University of Groningen
Human cell-based in vitro systems for vaccine evaluation
Tapia Calle, María Gabriela
DOI:
10.33612/diss.100812074
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2019
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Tapia Calle, M. G. (2019). Human cell-based in vitro systems for vaccine evaluation. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.100812074
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Appendix
Samenvatting
List of publications
Curriculum Vitae
Appen
dix
Samenvatting
Samenvatting
Vaccinatie tegen virussen en bacteriën heeft in de afgelopen eeuw(en) talloze levens gered en daarmee de volksgezondheid ingrijpend veranderd. Dankzij vaccins zijn ziekten als poliomyelitis, tetanus, difterie, mazelen, en kinkhoest in belangrijke mate teruggebracht in incidentie en zijn de pokken zelfs uitgeroeid. En meer recent zijn succesvolle vaccinaties ter voorkóming van hepatitis (A en B), meningitis en pneumonie ingevoerd. Echter het ontwikkelen van vaccins is een tijdrovend en kostbaar proces, onder andere omdat vaccinkandidaten regelmatig falen in klinische trials, terwijl ze eerder wel succesvol bleken in proefdieren. De noodzaak een alternatieve methode te ontwikkelen om vaccins te screenen vóór ze doorstromen naar klinische evaluatie is daarom groot.
Ontwikkelingen op het gebied van de ‘systems vaccinology’ hebben het onlangs mogelijk gemaakt om in gevaccineerde individuen genexpressiepatronen te identificeren die de sterkte van een immuunrespons kunnen voorspellen. Deze innovatieve aanpak brengt ons dichterbij een zogenaamd ‘rationeel vaccinontwerp’. Systems vaccinology heeft o.a. aangetoond dat immuuncellen in het bloed belangrijke bronnen van informatie zijn en dat vroege reacties van deze cellen op een vaccin gebruikt kunnen worden om bijvoorbeeld de aard en de sterkte van de respons te voorspellen. Dit suggereert dat responsen van witte bloedcellen, preciezer perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC’s), op vaccins potentieel informatie kunnen geven over immunologische eigenschappen van vaccins in het algemeen. In dit proefschrift hebben we dit idee gebruikt om een in vitro systeem te bouwen dat gebaseerd is op witte bloedcellen van de mens en ons in staat stelt om vaccinkandidaten te beoordelen.
Om een in vitro evaluatiesysteem voor vaccins te ontwerpen hebben we gekozen voor een aanpak waarin we verschillende componenten van de immuunrespons trachten te ontleden door effecten op verschillende typen immuuncellen te bestuderen. Als modelantigenen gebruiken we ‘whole inactivated virus’ (WIV) en subunit (SU) influenza vaccin formuleringen. In Hoofdstuk 2 hebben we ons gericht op antigeen
presenterende cellen (APCs) en het bestuderen van aangeboren (niet-specifieke) immuunresponsen van deze cellen op vaccins. APC’s, de eerste verdedigingslijn tegen pathogenen, bevatten receptoren die lichaamsvreemde microbiële componenten detecteren. Deze cellen spelen niet alleen een essentiële rol in het controleren van de spreiding van pathogenen; maar ze zijn, zoals de naam al aangeeft, essentieel voor de presentatie van antigenen gepaard gaand met een opregulatie van co-stimulerende moleculen en de secretie van cytokinen. Dit kan leiden
tot activatie en differentiatie van adaptieve (verworven) immuuncellen, T- en B-cellen. Dendritische cellen (DC) staan bekend als professionele APC’s doordat zij het aangeboren en het verworven immuunsysteem met elkaar verbinden, onmisbaar zijn bij het activeren van naïeve T cellen, en een cruciale rol spelen in het bepalen van de sterkte en de aard van de adaptieve immuunrespons.
Onze eerste keus voor de ontwikkeling van een APC-gebaseerde module voor vaccinevaluatie was om een cellijn te gebruiken. Echter, zelfs de meest veelbelovende DC-achtige cellijn, MUTZ-3, bleek ongeschikt voor onze doelstellingen. Daarom besloten we te werken met DC’s afkomstig van monocyten (MoDC’s) uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s). Hoewel de isolatie van monocyten en differentiatie tot DC’s een arbeidsintensief proces is, is de reactie van deze cellen waarschijnlijk meer vergelijkbaar met die van DCs in vivo. De variatie in primaire DC’s tussen donoren biedt daarnaast ook de mogelijkheid om de heterogeniteit in responsen op vaccins te bestuderen.
