ONDERZOEK NAAR HET VOORKOMEN VAN CITRININE EN OCHRATOXINE A IN VOEDINGSMATRICES MET BEHULP VAN LC-MS/MS

ONDERZOEK NAAR HET VOORKOMEN VAN CITRININE EN OCHRATOXINE A IN VOEDINGSMATRICES MET BEHULP VAN LC-MS/MS

Yasemin Bas

Promotor: Prof. Dr. Apr. Sarah De Saeger

Commissarissen: Prof. Dr. Ir. Kris Audenaert en Dr. Gilke De Middeleer

Masterproef in de opleiding Master in de Geneesmiddelenontwikkeling

Academiejaar: 2017 - 2018

ONDERZOEK NAAR HET VOORKOMEN VAN CITRININE EN OCHRATOXINE A IN VOEDINGSMATRICES MET BEHULP VAN LC-MS/MS

Yasemin Bas

Promotor: Prof. Dr. Apr. Sarah De Saeger

Commissarissen: Prof. Dr. Ir. Kris Audenaert en Dr. Gilke De Middeleer

Masterproef in de opleiding Master in de Geneesmiddelenontwikkeling

Academiejaar: 2017 - 2018

Samenvatting

Mycotoxinen zijn secundaire metabolieten geproduceerd door schimmels die verscheidene voedingsmiddelen kunnen contamineren. Ze staan bekend om een subacute en chronische toxiciteit bij mens en dier en vormen hierdoor een gevaar voor de volksgezondheid. In België en Duitsland werd de aanwezigheid van verschillende mycotoxine-biomerkers in urinestalen gemeten. Er werd geconcludeerd dat DON, CIT en OTA met respectievelijk hun metabolieten deoxynivalenol-15-glucuronide, dihydrocitrinone (HO-CIT) en ochratoxine α (OTα) het vaakst aanwezig waren in urine. Hoewel hun concentraties relatief laag waren, was hun frequentie eerder hoog. Gezien de data omtrent de toxiciteit en het voorkomen van CIT in voeding beperkt is en er geen wettelijk limieten bestaan buiten in rode gist rijst supplementen (2000 µg/kg), zal verder onderzoek noodzakelijk zijn opdat er een volwaardige risicoanalyse verwezenlijkt kan worden.

In deze thesis werd de nadruk gelegd op het voorkomen van CIT en OTA in verschillende voedingsmiddelen die te verkrijgen zijn op de Belgische markt. Met behulp van een gevalideerde methode die gebruik maakt van de QuEChERS techniek werden de stalen op een snelle en gemakkelijke manier geanalyseerd. Voor de bepaling van CIT, HO-CIT en OTA in vlees werd een nieuwe methode ontwikkeld en gevalideerd.

Van de bekomen resultaten kon worden afgeleid dat over het algemeen de concentraties CIT in Belgische voedingsproducten redelijk laag lagen, namelijk tussen <LOQ en 1.550 ng/g in voeding, <LOQ tot 4.494 ng/g in kruiden, en zelfs konden oplopen tot 1787ng/g in rode gist rijst supplementen.

CIT werd voornamelijk teruggevonden in boekweitmeel, verwerkte graanproducten op basis van tarwe, rijst en producten op basis van rijst, sinaasappelsap, tijm, nootmuskaat, curry en andere specerijen op basis van curry en rode gist rijst supplementen, waarbij de hoogste gehaltes werden teruggevonden in de laatstgenoemde.

CIT was nagenoeg afwezig in alcoholische dranken, fruit- en groentesappen, soja-producten, olijven en kaas. In verder onderzoek naar het voorkomen van CIT zou dus op de bovenvermelde producten geconcentreerd kunnen worden.

De ontwikkelde methode voor de bepaling van CIT, HO-CIT en OTA in vlees werd gevalideerd, en enkele vleesstalen geanalyseerd (kip: 0.231 ng/g; bloedworst: <LOQ). In de toekomst zouden er meerdere vleesproducten geïncludeerd moeten worden om een juister beeld te krijgen van het voorkomen van CIT in vlees en bijgevolg van de carry-over effecten naar dierlijk eetbaar weefsel.

Dankwoord

Allereerst wil ik mijn dankbaarheid tonen aan mijn promotor, Professor Sarah De Saeger die deze thesis mogelijk heeft gemaakt. Zij en haar team hebben mij veel bijgeleerd over mycotoxinen, LC-MS/MS-toestellen en methodevalidatie.

Ten tweede wil ik graag mijn begeleider Celine Meerpoel bedanken. Zij was de beste begeleider die ik had kunnen hopen. Ze stond altijd klaar om mijn vragen te beantwoorden. Ik vind het jammer dat mijn tijd als haar thesisstudent er op zit, maar het doet mij ook deugd dat ik haar in deze korte periode heb kunnen helpen met haar project.

Ook wil ik Arnau Vidal bedanken. Hij liet mij de schoonheid van chromatogrammen zien; Karl, voor het tot leven wekken van mijn laptop; Huiyan voor haar gezelschap; en Mohammed, voor de handtekening van mijn leescommissaris.

Verder wil ik mijn vrienden, mijn lab- en thesiskameraadjes Orphélie, Jolien, Yentl en Brecht bedanken. Zij maakten mijn lunchpauzes altijd zeer gezellig en amusant.

Ten slotte wil ik mijn ouders bedanken, die mij de kans gaven deze studie aan te vatten en mij eindeloos steunden.

Inhoudsopgave

1. INLEIDING ... 1

1.1 CITRININE ... 3

1.1.1 Geschiedenis ... 3

1.1.2 Fysicochemische eigenschappen ... 4

1.1.3 Voorkomen in voeding ... 5

1.1.3.1 Granen en verwerkte graanproducten ... 5

1.1.3.2 Fruit, fruit- en groentesappen ... 6

1.1.3.3 Noten ... 6

1.1.3.4 Specerijen ... 6

1.1.3.5 Kaas ... 6

1.1.3.6 Olijven ... 6

1.1.3.7 Vleesproducten ... 6

1.1.4 Toxiciteit ... 7

1.1.4.1 Nefrotoxiciteit ... 8

1.1.4.2 Reproductieve toxiciteit ... 8

1.1.4.3 Genotoxiciteit ... 9

1.1.4.4 Additief effect van CIT in combinatie met OTA ... 9

1.1.5 Wetgeving ... 9

1.2 ANALYSEMETHODEN ... 10

1.2.1 QuEChERS-methode ... 10

1.2.2 UPLC-MS/MS ... 10

1.2.3 Standaardadditie en matrix-matched kalibratie ... 12

1.2.4 Isotoop-gelabelde interne standaard ... 13

2. OBJECTIEVEN ... 14

3. MATERIALEN EN METHODEN ... 15

3.1 REAGENTIAENSOLVENTEN ... 15

3.2 STANDAARDEN ... 15

3.3 STAALNAME ... 15

3.4 ONTWIKKELINGENVALIDATIEVANBEPALINGVANCIT,OTAENHO-CITINVLEES ... 15

3.4.1 Staalvoorbereiding ... 15

3.4.2 Methodevalidatie ... 16

3.4.2.1 Kalibratiecurve ... 16

3.4.2.2 Accuraatheid ... 17

3.4.2.3 Precisie... 17

3.4.2.4 LOD ... 18

3.4.2.5 LOQ ... 19

3.4.2.6 Carry-over ... 19

3.4.2.7 Specificiteit ... 19

3.4.2.8 Matrix-effecten ... 19

3.5 BEPALINGVANCITENOTAINVOEDINGSMATRICES ... 19

3.5.1 Staalvoorbereiding ... 19

3.5.1.1 Alle voedingsmatrices met uitzondering van kruiden en supplementen, en vlees ... 19

3.5.1.2 Kruiden en supplementen ... 20

3.6 INSTRUMENTELEANALYSE ... 21

3.7 DATA-EVALUATIE ... 21

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE ... 23

4.1 RESULTATENMETHODEVALIDATIEVANDEBEPALINGVANCIT,OTAENHO-CITINVLEES ... 23

4.1.1 Kalibratiecurve ... 23

4.1.2 Accuraatheid ... 23

4.1.3 Herhaalbaarheid en intermediaire precisie ... 24

4.1.4 LOQ... 25

4.1.5 LOD ... 25

4.2 RESULTATENBEPALINGVANCITENOTAINALLEVOEDINGSMATRICES ... 26

4.3 VERGELIJKINGVANTWEEEXTRACTIEMETHODENVOORDEMATRICES“KRUIDENENSPECERIJEN”EN “SUPPLEMENTEN” ... 32

5. DISCUSSIE ... 34

5.1 METHODEVALIDATIEVOORDEBEPALINGVANCIT,OTAENHO-CITINVLEES ... 34

5.2 BEPALINGVANCIT,HO-CITENOTAINVOEDINGSMATRICES ... 35

5.3 VERGELIJKINGVANTWEEEXTRACTIEMETHODENVOORDEMATRICES“KRUIDENENSPECERIJEN”EN “SUPPLEMENTEN” ... 37

6. CONCLUSIE ... 38 7. LITERATUURLIJST ...40 8. BIJLAGEN ... A DR. BERNARD VRIJENS - THE PHARMACIST IS A KEY STAKEHOLDER IN MEASURING AND MANAGING PATIENTS’

ADHERENCE TO MEDICATIONS. ... 1 PROF. PATRICK COUVREUR - NANOMEDICINE(S): WHERE DO WE COME FROM, WHERE DO WE GO? ... 2 PROF. ALBERT HOFMAN - THE USES OF HIPPOCRATIC EPIDEMIOLOGY ... 3

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

ACN: acetonitril AFB1: aflatoxine B1

AFM1: aflatoxine M1

BEN: Balkan endemic nephropathy CIT: citrinine

CONTAM Panel: Panel on Contaminants in the Food Chain DON: deoxynivalenol

EFSA: European Food Safety Authority G: goodness-of-fit-coëfficiënt HO-CIT: dihydrocitrinone IS: interne standaard LOD: limit of detection LOQ: limit of quantification

MPN: mycotoxin porcine nephropathy MRL: maximum residu level

NOAEL: No-observed-adverse-effect-level OTA: ochratoxine A

OTα: ochratoxine α QC: quality control

RSD: relatieve standaarddeviatie SD: standaarddeviatie

Pagina | 1

1. INLEIDING

Mycotoxinen zijn secundaire metabolieten van schimmels waaraan de mens voornamelijk via voeding wordt blootgesteld. De voornaamste schimmels die deze toxinen produceren behoren tot het geslacht Aspergillus, Penicillium en Fusarium. Elk van deze schimmels komen voor onder verschillende weersomstandigheden en maken ook verschillende mycotoxinen aan. Fusarium species zijn voornamelijk voor of net na de oogst aanwezig en werken vernietigend voor de plant. Penicillium en Aspergillus species daarentegen staan bekend als contaminanten van voeding tijdens het drogen of bij het bewaren (1). De aanwezigheid van schimmels in voeding leidt niet noodzakelijk tot de aanwezigheid van mycotoxinen. Dit wordt sterk beïnvloed door factoren zoals temperatuur, vochtgehalte en het al dan niet gebruiken van bewaarmiddelen. Enkele belangrijke mycotoxinen die bekend staan voor hun toxiciteit voor de mens zijn onder andere aflatoxinen, fumonisinen, zearalenone, deoxynivalenol (DON), en ochratoxine A (OTA).

