Molecular dissection of Cdc6 and the miR-148 family : two stories with common themes

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(1)Molecular dissection of Cdc6 and the miR-148 family : two stories with common themes Duursma, A.M.. Citation Duursma, A. M. (2008, May 14). Molecular dissection of Cdc6 and the miR-148 family : two stories with common themes. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/12848 Version:. Corrected Publisher’s Version. License:. Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden. Downloaded from:. https://hdl.handle.net/1887/12848. Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable)..

(2) Chapter 2. p53-dependent regulation of Cdc6 protein stability controls cellular proliferation

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(9) p53-dependent regulation of Cdc6 protein stability controls cellular proliferation

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(450) Chapter 2. p53-dependent regulation of Cdc6 protein stability controls cellular proliferation Apart from its role in DNA damage responses, p53 regulates cellular proliferation in nonstressed cells as well, since its suppression by RNAi accelerates proliferation of primary human cells (Voorhoeve and Agami, 2003) and MCF-7 cells (data not shown). Therefore, we examined the effect of reduced p53 expression on the cell cycle profile of MCF-7 cells. Also here we observed that suppression of endogenous p53 expression resulted in more proliferating cells (6 % increase in S-. B % of cells. A. phase and 10% decrease in G1, Fig. 6A). This higher fraction of S-phase population could be due to earlier assembly of the preRC in G1. Since Cdc6 is regulated by p53 in the DNA damage response, we examined the level of Cdc6 in proliferating cells with suppressed p53 expression. Interestingly, we found a higher level of Cdc6 protein in pRS-p53kd cell extracts compared to control cells (Fig. 6B). This suggests that Cdc6 is more stable in p53-knockdown cells. To test this directly, we treated MCF-7 cells with CHX and observed that the protein turnover of Cdc6 is slower in the p53kd cells (115 min),. C. 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0. p53kd. Cdc6. Contr p53 kd. p53 G1. S. CDK4. G2/M. D. MCF-7 CHX. 0. 1. 2. 3. 4. hr Control. Cdc6. Control. Control 2. 3. 4. 1. 9 10. 5. 2. 3. 4. 5. Contr. t1/2 Cdc6 70 min. Contr. t1/2 Cdc6 25 min. p53kd t1/2 Cdc6 115 min. p53kd t1/2 Cdc6 70 min. E. Cdc6 kd#1. Cdc6 kd#2. Control. Cdc6 kd#1. Cdc6 kd#2. Control 1. 6. 7. 8. 11. 12 13 14 15 16. F. p53kd. Control. min. p53. p53kd 1. 0 15 30 45 60 75 90 105. CDK4. p53kd. p53. 0 15 30 45 60 75 90 105. Cdc6. p53kd. CDK4. BJ p53kd. BJ Control CHX. 2. 3. 4. 5. 6. Cdc6 p53 CDK4. Figure 6. p53-dependent regulation of Cdc6 protein stability controls cellular proliferation. A Cell cycle analysis of polyclonal control or p53-knockdown MCF-7 cells. BrdU-labeled cells were analyzed by fluorescence activated cell sorting (FACS). The result is the mean of three independent experiments. B Whole cell lysates of control and p53kd MCF-7 cells were immuno-blotted to detect Cdc6, p53 and CDK4 protein. C pRS and pRS-p53kd MCF-7 cells were treated with CHX as described in Fig 2B. WCE were labeled with Cdc6, p53 and control CDK4 antibodies. D Serum starved BJ cells that were released for 13 hours were treated as described in Fig. 2C E The polyclonal pools of pRS and pRS-p53kd cells were electroporated with Cdc6 knockdown constructs (#1 and #2), harvested after 72 hours and immuno-blotted to detect Cdc6, p53 and as loading control CDK4 proteins. F The same experimental setting as in Fig. 5E, but cells were subjected to flow cytometric analysis. The result is the mean of three independent experiments.. 34.

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