MoDC’s bleken, in tegenstelling tot de MUTZ-3 cellen, een geschikt platform voor de screening van immunogene eigenschappen van vaccinkandidaten. MoDC’s blootgesteld aan WIV en SU vaccins vertoonden vaccin-specifieke responspatronen. WIV stimuleerde de expressie van genen die geassocieerd zijn met virale immuunresponsen, zoals MYD88, IRF7 en STAT1. Daarnaast kon WIV co-stimulerende moleculen op het DC oppervlak, zoals MHCII, CD80 en CD86 opreguleren, en cytokine-productie induceren, terwijl SU een vrij matige capaciteit vertoonde om zulke aangeboren (niet-specifieke) immuunresponsen te induceren. De effecten van WIV en SU op menselijke DC’s in vitro waren in overeenstemming met voorgaande resultaten van in vitro muis DC modellen en klinische studies. Tot slot hebben we aangetoond dat vers geïsoleerde en bevroren PBMC’s gebruikt kunnen worden voor het genereren van MoDC’s, waarbij beiden evengoed functioneerden. Dit geeft aan dat het mogelijk is om voorraden van PBMC’s ingevroren te bewaren voor later gebruik zoals het herhalen van testen met nieuw materiaal en het uitvoeren van additionele onderzoeken. Deze resultaten versterken de praktische haalbaarheid van een MoDC platform voor het testen van vaccins te testen.
Met het op MoDC’s-gebaseerde in vitro platform hebben we nu een nuttig hulpmiddel in handen om vaccineffecten op APCs te bestuderen, werkingsmechanismen van vaccins te achterhalen en in vivo reacties op nieuwe vaccinfomuleringen in te schatten.
Vervolgens richtten we ons op verworven (adaptieve) immuunresponsen. Deze vinden plaats na DC-stimulatie. In tegenstelling tot aangeboren
Appen
dix
Samenvatting
immuunresponsen, die snel gegenereerd worden na contact met pathogenen maar niet specifiek zijn, komen adaptieve responsen langzaam op gang. Tegelijkertijd zijn ze echter specifiek en in staat om een immunologisch geheugen op te bouwen. Het uiteindelijke doel van vaccinatie is het genereren van antigeen-specifieke (geheugen) immuunresponsen. Om dit te bereiken, bootsen vaccins de processen na die optreden tijdens een infectie. Voor vele infectieziekten (bv. HIV, malaria, tuberculose, hepatitis en influenza), blijken T-cel gemedieerde responsen essentieel te zijn voor een optimale immuunbescherming. Derhalve zouden vaccins idealiter naast de productie van antilichamen te induceren ook T cellen moeten activeren: (geheugen) cytotoxische T cellen (CTL’s) die geïnfecteerde cellen kunnen herkennen en doden, (geheugen) T-helper cellen die het juiste type respons teweeg brengen en folliculaire T-helper (TFH) cellen. TFH cellen hebben een direct effect op de generatie en het behoud van ‘germinal centers’, welke nodig zijn voor adequate B-cel activatie en daarmee voor de vorming van antilichamen met een hoge affiniteit.
Met dit in ons achterhoofd hebben wij in Hoofdstuk 3 een in vitro platform
ontwikkeld om vaccin-geïnduceerde T-cel responsen te meten. T-cel responsen op vaccins zijn in het verleden in vitro onderzocht, door gebruik te maken van DC-T cel co-kweken, waarbij DC’s gegenereerd werden uit (menselijke) PBMC’s. Deze werden gecombineerd met het antigen en later in contact gebracht met autologe T-cellen [47-51]. Deze methode blijkt echter vrij tijdrovend te zijn. Dit is de reden dat wij hebben onderzocht of vaccineffecten op T-cellen ook gemeten kunnen worden in langdurige kweken van ongefractioneerde PBMC’s. Naast het feit dat deze methode simpeler en rechtdoorzee is, maakt deze aanpak gebruik van een mengeling van meerdere typen immuun cellen, wat voordelig kan zijn voor optimale T-cel activatie.