Aflatoxinen zijn nagenoeg de meest onderzochte mycotoxinen, waarvan aflatoxine B1 (AFB1) het meeste carcinogene is (2). De voornaamste schimmels die deze mycotoxinen produceren zijn Aspergillus flavus en Aspergilllus parasiticus, waarbij de eerstgenoemde voornamelijk voorkomt in rijst, maïs, pindanoten, kruiden en gedroogd fruit (3). De groei van deze schimmels wordt voor de oogst beïnvloed door droogte (4) terwijl het vochtgehalte tijdens de bewaring de bepalende factor is voor de groei na de oogst (5). Wat betreft toxiciteit is geweten dat aflatoxinen hepatotoxisch en carcinogeen zijn, aangezien de reactieve metabolieten kunnen binden met DNA.

Fumonisinen worden door verschillende Fusarium species geproduceerd, en contamineren voornamelijk maïs. Ze worden onder groep 2B (waarschijnlijk carcinogeen) geklasseerd door IARC (6).

Zearalenone is een secundaire metaboliet van Fusarium graminearum. Het mycotoxine heeft het vermogen te binden op oestrogeenreceptoren gezien zijn gelijkende structuur met oestradiol, wat een potentieel gevaar kan vormen voor vrouwen met een hogere kans op borstkanker (7).

DON wordt soms ook wel “vomitoxin” genoemd wegens zijn vermogen misselijkheid te induceren wanneer in hoge dosissen ingenomen (8). De twee voornaamste species die verantwoordelijk zijn voor de productie van DON zijn F. graminearum en F. culmorum. Ze komen vaak voor in granen die bij nat weer snel geïnfecteerd kunnen worden. Hoewel hun concentraties in voeding in de ontwikkelde landen, waaronder België, redelijk laag liggen, zijn ze het meest prevalent en worden vaak teruggevonden in gerst, maïs, rogge en tarwe.

OTA wordt door verschillende Aspergillus species geproduceerd, met als voornaamste producers A. ochraceus en A. carbonarius. Deze species groeien voornamelijk in (sub)tropische gebieden en zijn te vinden in granen, druiven

Pagina | 2 en soortgelijke vruchten. OTA wordt ook door enkele Penicillium species geproduceerd, namelijk P. verrucosum en P. nordicum. Deze hebben een optimale groei in koudere gebieden zoals Noord-Europa en Canada (9). P.

verrucosum komt voornamelijk voor in granen zoals tarwe en maïs, maar werd ook teruggevonden in pindanoten, koolzaad en sojabonen. Deze schimmel kan naast OTA ook citrinine (CIT) produceren. P. nordicum is veelal terug te vinden in vlees, waarbij het vlees op een directe manier gecontamineerd kan zijn of indirect via diervoeder samengesteld uit granen. Ook werd de aanwezigheid van OTA op schimmelkaas meerde malen gerapporteerd.

Dit is een voorbeeld van directe contaminatie. Algemeen komt OTA voor in verscheidene plantaardige voedingsmiddelen zoals granen, verwerkte graanproducten, olijven, bonen, bier, wijn, koffie, rozijnen, vijgen, pompoenzaadjes en thee (10). De concentraties van OTA in plantaardige producten kunnen variëren van 0.1 tot 100 ng/g. Ook komt OTA voor in vele kruiden en specerijen met concentraties tussen 1 en 100 ng/g. Wat betreft dierlijke producten zoals varkensvlees, kip of gedroogde ham, liggen de concentraties veel lager, namelijk tussen 0.1 en 1 ng/g (11). Het is bekend dat OTA de oorzaak is van nefropathie bij varkens en bij kippen (12). Door zijn gelijkenissen met de Balkan endemic nephropathy (BEN) wordt er verondersteld dat OTA ook de oorzaak kan zijn van deze humane ziekte. BEN is een endemische ziekte die voorkomt in Servië, Bulgarije, Roemenië, Bosnië en Herzegovina en Kroatië. Er bestaan verschillende hypotheses rond de mogelijke oorzaken van BEN. Een van die hypotheses is de chronische blootstelling aan OTA via voeding, gezien er werd vastgesteld dat in deze regio’s de voeding in sterke mate gecontamineerd was met OTA in vergelijking met andere Europese landen (13). Hoewel IARC OTA klasseerde als mogelijks carcinogeen voor mensen (groep 2B), wordt verwacht dat hier binnenkort verandering in zal komen. Verschillende recente studies tonen aan dat er sterke evidentie is dat OTA een carcinogeen mycotoxine is. Metabolieten van OTA kunnen immers adducten vormen met DNA ter hoogte van de nier en zo genetische mutaties induceren wat kan leiden tot kanker van de urinewegen.

Het laatste mycotoxine dat besproken wordt is CIT. Dit toxine wordt door verschillende Aspergillus, Penicillium en Monascus species geproduceerd en komt nagenoeg overal voor. Het werd als eerste geïsoleerd uit P. citrinum, dat kan voorkomen in granen, noten en fruit. P. expansum is ook een bekende CIT-producer die naast CIT ook patuline (PAT) kan produceren (14). Deze fungus komt voornamelijk voor in granen en in appels. Als laatste wordt CIT ook geproduceerd door enkele Monascus species, met name Monascus purpureus en Monascus ruber. M.

purpureus (“red yeast”) wordt in Azië intentioneel gebruikt voor de fermentatie van rijst ("Red Yeast Rice") wat op zijn beurt wordt gebruikt als kleurstof voor voedingsmiddelen en als bewaarmiddel voor vlees (15). In 2012 heeft het Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM) van de European Food Safety Authority (EFSA) haar wetenschappelijke opinie inzake de risico’s van CIT, aanwezig in voeding en voeder, voor volks- en diergezondheid gepubliceerd (16). Er werd besloten dat door het gebrek aan toxische data uit dierlijke proeven en kwantitatieve gegevens van het voorkomen van CIT in voeding in Europa geen adequate risico-evaluatie kon

Pagina | 3 gedaan worden en daarom verdere studies hieromtrent noodzakelijk zijn. In deze masterproef zal dieper ingegaan worden op het voorkomen van CIT in verschillende voedingsmatrices, waarbij LC-MS/MS aangewend wordt voor analyse vanwege zijn hoge specificiteit en selectiviteit. Ook zal er een nieuwe methode ontwikkeld en gevalideerd worden voor het bepalen van CIT in vlees.

1.1 CITRININE

1.1.1 Geschiedenis

CIT werd in 1931 voor het eerst door Hetherington en Raistrick geïsoleerd uit Penicillium citrinum dat wereldwijd voorkomt en in alle soorten voeding en voeder aanwezig is (17). De productie van CIT gebeurt optimaal bij temperaturen rond 30 graden Celsius en in licht vochtige omstandigheden. Later werd bevestigd dat CIT ook door andere genera van fungi kan geproduceerd worden. De gekende CIT-producers zijn species van de genera Aspergillus en Penicillium, maar ook Monascus purpureus en M. ruber (15,18). Afhankelijk van de fungus kunnen naast CIT ook andere mycotoxinen geproduceerd worden. Er wordt vaak gerapporteerd dat CIT en OTA gelijktijdig voorkomen in granen zoals tarwe en rijst, en dat appels vaak gecontamineerd zijn met zowel CIT als patuline (14,19,20). CIT is een mycotoxine dat vooral na de oogst wordt gevormd tijdens de bewaring van onder andere granen, maar intussen is aangetoond dat CIT aanwezig kan zijn in verscheidene plantaardige producten en dierlijke producten zoals bijvoorbeeld bonen, fruit- en groentesappen, kruiden en specerijen, kaas en gefermenteerde vleesproducten (10,21).

Daarnaast werd aangetoond dat CIT als bijproduct kan zitten in rode gist rijst en rode gist rijst supplementen van Monascus purpureus, waarbij de eerstgenoemde in vele Aziatische landen gebruikt wordt als voedingskleurstof en als bewaarmiddel (22), terwijl de supplementen als natuurlijk alternatief bestaan voor cholesterolverlagende geneesmiddelen.

