierdoor zouden vaccins kunnen worden ontwikkeld die verscheidene epitopen bevatten welke sterke CTL responsen uitlokken en aldus een genetisch diverse populatie paarden kunnen beschermen. Onderzoek heeft uitgewezen dat bij paarden met het ELA-A3 haplotype, het IE genproduct van EHV1 een epitoop bevat dat steeds een CTL-respons induceert en dus zorgt voor afdoding van geïnfecteerde cellen (Soboll et al., 2003).
3.1.3 Cytokine immuunrespons
Gedurende de eerste tien dagen na experimentele infectie detecteert men type I interferonen zoals IFN α en/of β in serum en in nasale secreties (Edington et al., 1989). Alsook het type II interfon γ blijkt
toegenomen te zijn in CD4+ en CD8+ perifere bloed lymfocyten die tien dagen na infectie gecollecteerd worden (Breathnach et al., 2005).
3.2 Immuunrespons bij secundaire EHV1 infectie
De lokale bescherming ter hoogte van de nasale mucosa is van korte duur. Hierdoor kan een secundaire infectie alreeds twee maanden na de eerste optreden. Bij herinfectie is de mate van virusreplicatie ter hoogte van het ademhalingsepitheel echter meer beperkt. Ook de uitscheidingsduur en ernst van de respiratoire symptomen zijn gereduceerd (Gibson et al., 1992). Een uiterst belangrijk aspect in de pathogenese van EHV1 is dat ondanks de aanwezigheid van virus-specifieke antistoffen in het bloed toch nog een viremie kan ontstaan. Bijgevolg kan EHV1 nog steeds abortus en zenuwsymptomen veroorzaken bij virus-immune paarden (Gleeson en Coggins, 1980; Mumford et al., 1987; van der Meulen, 2003). Nasale virusreplicatie en viremie bij immune paarden kunnen ook optreden door reactivatie van latent EHV1 in stressomstandigheden (Burrows en Goodridge, 1984) of ten gevolge van immunosuppressie bij corticosteroïdenbehandeling (Edington et al., 1985).
3.2.1 Humorale immuniteit
Bij een secundaire infectie worden weerom hoge IgA gehaltes aangetoond ter hoogte van het ademhalingsepitheel. Het voorkomen van veel IgG wordt geassocieerd met inflammatie van het epitheel en met respiratoire ziekte. Paarden die na re-infectie geen klinische ademhalingssymptomen vertonen, hebben namelijk nooit hoge IgG waarden (van der Meulen, 2003). In het bloed treedt binnen een week na re-infectie een antistoffenrespons op met zowel VN als CF antistoffen (Edington en Bridges, 1990; van der Meulen, 2003).
3.2.2 Cellulaire immuniteit
Een eerste EHV1-infectie induceert vorming van CTL-memory cellen, waardoor bij re-infectie al snel een verhoging van CTLs wordt gezien ter hoogte van lymfoïde weefsels van het ademhalingsstelsel en in de bloedbaan (Breathnach, 2001). Bij meermaals geïnfecteerde paarden kunnen deze tot een jaar aanwezig blijven (Kydd et al., 2003). Charan et al. (2003) demonstreerden dat ‘activated transforming growth factor β’ uit macrofagen, bronchiaal epitheel, lymfoïde weefsels en bloedplaatjes zorgt voor immunodepressie van zowel de virus-specifieke als non-specifieke lymfocytaire respons.
De lymfocyten slagen er niet in om efficiënt te prolifereren en reageren op de secundaire infectie.
Deze suppressie kan ook mede veroorzaakt worden door virusreplicatie in de lymfocyten waardoor deze cellen geen mitose meer kunnen ondergaan (O’Neill et al., 1999).
4 Immuno-evasie
Net zoals andere herpesvirussen, veroorzaakt EHV1 een levenslange infectie na primaire besmetting.