Met dit in vitro platform toonden we aan dat wanneer PBMC’s gestimuleerd worden met geschikte vaccins, het aantal influenza antigen-specifieke T-cellen na verloop van tijd toeneemt. Daarnaast namen de T cellen een geactiveerd fenotype aan en produceerden ze IFNγ en de cytotxiciteitsmarker CD107. Dit sluit aan op het gegeven dat onze bloeddonoren hoogstwaarschijnlijk ooit blootgesteld zijn geweest aan influenza; de responderende cellen zijn dus waarschijnlijk geheugen T-cellen. Verdere typering van de responderende T-cellen onthulde inderdaad dat deze bijna allemaal de geheugenmarker CD45RO tot expressie brachten. Daarbij vertoonden de CD4 memory T cellen merendeels een effector memory (EM) fenotype terwijl de CD8 memory T cellen merendeels een ‘central memory’ (CM) fenotype hadden. Interessant is dat ook circulerende TFH-cellen na blootstelling aan vaccins reageerden
met een toename van ICOS+CD4+CXCR5+ cellen en IL-21 productie. Het aantal en de activatiestatus van de circulerende TFH-cellen vroeg na vaccinatie blijkt richtinggevend te zijn in latere antilichaam responsen. Daarom is het van groot belang dat met behulp van het hier ontwikkelde in vitro systeem vaccineffecten op deze celpopulatie in vitro bestudeerd kunnen worden.
Door WIV en een split influenza vaccin te gebruiken, zagen we ook dat de T-cellen in ons in vitro platform op verschillende manieren reageerden op verschillende vaccinformuleringen met dezelfde antigenen. Beide vaccins waren even potent in het activeren van CD4+ en CD8+ T-cellen en T
FH -cellen, en in het induceren van IFNγ productie in CD4+ cellen. Echter, WIV bleek superieur te zijn ten aanzien van het split vaccin in de activatie van IFNγ productie in CD8+ T-cellen; voornamelijk in T
CM en TEM. Deze bevinding kwam overeen met onze verwachtingen, aangezien WIV bekend staat als een sterke activator van DC’s, zoals is aangetoond in Hoofdstuk 2.
Daarnaast heeft WIV het vermogen om antigen direct in het cytoplasma te transporteren van waar het makkelijk toegang heeft tot de MHC-klasse I presentatie route.
Derhalve blijkt het ontwikkelde in vitro T cel platform gedetailleerde informatie te kunnen verschaffen ten aanzien van vaccineffecten op verschillende T-cel populaties, inclusief TFH-cellen, welke bepalend zijn voor antilichaamresponsen. Daarmee kan het platform een waardevol middel zijn om inzicht te krijgen in werkingsmechanismen van vaccins en voor het selecteren van veelbelovende vaccinkandidaten. Dat laatste geldt in ieder geval wanneer de vaccins antigenen bevatten waartegen de bloeddonoren reeds geheugen T cellen hebben.
In Hoofdstuk 4, toetsen we de mogelijkheid om het ontwikkelde in vitro
systeem te gebruiken om vaccins gemaakt van verschillende influenza virus subtypen te evalueren en te vergelijken. Zoals bekend uit preklinische en klinische trials, verschillen influenza vaccins, die verkregen zijn vanuit verschillende virus subtypen, van elkaar in immunogeniciteit. Virusstam-gerelateerde verschillen in immunogeniciteit hebben belangrijke consequenties voor vaccinformuleringen. Voor laag immunogene virus subtypen is het wellicht noodzakelijk om een hogere hoeveelheid antigen te gebruiken of een adjuvans toe te voegen om voldoende bescherming te bewerkstelligen. Eerdere onderzoeken rapporteerden dat intrinsieke eigenschappen van de respectievelijke virussen verantwoordelijk zijn voor de geobserveerde virusstam-specifieke verschillen in immunogeniciteit. Echter, de in deze studies gebruikten vaccins waren niet op dezelfde wijze geproduceerd, waardoor een betrouwbare vergelijking niet gemaakt kon worden. Doel van dit hoofdstuk was derhalve om meer inzicht te krijgen
Appen
dix
Samenvatting
in verschillen in immunogeniciteit tussen verschillende influenza virus subtypen.