In verscheidene studies werd aangetoond dat CIT een antibacteriële activiteit heeft, maar wanneer zijn toxiciteit in kaart werd gebracht, werd het niet meer als een potentieel nieuw antibioticum beschouwd (23,24). CIT wordt samen met OTA omwille van zijn nefrotoxisch karakter en gelijkenissen met mycotoxin porcine nephropathy (MPN) (12) vaak geassocieerd met BEN een endemische ziekte die voorkomt in Servië, Bulgarije, Roemenië, Bosnië en Herzegovina en Kroatië (20,25). Deze associatie is te wijten aan het feit dat er werd vastgesteld dat in de regio’s waar BEN voorkomt, de voeding en veevoeder hogere concentraties OTA en CIT bevatte dan in de BEN- negatieve regio’s. Hoewel OTA-contaminatie in beide regio’s vaker voorkwam, was de concentratie aan CIT gevonden in de positieve stalen tot 200 keer hoger (20). Dit duidt dat CIT-contaminatie van voeding en voeder niet mag onderschat worden en er wettelijke limieten noodzakelijk zijn om de gezondheidsrisico’s voor mens en dier te beperken.

Pagina | 4 1.1.2 Fysicochemische eigenschappen

CIT heeft een polyketide structuur [C13H14O5, IUPAC: (3R,4S)-4,6-dihydro-8-hydroxy-3,4,5-trimethyl-6-oxo-3H- 2-benzopyran- 7-carboxylic acid; moleculair gewicht 250.25 g/mol; CAS No: 518-75-2]. Het vormt gele kristallen met een maximale UV-absorptie in methanol (250 nm en 333 nm). Het heeft een smelttemperatuur van 175°C waarbij het ontbindt in zijn degradatieproducten, CIT H1, wat twee CIT-moleculen bevat, en CIT H2 (Figuur 1.1.) met respectievelijk hogere en lagere toxiciteit ten opzichte van de moedermolecule (26). Ook andere degradatieproducten van CIT werden gerapporteerd, waaronder het cytotoxische CIT-dimeer, dicitrinine A (27).

Figuur 1.1. Chemische structuren van citrinine, citrinine H1 en citrinine H2 (26).

In aanwezigheid van water kan het beginnen degraderen bij lagere temperaturen (100°C). De instabiliteit van CIT bij hogere temperaturen kan de lage concentraties in bewerkte voedingsmiddelen verklaren (28).

Afhankelijk van de pH kan CIT van kleur veranderen: van geel bij pH 4.6 naar kersenrood bij pH 9.9. Het is praktisch onoplosbaar in water, maar wel oplosbaar in een waterige NaCl-, NaCO3- of natriumacetaat-oplossing als ook in verscheidene polaire organische solventen zoals methanol, acetonitril, ethanol en ethylacetaat (26,29). CIT heeft een geconjugeerde, planaire structuur die zorgt voor zijn natuurlijke fluorescentie. Het kan complexeren met metalen en weer degraderen in zuur of basisch milieu, of bij het verhitten. Het is een chinon met twee intramoleculaire waterstofbrugbindingen. Bij kristallisatie komen de twee tautomere vormen, para-chinon en ortho-chinon, in een dynamisch evenwicht (Figuur 1.2.).

Pagina | 5 Figuur 1.2. Tautomere vormen van citrinine (26).

1.1.3 Voorkomen in voeding

Op verzoek van de Europese Commissie heeft EFSA een wetenschappelijke opinie uitgebracht over de gezondheidsrisico’s voor mens en dier inzake het voorkomen van CIT in voeding en voeder. Deze opinie werd verwezenlijkt door alle beschikbare data van CIT betreft het voorkomen en toxiciteit te verzamelen (16).

1.1.3.1 Granen en verwerkte graanproducten

De meeste studies in Europa naar het voorkomen van CIT hadden zich toch nog toe gefocust op granen afkomstig uit de Balkanregio, waar de meerderheid van de mensen lijdt aan BEN. Er wordt ondersteld dat deze ziekte gelinkt is aan chronische blootstelling aan CIT en OTA, aangezien beide mycotoxinen nefrotoxisch zijn (11,16).

Verschillende graansoorten waaronder tarwe, maïs, gerst, haver, durum tarwe, rijst, boekweit, sorghum, en sojabonen werden onderzocht in verschillende continenten (Europa, Azië, Afrika). In de Europese surveys werden wat betreft granen voor humane consumptie enkel tarwe, durum tarwe, maïs en gerst bestudeerd. Stalen werden verzameld uit verschillende dorpen in Bulgarije (20). Van de 37 stalen waren er drie positief, met zowel lage als hoge concentraties aan CIT (20, 83 en 420 µg/kg). In twee van de stalen werd naast CIT ook OTA teruggevonden, waarbij in het staal met de hoogste concentratie aan CIT (420 µg/kg) de OTA-concentratie veel lager lag (39 µg/kg). Voor maïs werden er geen positieve stalen gevonden. Een studie uitgevoerd in Zwitserland vond in twee van de vier durum tarwe stalen CIT terug met concentraties 0.3 en 0.7 µg/kg (30).

Ook werden verschillende verwerkte graanproducten onderzocht naar het voorkomen van CIT, met onder andere bloem, pasta, tarwezemelen en ontbijtgranen. In dezelfde Zwitserse studie werd in 11 van de 21 bloemstalen CIT teruggevonden met concentraties tussen 0.2 en 1.0 µg/kg (30). In 1 van de 2 pastastalen werd CIT gedetecteerd, van de vijf zemelenstalen was er geen enkel positief. In Frankrijk werd er gekeken naar de aanwezigheid van CIT in ontbijtgranen. In 8 van de 45 stalen werden concentraties gedetecteerd, variërend van 1.5 µg/kg tot 42 µg/kg.

In deze 8 positieve stalen werd ook OTA teruggevonden, maar in lagere concentraties (31). Hoge concentraties aan CIT werd voornamelijk teruggevonden in zemelen, waar de buitenste lagen van de graankorrel nog aanwezig zijn. Dit werd in 2004 door Meister aangetoond (32).

Pagina | 6 1.1.3.2 Fruit, fruit- en groentesappen

In 1977 werd voor het eerst gerapporteerd dat CIT en patuline samen voorkomen in appels. Dit werd bevestigd in een Portugese studie in het jaar 2002 waar appels verzameld werden met zichtbaar rotte plekken. In 14 van de 351 stalen werd CIT en in 69 van de stalen zowel CIT als patuline aangetroffen.

In Duitsland werden enkele groente- en fruitsappen verzameld uit verschillende winkels (appelsap, tomatensap, kersensap, zwarte bessensap en druivensap) waarin slechts sporen van CIT teruggevonden werden (33).

In Egypte waren van 10 druivenstalen maar twee gecontamineerd met CIT. In beide stalen werd een concentratie van 70 µg/kg bepaald.

1.1.3.3 Noten

Twee studies naar het voorkomen van CIT in noten, beide uitgevoerd in verschillende landen (Spanje en Saudi- Arabië) rapporteerden de afwezigheid van CIT. Er wordt vermoed dat dit deels te wijten is aan het laag vochtgehalte in noten. De noten die werden onderzocht waren amandelen, cashewnoten, hazelnoten, pistachenoten en walnoten. Hoewel alle stalen negatief waren, bleken ze allen besmet te zijn met een schimmel die toxinen zou kunnen produceren in gunstigere omstandigheden (34,35).

1.1.3.4 Specerijen

Verschillende kruiden die gewoonlijk lokaal te vinden zijn in India (kurkuma, koriander, venkel, kaneel, zwarte peper, komijn, chili, gele mosterd, knoflook), werden geanalyseerd. Acht van 40 stalen waren positief, met concentraties tussen 22 µg/kg tot 59 µg/kg. De gecontamineerde kruiden waren kurkuma, koriander, venkelzaad, zwarte peper, kardemom en komijn, met de hoogste concentraties CIT in kurkuma en venkelzaad (36).

1.1.3.5 Kaas

De aanwezigheid van CIT werd nagegaan in het Verengd Koninkrijk en in Duitsland. In het Verenigd Koninkrijk testten 17 van 44 stalen genomen uit schimmelkaas positief voor CIT, in concentraties van tot wel 50 µg/kg (37).

De survey uitgevoerd in Duitsland kon echter geen CIT detecteren in commerciële kaas (38).

1.1.3.6 Olijven

Een studie naar het voorkomen van CIT in zwarte olijven toonde aan dat 80% van de stalen afkomstig van zowel Marokko als van Turkije gecontamineerd waren met CIT, waarbij de concentraties respectievelijk verschilden tussen 0.2 en 0.5 µg/kg en tussen 75 en 350 µg/kg (39,40).

1.1.3.7 Vleesproducten

Het voorkomen van mycotoxinen in voeding en voeder hangt af van vele factoren zoals de eigenschappen van de schimmel zelf, het seizoen, de vochtigheid, de temperatuur en de condities waarin de gewassen zijn geoogst,

Pagina | 7 bewaard en verwerkt. Indien de schimmelgroei niet gecontroleerd wordt, kunnen deze toxinen via voeding terechtkomen bij de mens. Ook is er de mogelijkheid tot carry-over effecten, zoals in het geval van AFB1. Koeien kunnen AFB1 die ze via voeder binnenkrijgen, metaboliseren tot aflatoxine M1 (AFM1), dat uitgescheiden kan worden via koemelk, die op zijn beurt gebruikt wordt in vele melkproducten (41,42). Gezien de mogelijkheid tot carry-over in geval van andere mycotoxinen, moet er extra aandacht besteed worden om de maximale toegelaten concentraties in vlees en andere dierlijke producten niet te overschrijden. Voor vele Europese landen zijn er nog geen limieten vastgelegd voor CIT in zowel plantaardige als dierlijke producten (43). In dat geval is risicobeheersing enkel mogelijk door contaminatie van voeding en voeder te beperken ter bescherming van de volks- en diergezondheid. De blootstelling aan CIT zou echter ook indirect kunnen beperkt worden door dezelfde limieten voor OTA te hanteren, gezien P. verrucosum het meeste prevalent is in granen en zowel OTA als CIT kan produceren (10).