Herpesvirussen slagen erin om langdurig aanwezig te blijven ondanks activatie van het gastheer immuunsysteem. Alreeds twee maanden na primaire infectie kan herinfectie en virusreplicatie ter hoogte van het ademhalingsstelsel zich opnieuw voordoen. Niettemin zijn de grootte en duur van replicatie meer beperkt dan bij een primaire infectie (Gibson et al., 1992). Cel-geassocieerde viremie kan zich alreeds zes maanden na een primaire infectie opnieuw voordoen (Edington en Bridges,
1990). Overigens is de duur ervan nagenoeg gelijk aan deze bij een primaire infectie. Het aantal circulerende EHV1-geïnfecteerde PBMCs zou echter lager zijn (Van der Meulen, 2003). Belangrijk in de pathogenese van EHV1 bij immune paarden is dat viremie nog steeds kan optreden ondanks de aanwezigheid van virus-specifieke antistoffen (Gleeson en Coggins, 1980; Mumford et al., 1987, van der Meulen, 2003) en EHV1-specifieke CTL precursoren (O’Neill et al., 1999). Globaal spelen drie verschillende immuunmechanismen een cruciale rol bij het herkennen en elimineren van EHV1- geïnfecteerde cellen: de antistofafhankelijke humorale, de MHC I-afhankelijke CTL-gemedieerde en de NK-gemedieerde cellyse. Deze mechanismen worden alle drie gecoördineerd door cytokines, welke fungeren als chemische boodschappers tussen cellen. Gedurende co-evolutie met de gastheer ontwikkelde het EHV1, net zoals andere herpesvirussen, talloze immuno-evasieve strategieën om de gastheerimmuniteit te ontduiken (van der Meulen et al., 2006b). Recent werden al enkele van deze mechanismen opgehelderd die zowel de aangeboren als verworven immuniteit kunnen moduleren (Ma, 2012).
4.1 Evasie humorale immuniteit
De antistof gemedieerde humorale immuniteit speelt een cruciale rol bij zowel de neutralisatie van vrije viruspartikels als bij de opruiming van virus-geïnfecteerde cellen. Antistoffen moeten virale antigenen die geëxpresseerd worden aan het oppervlak van geïnfecteerde cellen herkennen opdat complement- gemedieerde cellyse en T-cel-gemedieerde cytotoxiciteit kunnen doorgaan. Het EHV1 wordt echter niet herkend door virus-specifieke antistoffen. In vitro en in vivo onderzoek hebben aangetoond dat de meerderheid van de EHV1-geïnfecteerde PBMCs geen virale enveloppeproteïnen tot expressie brengt aan hun celoppervlak. Deze cellen zijn bijgevolg ongevoelig aan antistof-gemedieerde opruiming (van der Meulen et al., 2006b; van der Meulen et al., 2003). Uit in vitro immunofluorescentie-studies blijkt dat 70% van de EHV1-geïnfecteerde PBMCs geen virale enveloppeproteïnen exposeert, in vivo studies demonstreren dat het zelfs om 98% PBMCs gaat (van der Meulen et al., 2006b). Een merkwaardige bevinding is dat de enveloppeproteïnen ook intracellulair niet detecteerbaar zijn en dat enkel de IE proteïnen en minstens één E proteïne, namelijk ICP22, in het cytoplasma aantoonbaar zijn.
Dit indiceert dat de individueel geïnfecteerde PBMCs zich in een vroege fase van infectie bevinden (van der Meulen et al., 2006a). Gryspeerdt (2011) toonde aan dat zowel in vitro als in vivo, nagenoeg alle geïnfecteerde epitheliale cellen de late proteïnen gB, gC, gD en gM duidelijk tot expressie brengen, terwijl PBMCs gB en gM in 60 tot 90% en gC en gD slechts in 20% van de gevallen tot expressie brengen. Aldus bepaalt het geïnfecteerde celtype het al dan niet tot expressie komen van late virale proteïnen aan het celoppervlak (Gryspeerdt, 2011). Een minderheid van de PBMCs vertoont nog wel expressie van virale enveloppeproteïnen. Deze zouden selectief uit de bloedbaan verwijderd worden na adhesie ten gevolge van specifieke interactiemechanismen tussen de enveloppeproteïnen op PBMCs en endotheelcellen. Deze PBMCs zouden echter ook opgeruimd kunnen worden door complement-gemedieerde celdestructie (van der Meulen et al., 2006a). Het EHV1 interfereert echter met deze complement-gemedieerde cellyse doordat het gC fungeert als receptor voor C3 en bijgevolg complement-activatie en cellyse verhindert (Huemer et al., 1995; Favoreel et al., 2003; van der Meulen et al., 2006b). Aangezien EHV1-geïnfecteerde PBMCs in staat zijn om het virus te transporteren naar gevoelige cellen door middel van direct contact, vermoedt men dat door dit
celcontact tussen PBMCs en endotheelcellen signalen vrijgesteld worden die de late replicatiefase van EHV1 in PBMCs activeren. Ze triggeren de productie en expressie van enveloppeproteïnen en bijgevolg de transmissie van infectieus virus (van der Meulen et al., 2006a).