In een studie in Kroatië werd het voorkomen van OTA, AFB1 en CIT onderzocht in verscheidene gefermenteerde vleesproducten, waarbij de stalen bij verschillende producenten werden aangekocht (21). Van 90 stalen waren er 64.44% positief voor OTA en 5.55% voor CIT. De concentraties voor OTA varieerden tussen 0.05 (LOQ) en 7.83 µg/kg. Voor CIT lagen de concentraties in de meeste gevallen lager dan de LOQ (0.05 µg/kg). Een mogelijke verklaring voor de lage CIT-concentraties in eetbaar dierlijk weefsel, is dat voor CIT het primaire targetorgaan de nier is. Ook door zijn slechte absorptie en snelle eliminatie via de urine en faeces kunnen de CIT-concentraties in eetbaar weefsel laag liggen (44). Het is nog niet geheel duidelijk of de bekomen positieve resultaten te wijten zijn aan carry-over, of directe contaminatie tijdens het rijpingsproces van de worsten, wat er op wijst dat verdere onderzoek naar het voorkomen van CIT in vlees- en andere dierlijke producten noodzakelijk is.

1.1.4 Toxiciteit

Op basis van de beschikbare data inzake het voorkomen en toxiciteit van CIT heeft het EFSA in 2012 de risico’s voor de volks-en diergezondheid geëvalueerd (16).

Enkel een beperkt aantal dierlijke studies hadden voldoende gegevens voor een adequate risicobeschrijving. Een eerste, langdurige studie (90 dagen), ging na wat de veilige concentratie was van rode gist rijst supplementen in mannelijke Wistar ratten (45). De behandelgroepen kregen elk een verschillende concentratie aan CIT die varieerde van 1 tot 200 mg/kg. Zowel het lichaamsgewicht als dagelijkse voederinname, orgaangewicht en histopathologische veranderingen in de lever en de nier werden geëvalueerd. Er werd in geen enkele behandelgroep toxicologische effecten waargenomen. De hoogste toegediende CIT-concentratie, 200 mg/kg rode gist rijst, kwam overeen met een concentratie van 20 µg/kg lichaamsgewicht, wat in deze studie werd voorgesteld als een NOAEL (no-observed-adverse-effect-level) voor ratten.

Pagina | 8 Een tweede, subacute studie (acht weken) beschreef dat varkens in staat zijn CIT-concentraties in voeder tot 20 µg/kg lichaamsgewicht per dag te tolereren voor een lange periode, zonder enige effecten van toxiciteit te vertonen (46). Ook deze studie stelde een NOAEL van 20 µg/kg lichaamsgewicht per dag voor.

Gezien de resultaten van beide studies met mekaar overeenstemmen, beschouwde de CONTAM Panel deze waarde als een NOAEL (16).

Om het risico van CIT te kunnen beschrijven, werd een level of no concern voor nefrotoxiciteit bepaald. Door het invoeren van een onzekerheidsfactor van 100, die rekening hield met de inter-individuele en inter-species variabiliteit, werd een waarde van 0.2 µg/kg lichaamsgewicht per dag bekomen. Er moet worden vermeld dat omwille van vele onzekerheden met betrekking tot de risicoberekening, verdere toxicologische en kwantitatieve data van het voorkomen van CIT in voeding en voeder in Europa noodzakelijk zijn voor een meer verfijnde risico- evaluatie (16).

1.1.4.1 Nefrotoxiciteit

Uit een langdurige studie van 80 weken op ratten werd vastgesteld dat de nier het primaire targetorgaan is van CIT (47). De dieren werden in twee groepen verdeeld, een controle (28 ratten) en een behandelgroep (22 ratten) waarbij de behandelgroep elke dag ongeveer 70 mg CIT per kg lichaamsgewicht toegediend kreeg. In week 80 konden duidelijk histopathologische veranderingen in de nier vastgesteld worden, met een verhoogde incidentie op adenomen. Er kon niet worden besloten of deze laatste op lange termijn zouden evolueren naar carcinomen gezien de beperkte duur van de studie. Hierdoor wordt CIT voorlopig nog geklasseerd onder groep 3 (niet klasseerbaar als carcinogeen voor de mens) (48).

1.1.4.2 Reproductieve toxiciteit

In een andere studie werd het effect van CIT op zwangere Wistar ratten en hun nakomelingen bestudeerd. CIT werd in het voeder toegediend aan een constante concentratie van 10 mg/kg, wat overeenkomt met ongeveer 1 mg/kg lichaamsgewicht. Verschillende vormen van maternale toxiciteit kon waargenomen worden, die zich uitten in degeneratieve leververanderingen, renale lesies en glomerulaire congestie (49). De geëxamineerde foetussen vertoonden zware malformaties die gepaard gingen met hydrocephalus (accumulatie van cerebrospinaal vocht in de hersenen) en verkleinde nieren (50). Deze resultaten werden bevestigd door middel van een in vitro studie waarbij embryocellen van de muis in apoptose gingen bij een concentratie van 30 µg/ml.

Hierbij kan er worden besloten dat CIT zowel een reproductief toxische, teratogene als embryotoxische stof is.

Pagina | 9 1.1.4.3 Genotoxiciteit

De genotoxiciteit van CIT werd nagegaan in zowel bacteriële als in zoogdiercellen in vitro en in muizen in vivo.

In de bacteriële assays kon worden besloten dat CIT niet mutageen is, zowel in het geval van metabole activatie door de S9 fractie, als zonder (51). De S9 fractie bevat verschillende transferases en CYP450-enzymen die de humane metabolisatie in de bacteriën kunnen representeren. In de zoogdiercellen werden in vitro veranderingen waargenomen in de chromosomen, en werden zowel micronuclei (kleine celkernen) als aneuploïdie (abnormaal aantal chromosomen) geïnduceerd (52). Of CIT ook genotoxiciteit vertoonde in in vivo studies werd nagegaan in een studie met muizen, waarbij CIT oraal werd toegediend (53). De concentraties varieerden van 5 tot 20 mg/kg voor de behandelgroep. In de beenmergcellen van de muizen werden ook hier chromosomale abnormaliteiten waargenomen die in de behandelgroep bijna 7 keer meer voorkwam. De inconsistentie van de resultaten uit verschillende studies toonde dat er onvoldoende gegevens zijn om te kunnen besluiten of CIT genotoxisch is voor mens en/of dier.

1.1.4.4 Additief effect van CIT in combinatie met OTA

De toegenomen toxiciteit van CIT in simultane aanwezigheid van OTA werd bevestigd via een acute toxiciteitsstudie. In deze studie werd enkel gekeken naar de letaliteit. Honderdtwintig muizen werden in groepen verdeeld waarbij elke groep verschillende dosissen CIT en OTA kreeg. Hoewel er duidelijk kon worden waargenomen dat de letaliteit in alle groepen groter was, was dit effect eerder additief dan synergistisch (16,54).

1.1.5 Wetgeving

In tegenstelling tot OTA bestaan er nog geen wettelijk vastgelegde limieten voor CIT buiten in rode gist rijst supplementen, die beschreven staan in de Europese verordening Nr. 212/2014 (43). Het maximumgehalte aan CIT in voedingssupplementen op basis van rode gist Monascus purpureus gefermenteerde rijst ligt vast op 2000 µg/kg. Voor de andere voedingsmatrices zal in deze thesis gebaseerd worden op de maximumgehaltes van OTA, die opgesomd staan in Tabel 1.1.

Pagina | 10 Tabel 1.1. De maximumgehaltes van ochratoxine A in voedingsmatrices.

Voedingsmatrix Maximumgehalte (µg/kg)

Onbewerkte granen 5.0

Verwerkte graanproducten 3.0

Gedroogde druiven 10.0

Wijn 2.0

Druivensap 2.0

Bewerkte voedingsmiddelen op basis van granen en babyvoeding voor zuigelingen en peuters

0.5 Specerijen:

- Zwarte en witte peper, nootmuskaat, gember en kurkuma

- Spaanse peper, cayennepeper, chilipeper en paprika

- Mengsels van specerijen

15 15 15

1.2 ANALYSEMETHODEN

1.2.1 QuEChERS-methode

QuEChERS staat voor quick, easy, cheap, effective, rugged en safe, en werd oorspronkelijk ontwikkeld door Anastassiades et al. voor de analyse van pesticiden in fruit en groenten (55). Als extractiesolvent wordt standaard acetonitril (ACN) gebruikt waaraan zouten (MgSO4 en NaCl) toegevoegd worden. Anhydrische MgSO4

heeft het vermogen een grote hoeveelheid water te binden. NaCl daarentegen is verantwoordelijk voor het uitzoutingseffect: door dissociatie in water zullen de Na⁺- en Cl^—ionen interageren met water waardoor er minder beschikbaar wordt voor het analyt. Op die manier zal het analyt meer gestimuleerd worden over te gaan naar de organische fase.

De originele QuEChERS-methode werd verder geoptimaliseerd door toevoeging van buffers tijdens de extractieprocedure. Deze zorgen voor een constante pH om de stabiliteit van base-gevoelige componenten te verbeteren (56,57). De methoden AOAC official Method en CEN Method worden vandaag de dag het meest aangewend en gebruiken respectievelijk een acetaat- en een citraatbuffer. Voor voedingsmiddelen met een laag watergehalte zoals granen, gedroogd fruit en kruiden wordt conventioneel water toegevoegd voor de eigenlijke extractie. Het weken zou de interacties in de matrix verslappen en zo de extractie verbeteren (57).

1.2.2 UPLC-MS/MS

UPLC-MS/MS is een veelgebruikte analytische methode omwille van zijn hoge sensitiviteit en specificiteit. Het bestaat uit een vloeistofchromatograaf die gekoppeld is aan een massaspectrometer. Allereerst wordt een welbepaald volume van het staal geïnjecteerd in de kolom. Daar verdelen de componenten zich tussen de

Pagina | 11 stationaire en mobiele fase. De scheiding tussen componenten gebeurt op basis van hun verschil in polariteit.

Veelal wordt er gebruik gemaakt van een apolaire kolom en een polaire mobiele fase. Indien een component meer affiniteit vertoont voor de stationaire fase, zal het ook later elueren van de kolom. De elutie van het analyt kan versneld worden door het percentage organisch solvent ten opzichte van waterig solvent te verhogen. Dit is mogelijk met een gradiëntsysteem.

Nadat de component uit de kolom elueert, komt het via een capillair, waar het wordt blootgesteld aan een hoge spanning van ongeveer 4 kV, terecht in een ionenbron, bijvoorbeeld een electrospray ionisatiebron (Figuur 1.3.).

De kleine druppels worden geladen en met behulp van een vernevel- en desolvatiegas (bv. N2) gedispergeerd tot individueel geladen partikels in de gasfase. Dit gedeelte van de massaspectrometer gebeurt onder atmosferische druk. Hierna worden de geladen deeltjes onder vacuüm door een cone gezogen richting de analyzer. De spanning op de cone wordt componentafhankelijk ingesteld.

Figuur 1.3. De werking van een Electrospray Ionisatiebron (58).

Een veelgebruikte analyzer is de triple quadrupool, die bestaat uit drie opeenvolgende quadrupools. In de eerste wordt een zekere m/z-waarde, het moeder-ion, gefiltreerd door middel van een combinatie van magnetische en elektrische velden. Dit moeder-ion wordt verder doorgelaten naar een tweede quadrupool, wat de collision kamer wordt genoemd. Hier wordt het door een tegenstroom van argongas gefragmenteerd tot haar dochterionen. In een derde quadrupool worden de m/z-waarden van de gewenste dochterionen geselecteerd voor identificatie en kwantificatie. Het elektrisch signaal wordt door middel van een fotomultiplier vermenigvuldigd en omgezet tot een piekoppervlakte of piekhoogte dat in een chromatogram wordt weergegeven ten opzichte van de retentietijd.

Pagina | 12 1.2.3 Standaardadditie en matrix-matched kalibratie

Matrix-effecten zijn een gekend fenomeen bij gas-en vloeistofchromatografie. Matrix-componenten kunnen co- elueren met het analyt en zo leiden tot ion-suppressie of ion-versterking. Ion-suppressie treedt op wanneer een matrix-component met een gelijkende m/z-waarde in competitie treedt voor ionisatie. Dit kan leiden tot een lager percentage geïoniseerd target-analyt en dus een lager signaal. Hierdoor verhoogt de kans op vals negatieve resultaten. Ion-versterking daarentegen treedt op wanneer een matrix-component bindt op aspecifieke plaatsen op de kolom. Dit belet de retentie van het target-analyt, waardoor er meer de detector kan bereiken.

Bij uitgesproken matrix-effecten (>20%) kan standaardadditie worden toegepast (59). Deze corrigeert voor zowel matrix-effecten als verliezen in terugvinding. Hierbij worden er twee stalen afgewogen van hetzelfde voedingsmiddel, waarbij het een direct wordt geanalyseerd (blanco) na extractie en het ander eerst nog belast wordt met een concentratie dat 1 tot 5 keer hoger is dan de geschatte concentratie in het blanco-staal. Deze techniek kan dus enkel worden toegepast nadat een eerste analyse is uitgevoerd en de concentratie in de blanco is berekend. De responsen van beide stalen worden uitgezet in functie van het toegevoegde hoeveelheid analyt.

De hoeveelheid in de blanco kan worden berekend door het snijpunt te zoeken met de x-as (Figuur 1.4.).

Figuur 1.4. Standaard-additie-methode (58).

Anderzijds kunnen matrix-effecten ook worden gecorrigeerd door middel van een matrix-matched kalibratie.

Hierbij worden extracten van een blanco afkomstig van dezelfde matrix als de stalen belast met het analyt in verschillende concentraties en gebruikt voor de kalibratie. Indien er een groot aantal stalen worden geanalyseerd, zou er één matrix gebruikt kunnen worden voor een groep voedingsstalen uit dezelfde matrix- groep. Maar aangezien in een LCMS/MS-analyse de matrix-effecten afhankelijk zijn van co-elurerende

Pagina | 13 componenten, en deze dus voor elke voedingsstaal kunnen verschillen, is deze methode minder geschikt voor een accurate kwantificatie.

1.2.4 Isotoop-gelabelde interne standaard

Ook kan er gebruik gemaakt worden van een isotoop-gelabelde interne standaard (IS). De chemische structuur is identiek aan dat van het analyt. Dit leidt ertoe dat beide componenten hetzelfde gedrag vertonen tijdens de analyse. De piekoppervlakte van het onderzochte analyt wordt uitgedrukt ten opzichte van dat van de interne standaard. Het gebruik van een interne standaard brengt heel wat voordelen met zich mee. Naast de correctie voor matrix-effecten, indien in het begin van de analyse toegevoegd, kan de identificatie van de pieken vergemakkelijkt worden doordat beide componenten dezelfde retentietijd hebben. Ook kan het corrigeren voor verliezen in terugvinding en variaties in injectievolumes (59,60).

Pagina | 14

2. OBJECTIEVEN

Mycotoxinen zijn secundaire metabolieten geproduceerd door schimmels die verscheidene voedingsmiddelen kunnen contamineren. Ze staan bekend om een subacute en chronische toxiciteit bij mens en dier en vormen hierdoor een gevaar voor de volksgezondheid. Het gevolg hiervan is dat er frequent onderzoek wordt verricht naar de blootstelling aan mycotoxinen. De humane blootstelling kan indirect berekend worden door data omtrent mycotoxinecontaminatie in voeding te combineren met consumptiedata, of direct door biomerkers in urine te analyseren. Deze laatste wordt geprefereerd wanneer de gegevens beperkt zijn. In landen zoals België en Duitsland werd de aanwezigheid van verschillende mycotoxine-biomerkers in urinestalen gemeten.

Opmerkelijk was dat voornamelijk DON, CIT en OTA met respectievelijk hun metabolieten deoxynivalenol-15- glucuronide, dihydrocitrinon (HO-CIT) en ochratoxine α (OTα) werden teruggevonden (61–63). Hoewel de concentraties relatief laag waren, was hun frequentie eerder hoog, wat bezorgdheid opwekte. Vooral in het geval van CIT, dat meestal samen voorkomt met OTA en waarbij van beide mycotoxinen gekend is dat ze een nefrotoxisch karakter hebben in dierstudies. De data omtrent de toxiciteit en het voorkomen van CIT in voeding is beperkt en er zijn geen wettelijk vastgelegde limieten, buiten in rode gist rijst supplementen (2000 µg/kg).

Verdere onderzoek is dus noodzakelijk opdat er een volwaardige risicoanalyse kan verwezenlijkt worden.

In deze thesis zal de nadruk gelegd worden op het voorkomen van CIT en OTA in verschillende voedingsmiddelen die te verkrijgen zijn op de Belgische markt. Met behulp van een gevalideerde methode die gebruik maakt van de QuEChERS techniek kan er op een snelle en gemakkelijke manier vele voedingsmatrices simultaan geanalyseerd worden, wat voor de hoge prijs van de apparatuur compenseert. De identificatie en kwantificatie zal gebeuren op basis van UPLC-MS/MS. Deze techniek laat toe CIT en OTA op een selectieve en sensitieve wijze te bepalen. Daarnaast zal een nieuwe methode ontwikkeld en gevalideerd worden voor het bepalen van CIT, HO- CIT en OTA in vlees met behulp van UPLC-MS/MS.

De resultaten in deze thesis zullen bijdragen tot het project CITRIRISK. Een van de doelen van het project is om alle relevante innamebronnen van CIT in België op kaart te brengen. In een later stadium zal de toxicokinetiek en de orale biologische beschikbaarheid van CIT in kippen en varkens en de mogelijke carry-over naar eetbare weefsels en eieren bepaald worden. Als laatste zal gezocht worden naar andere mogelijke fase I en II metabolieten van CIT met behulp van high resolution massspectrometrie.

Pagina | 15

3. MATERIALEN EN METHODEN 3.1 REAGENTIA EN SOLVENTEN

Alle reagentia gebruikt tijdens de analyse waren van analytische kwaliteit met uitzondering van methanol, azijnzuur en ammoniumacetaat, die van LCMS-kwaliteit waren (Bijlage 8.1.1). Ultra puur water werd op het moment zelf verkregen met behulp van een arium®pro ultrapure water-systeem.

3.2 STANDAARDEN

De standaarden CIT en OTA zijn respectievelijk aangekocht bij de firma’s Fermentek en Sigma-Aldrich. De ¹³C- gelabelde CIT- en OTA-interne standaarden zijn beide aangekocht bij Biopure. Bijhorende informatie is te vinden in Bijlage 8.1.2.

3.3 STAALNAME

Er werden 146 handelsproducten geselecteerd uit verschillende warenhuizen (Albert Heijn, Aldi, Colruyt, Delhaize), drogisterijen (Holland & Barrett, Kruidvat), apotheken en slagerijen, waarvan de aankoop verspreid werd over de maanden februari, maart en april 2018 (Bijlage 8.2). Deze handelsproducten omvatten 11 verschillende voedingsmatrices (granen, fruit- en groentesappen en rozijnen, kruiden en specerijen, alcoholische dranken, noten, zaden en peulvruchten, soja- en andere vegetarische producten, babyvoeding en voeding voor jonge kinderen, vleesproducten, voedingssupplementen, olijven en kaas) en werden geanalyseerd in de maand van hun aankoop. Na homogenisatie (HR1393 Mini Chopper, Philips, België; M 20 Universal mill, IKA, VS) werden de verse producten bij -20°C en de droge producten op kamertemperatuur bewaard.

3.4 ONTWIKKELING EN VALIDATIE VAN BEPALING VAN CIT, OTA EN HO-CIT IN VLEES

Voor de validatie van de bepaling van CIT, OTA en HO-CIT in vlees werd kippenfilet gekozen als matrix.