4.2 Evasie cellulaire immuniteit
CTL-gemedieerde immuniteit is afhankelijk van efficiënte herkenning van virale peptiden gepresenteerd door het MHC I aan het celoppervlak van APCs. Na infectie van de cel zullen nieuw- geproduceerde virale proteïnen in cellulaire proteasomen verwerkt worden tot korte peptiden en getransloceerd worden naar het lumen van het ER door middel van TAP. In het ER worden de peptiden op het MHC I geladen, ter vorming van een complex. Dit complex wordt vervolgens getransporteerd naar het celoppervlak, waar CTLs het vreemde peptide kunnen herkennen en vervolgens cellyse induceren (York en Rock, 1996). Herpesvirussen vermijden CTL-herkenning en celdestructie door downregulatie van de MHC I-moleculen (Ma et al., 2012). Hiertoe hebben ze verscheidene strategieën ontwikkeld die interfereren met stappen uit de MHC I-antigen productie- en transportpathway (Griffin et al., 2010). Men vermoedt dat een samenspel van virale proteïnen de downregulatie van MHC I reguleert. Alreeds twee genen die voor zulke eiwitten coderen, werden geïdentificeerd bij EHV1. Een eerste gen UL49,5 levert het immunomodulerend proteïne pUL49,5, welke de ATP-binding met TAP blokkeert en dus het transport van proteasoom-gegenereerde peptiden naar het ER inhibeert. Het tweede gen ORF-1 codeert voor pUL56, een gefosforyleerd early type II transmembranair proteïne, voornamelijk gelokaliseerd in Golgi-membranen. Door dit proteïne gebeurt de downregulatie van MHC I al in de vroege fase van infectie. Het pUL56 proteïne is op zichzelf niet functioneel inzake interferentie met MHC I-presentatie en heeft behoefte aan één of meerdere andere, nog niet geïdentificeerde, virale proteïnen om downregulatie van MHC I te verwezenlijken (Ma et al., 2012).
4.3 Interferentie met cytokine en chemokine responsen
Cytokines en chemokines zijn hormoon-achtige stoffen die de ontwikkeling en expressie van een brede waaier aan immuunresponsen reguleren en daardoor een cruciale rol spelen bij de aangeboren en verworven immuniteit (Banyer et al., 2000). Herpesvirussen moduleren de immuniteit door middel van vCKBPs. EHV1 brengt drie isovormen van glycoproteine G tot expressie: een membraangebonden, een kortere membraangebonden en een gesekreteerde vorm. Zowel de membraangebonden als de gesekreteerde vormen van gG zijn in staat om chemokines te binden (Bryant et al., 2003). In vitro studies demonstreerden dat EHV1-gG het IL-8 inhibeert en aldus de migratie van neutrofielen voorkomt. Bovendien heeft in vivo en in vitro onderzoek bij muizen de interferentie van EHV1-gG met MIP1α, beter gekend als CCL3, aangetoond. De binding inhibeert CCL3-geïnduceerde migratie van macrofagen in muizenmodellen (Van de Walle et al., 2007).
Herpesvirussen, inclusief EHV1, hebben vele strategieën ontwikkeld om humorale, cellulaire en NK- celgemedieerde immuniteit te ontduiken. Hierdoor kunnen EHV1-geïnfecteerde cellen niet volledig geëlimineerd worden en is re-infectie alreeds kort na de primaire infectie mogelijk (Ma, 2012).