3.4.1 Staalvoorbereiding

De staalvoorbereiding is gebaseerd op een in-huis-extractieprocedure, die ook gebruik maakt van QuEChERS. Eén g gehomogeniseerd staal werd afgewogen (BP 210S, Sartorius, Nederland) in een 50 ml extractiebuis (NerbePlus, Germany) en belast met 5 ng/g IS (¹³C-CIT/¹³C-OTA 1000 ng/g in MeOH). De Quality Control (QC)-stalen werden daarnaast ook belast met 1 ng/g analyt (CIT/OTA-oplossing 5 µg/ml in MeOH). Er werd 30 min gewacht voor evenwichtsinstelling. Aan de stalen werd 3 ml 1M HCl toegevoegd, gevortext en 15 min gewacht voor het weken van de matrix. Vervolgens werd 5 ml ACN toegevoegd en 30 min lang geschud op de overhead shaker. Hierna werden aan alle stalen QuEChERS zouten toegevoegd (1.5 g MgSO4 en 0.4 g NaCl), krachtig geschud met de hand voor 1 min en gevortext (TM1, Techmatic, Beglië). De stalen werden daarna gecentrifugeerd (Multifuge 3 S-R, Heareus, VK) bij 4000 rpm gedurende 10 min. Er werd 1 ml van de organische fase drooggedampt op 40°C onder

Pagina | 16 een zachte N2-stroom (Turbovap LV, Biotage, Zweden) en heropgelost in 200 µl mobiele fase (MeOH:H2O 50:50, V/V) (HandyStep® electronic, Brand, Duitsland). Om te ontvetten werd eenzelfde hoeveelheid hexaan toegevoegd.

De extracten werden tenslotte gefiltreerd doorheen een membraanfilter van 0.20 µm (Millex-GN, Merck Millipore Ltd., Ierland) en overgebracht in een HPLC-vial, waarvan 5 µl in het UPLCMS/MS-toestel werd geïnjecteerd voor analyse.

3.4.2 Methodevalidatie

De methode werd gevalideerd volgens een in-huis-methodevalidatie gebaseerd op de Europese Commissie Beslissing (EC) Nr. 2002/657 (64) en Commissie Verordening (EU) Nr. 401/2006 (65).

3.4.2.1 Kalibratiecurve

Voor het opstellen van een kalibratiecurve werden blanco-stalen belast met de concentraties 0.1, 0.5, 1, 5, 10 en 50 ng/g CIT, OTA-en HO-CIT. Dit zijn de concentraties die worden verwacht in de stalen. De laagste concentratie is de verwachte LOQ. Er worden drie curves opgesteld, waar voor elke curve de meest passende vergelijking en wegingsfactor werden geëvalueerd. De beslissing werd gemaakt op basis van de goodness-of-fit (g), de correlatiecoëfficiënt (r) en de accuraatheid van de berekende concentraties.

De curve kan beschreven worden door een lineaire of een kwadratische vergelijking:

y = ax + b of y = ax² + bx + c respectievelijk, waarbij:

y: piekoppervlakte ratio analyt/IS;

x: concentratie analyt;

a: richtingscoëfficiënt van de lineaire functie;

b: snijpunt van de lineaire functie.

De voorwaarden voor de volgende parameters zijn als volgt: r moet ≥ 0.99 en g (%), die berekend kan worden volgens de vergelijking (3.4.2), moet ≤ 10% voor concentratieniveaus ≥ 10 ng/g en ≤ 20% voor< 10 ng/g.

𝑔 = √∑(% 𝑑𝑒𝑣𝑖𝑎𝑡𝑖𝑒)²(𝑛 − 1) (3.4.2)

Waarin % deviatie = (xberekend – xnominaal)/xnominaal × 100 En n=aantal resultaten

Indien niet wordt voldaan aan deze criteria, mag er maximum 1 (in het geval van 6 belaste standaardkalibratoren) uitgesloten worden. Zowel r als g moeten dan opnieuw worden berekend.

Pagina | 17 De volgende weegfactoren mogen toegepast worden: ongewogen, 1/x en 1/x². Voor alle drie de kalibratiecurves worden de g-waarden voor de verschillende weegfactoren afzonderlijk opgeteld. De laagste waarde voor de som van g zal de meest geschikte weegfactor bepalen.

3.4.2.2 Accuraatheid

De accuraatheid van een analytische methode drukt de benadering van de overeenkomst (“closeness of agreement”) uit tussen de waarde van een meetresultaat en een aanvaarde referentiewaarde. Het verkregen resultaat omvat zowel systematische als toevallige fouten. Accuraatheid wordt uitgedrukt als de som van de juistheid en de precisie. Indien geen referentiemateriaal beschikbaar is, kan de juistheid worden uitgedrukt als de “apparent recovery” of terugvinding. Dit is het percentage van de werkelijke waarde van een analyt dat wordt teruggevonden in een belast blanco-matrixstaal. De precisie omvat de herhaalbaarheid (within-run precisie) en de intermediaire precisie (between-run precisie) die respectievelijk worden uitgedrukt in RSDr en RSDR.

De accuraatheid wordt op drie afzonderlijke dagen berekend bij minimum 3 willekeurig gekozen concentratieniveaus (LOQ (=laag), middel en hoog). Deze moeten binnen de geschatte concentratiereeks vallen.

De concentraties 0.1, 1 en 10 ng/g worden gekozen voor alle drie de analyten. Elk niveau wordt minstens 6 keer geanalyseerd. Indien niet wordt voldaan aan de acceptatiecriteria (Tabel 3.1), kunnen er maximum 3 resultaten uitgesloten worden, waarna de accuraatheid opnieuw moet worden berekend.

Tabel 3.1. Acceptatiecriteria accuraatheid.

Concentratie ≤ 1 ng/g -50% tot +20%

Concentratie > 1 ng/g en < 10 ng/g -30% tot +10%

Concentratie ≥ 10 ng/g -20% tot +10%

3.4.2.3 Precisie

De precisie omvat de herhaalbaarheid (within-run precisie) en de intermediaire precisie (between-run precisie).

De herhaalbaarheid drukt de benadering van de overeenkomst uit tussen onafhankelijke analyseresultaten waarbij dezelfde analysemethode en dezelfde testmaterialen werden gebruikt onder gelijkaardige omstandigheden (dezelfde uitvoerder, hetzelfde apparatuur, hetzelfde laboratorium op dezelfde dag).

De intermediaire precisie is de precisie die wordt bekomen uit resultaten van dezelfde analyse in hetzelfde laboratorium, maar wordt door verschillende operatoren en op verschillende dagen uitgevoerd. De resultaten voor de herhaalbaarheid over drie dagen worden gebruikt om de intermediaire precisie te berekenen, en worden uitgedrukt in RSDR (%).

Pagina | 18 Stalen worden belast bij minimum 3 willekeurig gekozen concentratieniveaus (0.1, 1 en 10 ng/g). De herhaalbaarheid wordt beschreven door de relatieve standaarddeviatie RSDr (%). De RSD wordt berekend aan de hand van de formule (3.4.2.3a). Voor de berekening van de aanbevolen limiet voor de RSDR voor CIT wordt de Horwitz-vergelijking gebruikt (3.4.2.3b). Voor de concentraties 0.1, 1 en 10 ng/g CIT en HO-CIT zijn de aanbevolen RSDR- waarden respectievelijk 64, 45 en 32%, en 42.2, 29.7 en 21.1% voor RSDr (66,67).

RSD=SD/gemiddelde x 100% (3.4.2.3a)

Horwitz-vergelijking=21−0.5𝑥𝑙𝑜𝑔(𝐶) (3.4.2.3b)

Waarin C: de concentratie uitgedrukt in g/ml of g/g.

Elk staal wordt minstens 6 keer geanalyseerd. Indien de herhaalbaarheid buiten de acceptatielimieten valt (Tabel 3.2.), mogen er maximaal 3 resultaten uitgesloten worden, waarna het opnieuw wordt berekend.

Tabel 3.2. Prestatiecriteria voor CIT en OTA (66,67).

Analyt Concentratie (ng/g) RSDr (%) RSDR (%)

CIT^a Alles 0.66xRSDR Horwitz-vergelijking

(aanbevolen)

OTA <1 ≤40 ≤60

≥1 ≤20 ≤30

a Voor HO-CIT, waarvoor geen wettelijke limieten zijn vastgelegd, worden de prestatiecriteria voor CIT gebruikt

3.4.2.4 LOD

De LOD is de laagst gemeten concentratie van een analyt waarbij met voldoende zekerheid de aanwezigheid ervan kan worden bevestigd. Het signaal is significant verschillend met dat van een blanco-staal. De LOD wordt uitgedrukt als de concentratie analyt corresponderend met een S/N-waarde van 3:1 en wordt berekend aan de hand van de formule (3.4.2.4), met de gemiddelde S/N-waarde van de meetresultaten gebruikt voor de herhaalbaarheid.

LOD=3 x LOQ/ gemiddelde S/N (3.4.2.4)

Met gemiddelde S/N = de gemiddelde S/N-waarde van de meetresultaten gebruikt voor de herhaalbaarheid.

Pagina | 19 3.4.2.5 LOQ

De LOQ is de laagst gemeten concentratie van een analyt waarbij de identificatie moet voldoen aan vooraf vastgelegde accuraatheid en precisie. De LOQ wordt bepaald uit minstens 6 blanco-stalen die belast zijn met 0.1 ng/g CIT/OTA. Indien de accuraatheid bij deze concentratie aanvaardbaar is, wordt deze concentratie gekozen als LOQ.

3.4.2.6 Carry-over

De carry-over wordt bepaald door na de laatste (=hoogste) standaardkalibrator en voor de eigenlijke validatie- stalen een solvent-staal te injecteren. De respons van de piek met dezelfde retentietijd als het analyt mag niet meer zijn dan 20% van de gemiddelde piekoppervlakte van het analyt in de LOQ-stalen en mag niet meer zijn dan 5% van de gemiddelde piekoppervlakte van de IS in de standaardkalibratoren en de controlestalen.

3.4.2.7 Specificiteit

De specificiteit is het vermogen een onderscheid te maken tussen het analyt en andere componenten die ook in het staal aanwezig kunnen zijn. Het wordt bepaald door analyse van 1 blanco-staal. Wanneer op dezelfde retentietijd als het analyt een piek wordt gedetecteerd, mag de respons niet meer zijn dan 20% van de gemiddelde respons van het analyt in de LOQ-stalen en niet meer dan 5% van de gemiddelde piekoppervlakte van de IS in de standaardkalibratoren en de controlestalen.

3.4.2.8 Matrix-effecten

Matrix-effecten werden niet verder bekeken aangezien de interne standaard, die in het begin van de analyse werd toegevoegd, ervoor corrigeert (68).

3.5 BEPALING VAN CIT EN OTA IN VOEDINGSMATRICES

3.5.1 Staalvoorbereiding

3.5.1.1 Alle voedingsmatrices met uitzondering van kruiden en supplementen, en vlees

De staalvoorbereiding is gebaseerd op de extractieprocedure van Kiebooms et al. die gebruik maakt van de QuEChERS-techniek (Figuur 3.1.) (69). 4.00 ± 0.02 g gehomogeniseerd staal werd afgewogen in een 50 ml extractiebuis en belast met 5 ng/g IS (¹³C-CIT/¹³C-OTA 1000 ng/g). Terugvinding werd bepaald door blanco-stalen te belasten met 5 ng/g analyt (CIT/OTA-oplossing 1 µg/ml), waarna een halfuur werd gewacht voor evenwichtsinstelling. Hierna werd 10 ml van het waterig extractiesolvent (10% m/V NaCl in aangezuurd water (1.6% HCl in H2O:HAc 99:1, V/V)) toegevoegd en 15 min gewacht voor het weken van de matrix. Daarna werd 20 ml van het organisch extractiesolvent (ACN:HAc 99:1 V/V) toegevoegd gevolgd door 10 ml hexaan voor de ontvetting.

De stalen werden 1 uur geschud op een overhead shaker op kamertemperatuur. Vervolgens werd 6.0 ± 0.2 g

Pagina | 20 MgSO4 en 1.5 ± 0.1 g NaCl aan de stalen toegevoegd, kort daarachter 1 min krachtig geschud om klontervorming te vermijden en nog eens gevortext. Hierna werden de stalen gecentrifugeerd bij 4000 rpm gedurende 5 min, waarna 1 ml van de organische fase werd drooggedampt bij 40°C onder een N2-stroom, heropgelost in 200 µl MeOH:H2O 50:50 V/V, en gefiltreerd doorheen een membraanfilter van 0.2 µm. Tenslotte werd het extract overgebracht in een HPLC-vial, waarvan 5 µl werd geïnjecteerd in het UPLC-MS/MS-toestel voor analyse.

Standaardkalibratoren in solvent werden aangemaakt door 45 µl (0.25, 0.5, 1, 5, 10 en 20 ng/g CIT/OTA in MeOH) te belasten met 5 ng/g IS, waar ze na het vortexen werden overgebracht in HPLC-vials voor analyse. Ook hier werd 5 µl geïnjecteerd.

Figuur 3.1. Extractieprocedure voor alle voedingsmatrices met uitzondering van kruiden en supplementen.

Gebaseerd op (70).

3.5.1.2 Kruiden en supplementen

De methode, beschreven onder 3.5.1.1, werd oorspronkelijk ook gebruikt voor de bepaling van CIT en OTA in de matrices “Kruiden” en “Supplementen”. Ondanks de geslaagde validatie, werd omwille van onaanvaardbare terugvinding in sommige stalen, een alternatieve methode ontwikkeld die ook gebruik maakt van de QuEChERS- techniek (71).

In een 50 ml extractiebuis werd 2.5 g gehomogeniseerd staal afgewogen en belast met 5 ng/g IS (1000 pg/µl ¹³C- CIT/¹³C-OTA). De QC-stalen en de standaardkalibratoren in solvent (0.25, 0.5, 1, 5, 10 en 50 ng/g CIT/OTA in MeOH en 20, 2000 en 2500 ng/g CIT/OTA in MeOH voor rode gist rijst) werden alsook belast met 5 ng/g analyt (1 µg/ml CIT/OTA). Na een evenwichtsinstelling van 15 min werd 10 ml van het waterig extractiesolvent (10% m/V NaCl in aangezuurd water (1.6% HCl in H2O:HAc 99:1, V/V)) toegevoegd en 1 uur gewacht voor het weken van de matrix.

Daarna werd 10 ml van het organisch extractiesolvent (ACN:HAc 99:1 V/V) toegevoegd en 1 uur geschud op de

Pagina | 21 overhead shaker op kamertemperatuur. Vervolgens werd 4 g MgSO4 en 1 g NaCl, dat vooraf was gewogen, toegevoegd en krachtig met de hand geschud voor 1 min. Nadat de stalen 5 min werden gecentrifugeerd bij 4000 rpm, werd van de organische fase 250 µl gepipetteerd en 5 keer verdund. Als laatste werd het verdund extract gefiltreerd doorheen een membraanfilter van 0.2 µm en overgebracht in een HPLC-vial, waarvan 5 µl werd geïnjecteerd in het UPLC-MS/MS-toestel voor analyse.

3.6 INSTRUMENTELE ANALYSE

Instrumentele analyse werd uitgevoerd met behulp van een UPLC-systeem gekoppeld aan een Xevo® TQ-S triple quadrupool massaspectrometer (Waters Technologies, Zellik, België). De kolom Acquity UPLC HSS T3 1.8 µm werd gebruikt voor chromatografische scheiding en met een flow van 4.00 ml/min bij 40°C. Een gradiëntelutie werd toegepast met een mobiele fase A (0.05% azijnzuur (V/V) en 5 mM ammoniumacetaat in H2O) en B (in MeOH). Er werd gestart met een 70/30-verhouding mobiele fase A/B die na 6.5 min werd veranderd naar 10/90. Na 8 min werd er enkel nog mobiele fase B door de kolom gestuurd waarna een min later de begincondities werden hervat tot min 10 voor de herstelling van het evenwicht in de kolom. Voor detectie werd een electrospray ionisatiebron gehanteerd met een negatieve ion-modus voor CIT en HO-CIT, en een positieve ion-modus voor OTA via multiple reaction monitoring. De analytische parameters die zijn geoptimaliseerd door injectie van individuele analyt- oplossingen van CIT, OTA, ¹³C-CIT, ¹³C- OTA en HO-CIT, zijn weergegeven in Tabel 3.3.

Tabel 3.3. Massaspectrometrische parameters voor CIT, OTA, HO-CIT, ¹³C-CIT en ¹³C-OTA.

Analyt Retentietijd (min)

Precursor-ion Cone

voltage (V)

Product-ion m/z (Collision energie)

m/z Ionen Quantifier Qualifier

CIT 3.70 281.00 [M+MeOH-H]^- 50.0 249.00 (15.0 V) 205.00 (25.0 V)

13C-CIT 3.70 294.00 [M+MeOH-H]^- 50.0 262.00 (15.0 V) -

OTA 4.70 404.00 [M+H]⁺ 35.0 238.90 (20 V) 221.00 (30 V)

13C-OTA 4.70 424.20 [M+H]⁺ 35.00 249.80 (28.0 V) -

HO-CIT 2.80 265.00 [M+MeOH-H]^- 60.0 221.00 (16 V) 177.00 (20.0 V)

3.7 DATA-EVALUATIE

Kwantificatie werd verwezenlijkt door middel van de softwarepakket TargetLynx 4.1 (Waters). Voor elk ion werden de vier identificatiecriteria nagegaan die beschreven staan in de Europese Beschikking 2002/657/EG (60). Allereerst moest de relatieve retentietijd van het analyt binnen een marge van ±2.5% ten opzichte van de ijkoplossing vallen. Vervolgens moest elk ion een S/N hebben dat groter of gelijk was aan 3:1. Daarnaast mochten de relatieve piekintensiteiten, die groter waren dan 0.5, maximaal 20% afwijken van de ion-ratio van de

Pagina | 22 ijkoplossing met vergelijkbare concentratie en 25% voor relatieve piekintensiteiten lager dan 0.5. Ten slotte moesten er voor elke precursor-ion minimum twee fragmentionen gedetecteerd worden.

Bij elke analyse werden er QC-stalen samen met de blanco-stalen mee geanalyseerd. Deze stalen, die met een welbepaalde concentratie analyt werden belast, moesten een terugvinding hebben die binnen de grenzen van 70-120% viel voor CIT en OTA (≥1 ng/g) of binnen 50-120% voor OTA met gehaltes < 1 ng/g (66).

Pagina | 23

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE

4.1 RESULTATEN METHODEVALIDATIE VAN DE BEPALING VAN CIT, OTA EN HO-CIT IN VLEES

4.1.1 Kalibratiecurve

De gemiddelde resultaten voor de beste vergelijking, wegingsfactor, g en r van drie kalibratiecurves zijn weergegeven in Tabel 4.1 en 4.2.

Tabel 4.1. De gemiddelde resultaten voor de vergelijking, wegingsfactor, g en r afkomstig van drie kalibratiecurves.

Analyt Vergelijking Wegingsfactor g r

CIT Kwadratisch 1/x 13.99% 0.9998598

OTA Kwadratisch Geen 13.54% 0.9999987

HO-CIT Lineair 1/x 3.01% 0.9999154

Tabel 4.2. De gemiddelde resultaten voor accuraatheid (%) afkomstig van drie kalibratiecurves.

CIT OTA HO-CIT

Concentraties (ng/g) Accuraatheid (%) Accuraatheid (%) Accuraatheid (%)

0.1 17.50% 18.97% -0.98%

0.5 -21.60% -17.77% -0.31%

1 2.80% 7.63% 4.66%

5 1.28% -0.13% -3.66%

10 UITGESLOTEN UITGESLOTEN UITGESLOTEN

50 17.50% 18.97% 0.28%

4.1.2 Accuraatheid

De gemiddelde resultaten voor accuraatheid voor CIT, OTA en HO-CIT zijn weergegeven in Tabel 4.3. De lineariteit van de resultaten zijn weergegeven in Figuur 4.1 en 4.2.

Tabel 4.3. De gemiddelde resultaten voor accuraatheid voor CIT, OTA en HO-CIT.

CIT OTA HO-CIT

Concentratie (ng/g)

Gemiddelde meetresultaat

(ng/g)

Accuraatheid (%)

Gemiddelde meetresultaat

(ng/g)

Accuraatheid (%)

Gemiddelde meetresultaat

(ng/g)

Accuraatheid (%)

0.1 0.108 8 0.112 11.5 - -

1 0.939 -6.1 1.171 17.1 0.977 -2.4

10 10.347 3.5 10.938 9.4 10.067 0.7

Pagina | 24 Figuur 4.1. Accuraatheidsprofiel van CIT (links) en HO-CIT (rechts).

Figuur 4.2. Accuraatheidsprofiel van OTA.

4.1.3 Herhaalbaarheid en intermediaire precisie

De meetresultaten van dag 3 werden gebruikt voor de berekening van herhaalbaarheid. De resultaten zijn weergegeven in Tabel 4.4. Voor de berekening van intermediaire precisie werden de gemiddelde resultaten van herhaalbaarheid over drie dagen gebruikt. De uitkomsten zijn weergegeven in Tabel 4.5.

Tabel 4.4. De resultaten voor herhaalbaarheid voor CIT, OTA en HO-CIT.

CIT HO-CIT OTA

Concentratie (ng/g) SD RSDr SD RSDr SD RSDr

0.1 0.017 15.4 - - 0.013 11.9

1 0.146 15.6 0.044 4.5 0.130 11.1

10 0.890 8.6 1.393 13.8 0.530 4.8

Pagina | 25 Tabel 4.5. De gemiddelde resultaten voor intermediaire precisie voor CIT, OTA en HO-CIT.

CIT HO-CIT OTA

Concentratie (ng/g)

Gem. SD RSDR (%) Gem. SD RSDR (%) Gem. SD RSDR (%)

0.1 0.12 0.030 25.6 - - - 0.12 0.021 17.6

1 0.94 0.170 18.1 0.96 0.297 31.1 1.18 0.196 16.7

10 10.02 1.055 10.5 8.78 2.128 24.2 10.94 0.530 4.8

4.1.4 LOQ

Voor de bepaling van LOQ worden de meetresultaten van dag 1 gebruikt (Tabel 4.6).

Tabel 4.6. De meetresultaten van dag 1 voor CIT, HO-CIT en OTA.

CIT HO-CIT OTA

Theoretische waarde

(ng/g) 0.1 1 0.1

Gemeten waarden (ng/g) 0.13 0.92 0.13

0.09 0.94 0.11

0.10 0.96 0.11

0.12 1.03 0.13

0.09 0.99 0.09

0.12 1.02 0.10

Gemiddelde waarde

(ng/g) 0.108 0.976 0.111

SD 0.017 0.044 0.014

RSD (%) 15.4 4.5 12.0

RSDr toegelaten (%) 42.2 29.7 40

Accuraatheid (%) 8.0 -2.4 11.0

4.1.5 LOD

De S/N-waarden corresponderen met de meetresultaten gebruikt voor de bepaling van LOQ zijn weergegeven in Tabel 4.7.

Tabel 4.7. Corresponderende S/N-waarden en LOD voor CIT, HO-CIT en OTA.

CIT HO-CIT OTA

S/N-waarden 16.8 17.0 32.7

1.6 6.7 22.2

39.7 8.2 11.8

14.6 7.2 14.4

12.0 12.9 13.5

7.3 3.8 11.4

Gemiddelde S/N 15.3 9.3 17.7

LOD 0.02 0.32 0.02

Pagina | 26

4.2 RESULTATEN BEPALING VAN CIT EN OTA IN ALLE VOEDINGSMATRICES

In Tabel 4.8 wordt een algemeen overzicht gegeven van het voorkomen van CIT en OTA in de geanalyseerde matrices.

Tabel 4.8. Algemeen overzicht van het voorkomen van CIT en OTA in 11 voedingsmatrices.

Matrix Totaal (N) CIT >LOD OTA >LOD CIT >LOQ OTA >LOQ

N % N % N % N %

Granen 31 13 42 18 58 11 35 6 19

Fruit- en groentesappen, rozijnen 20 3 15 8 40 2 10 6 30

Alcoholische dranken 8 0 0 3 38 0 0 0 0

Noten, zaden en peulvruchten 22 3 14 6 27 3 14 2 9

Soja- en andere vegetarische producten 8 2 25 2 25 2 25 1 13

Babyvoeding en voeding voor jonge kinderen 10 2 20 2 20 1 10 0 0

Vleesproducten 6 2 33 3 50 1 17 0 0

Supplementen 12 2 17 0 0 2 17 0 0

Olijven 2 0 0 0 0 0 0 0 0

Kaas 3 1 33 0 0 0 0 0 0

Kruiden en specerijen 24 15 63 4 14 14 58 0 0

TOTAAL 146 43 30 46 32 36 25 15 10

In Figuur 4.3 zijn de pieken van het positieve rode gist rijst supplementstaal met de hoogste concentratie weergegeven.

Figuur 4.3. Een tweevoudige analyse van de positieve rode gist rijst supplementstaal (SUP_2).

Pagina | 27 Vanaf Tabel 4.9 tot Tabel 4.18 wordt per matrix een meer gedetailleerd overzicht gegeven van de concentraties van CIT en OTA die zijn teruggevonden in de geanalyseerde voedingsproducten. De voedingsmiddelen zijn gerangschikt volgens hun gehalte CIT.

Tabel 4.9. Een overzicht van de resultaten uit de matrix “Granen”.

Voedingsproduct

Code Maand van

aankoop

Gehalte CIT (ng/g)

Gehalte OTA (ng/g)

Boekweitmeel CER_A9 April 0.998 <LOQ

Meergranen tortilla CER_B10 April 0.695 <LOQ

Speltmeel CER_A8 April 0.370 0.283

Chocolade rijst crisps CER_E2 Februari 0.248 <LOD

Basmati rijst CER_A4 Maart 0.218 <LOQ

Wit brood CER_B1 Februari 0.191 0.107

Cake CER_D3 Maart 0.167 <LOQ

Volkoren crackers CER_B9 April 0.152 <LOQ

Rijstnoedels CER_C3 Maart 0.145 <LOD

Maïsmeel CER_A2 Februari 0.118 <LOD

Pitabrood CER_B2 Februari 0.091 0.090

Voorgekookte tarwegranen CER_A1 Februari <LOQ <LOQ

Verse pasta CER_C1 Februari <LOQ <LOD

Croutons CER_B7 Maart <LOD <LOQ

Tarwemeel CER_A5 Februari <LOD <LOQ

Bulgur CER_A3 Februari <LOD <LOQ

Roggemeel CER_A6 Februari <LOD <LOQ

Beschuit CER_B6 Maart <LOD 0.019

Rozijnbrood CER_B3 Februari <LOD 0.305

Witte pasta CER_C2 Maart <LOD <LOQ

Speculaas CER_D4 Maart <LOD 0.374

Cornflakes CER_E3 Maart <LOD <LOQ

Volkorenbrood CER_B4 Februari <LOD <LOD

Gnocchi CER_C5 April <LOD <LOD

Grof brood CER_B5 Maart <LOD <LOD

Croissant CER_C2 Maart <LOD <LOD

Cornflakes met chocolade CER_E5 April <LOD <LOD

Quinoa CER_A7 April <LOD <LOD

Volkorenpasta CER_C4 April <LOD <LOD

Havermout CER_E4 April <LOD <LOD

Sandwich CER_B8 April <LOD <LOD

Pagina | 28 Tabel 4.10. Een overzicht van de resultaten uit de matrix “Fruit- en groentesappen, en rozijnen”.

Voedingsproduct Code Maand van

aankoop

Gehalte CIT (ng/g)

Gehalte OTA (ng/g)

Sinaasappelsapconcentraat FRU_C4 April 0.161 <LOD

Sultanarozijnen BIO FRU_F1 Februari 0.114 0.956

Sinaasappelsap FRU_A1 Februari <LOQ <LOQ

Appelsap BIO FRU_A4 Maart <LOD <LOQ

Druivensap BIO FRU_A5 Maart <LOD 0.016

Druivensap (rood) FRU_A7 April <LOD 0.127

Tomatensap FRU_B2 April <LOD 0.085

Cranberry sap FRU_C1 Februari <LOD 0.059

Rode rozijnen BIO (Turkije) FRU_F3 April <LOD 11.290

Appelsap FRU_A6 April <LOD <LOD

Appelsap FRU_A2 Februari <LOD <LOD

Gemengde fruitsap FRU_A3 Februari <LOD <LOD

Wortelsap BIO FRU_B4 April <LOD <LOD

Rode bietensap FRU_B1 Februari <LOD <LOD

Gemengde groentesap FRU_B3 Maart <LOD <LOD

Multi vitamine sap FRU_C3 April <LOD <LOD

Appelsapconcentraat FRU_C2 Maart <LOD <LOD

Sinaasappel-mango-passievruchtensap FRU_D1 Februari <LOD <LOD

Multi vitamine nectar FRU_E1 Maart <LOD <LOD

Tabel 4.11. Een overzicht van de resultaten uit de matrix “Alcoholische dranken”.

Voedingsproduct Code Maand van

aankoop

Gehalte CIT (ng/g)

Gehalte OTA (ng/g)

Witte bier ALC_A2 Maart <LOD <LOQ

Rode wijn (Pays d'Oc) ALC_B3 Maart <LOD <LOQ

Appelcider ALC_B4 Maart <LOD <LOQ

Lager ALC_A1 Februari <LOD <LOD

Fruit bier: framboos ALC_A3 April <LOD <LOD

Witte wijn ALC_B1 Februari <LOD <LOD

Witte wijn Sauternes ALC_B5 April <LOD <LOD

Sauternes ALC_B2 Februari <LOD <LOD