Hiervoor gebruikten we WIV en SU vaccins die gemaakt waren uit H1N1pdm09, H3N2, H5N1 en H7N9 influenza virus subtypen, en werden geproduceerd onder gestandaardiseerde omstandigheden. Eerst richtten we ons op de fysisch-chemische eigenschappen van de vaccins; vervolgens evalueerden we hun immunologische eigenschappen door in vitro en in vivo benaderingen toe te passen. Met betrekking tot WIV, toonden onze vergelijkingen evidente fysisch-chemische en immunologische verschillen, die het onderscheid van hoog (H5N1), intermediair (H1N1pdm09, H3N2) en laag (H7N9) immunogene influenza virus subtypen mogelijk maakten. Voor SU vaccins waren er echter minder subtype-gerelateerde verschillen te vinden. Door de immunologische effecten van de verschillende virale subtype vaccins in vitro en in vivo te vergelijken, waren we ook in staat om te onderzoeken in hoeverre resultaten verkregen met de in vitro platformen (Hoofdstuk 2 en 3) een voorspellende waarde hadden voor
de in vivo responsen. In vivo en in vitro resultaten correleerden goed met elkaar, wat de bruikbaarheid van de ontwikkelde in vitro platformen verder onderstreept.
Concluderend, dankzij deze vergelijkende studie kwamen we tot waardevolle inzichten wat betreft intrinsieke verschillen in immunogeniciteit tussen vaccins verkregen vanuit verschillende influenza virus subtypen. Deze inzichten zullen helpen in het verbeteren van matig immunogene influenza vaccins doordat toekomstige experimenten zich nu kunnen richten op het versterken van responsen tegen zwak immunogene virus subtypen, bijvoorbeeld door het gebruik van adjuvansen. Daarnaast onderstrepen de verkregen resultaten de geschiktheid van ons in vitro systeem als dierproefvrij screeningssysteem voor de evaluatie van vaccins. Tot slot, beschrijven wij in Hoofdstuk 5 het gebruik van het T-cel in
vitro platform om te beoordelen of de immunogeniciteit van een vaccin verbeterd kan worden door bepaalde afleversystemen te gebruiken en de grootte van de vaccinpartikels te veranderen. Zoals we laten zien in
Hoofdstuk 2, zijn SU vaccins, die bestaan uit oplosbare eiwitten, matig
immunogeen. Het gebruik van een adjuvans kan de immunogeniciteit verbeteren. Adjuvansen kunnen zowel de inductie van immuunresponsen versterken als deze modificeren. De beschikbare adjuvansen worden geclassificeerd in systemen die het immunsysteem activeren en specifieke antigen-afleversystemen. Antigen-afleversystemen bestaan uit partikels die variëren in grootte van nano- tot micrometer en kunnen zorgen voor het transport van gebonden of ingekapselde antigenen naar APC’s. Verscheidene studies hebben aangetoond dat het mogelijk is om het type
immuunrespons (TH1, TH2) te sturen door de grootte, vorm of rigiditeit van het antigen-afleversysteem te beïnvloeden. In dit hoofdstuk gaan we in op de vraag in hoeverre manipulatie van de grootte van een afleversysteem de antigenopname door menselijke moDC’s en daardoor de stimulatie van humane T-cellen kan beïnvloeden. Het laatste werd onderzocht met behulp van het boven beschreven T-cel platform.
Voor dit onderzoek gebruikten we twee verschillende vaccins, influenza SU en Hepatitis-B oppervlakte antigen (HBsAg), die gekoppeld werden aan nano- of micro-polystyreen partikels (diameter 0.5 en 3 μm). Microscopische observaties toonden dat nano- en micropartikel- gekoppelde vaccins en ongeconjugeerde vaccins even efficiënt opgenomen konden worden door DC’s. Desondanks vonden we met behulp van ons in vitro T-cel platform dat influenza SU vaccin gekoppeld aan 3 μm partikels een (licht) sterker vermogen tot T cel activatie had dan ongeconjugeerd SU-influenza vaccin. Dit werd duidelijk uit een toegenomen aantal cytokine-producerende CD8+ T-cellen en grotere hoeveelheid van geproduceerde cytokinen. Daarentegen beïnvloedde de koppeling van HBsAg aan polystyreen partikels de sterkte van de T-cel responsen niet, behalve dat het aantal IFNγ- en IL10-producerende T-cellen geïnduceerd door HBsAg gekoppeld aan 3 µm beads lichtelijk hoger was dan gevonden met vrij HBsAg.
Al onze bloeddonoren waren zeer waarschijnlijk meerdere malen blootgesteld aan influenza. Hun PBMC’s bevatten influenza-specifieke geheugen T-cellen die na blootstelling aan een influenza vaccin in vitro snel geactiveerd werden. Daarentegen bevatten de PBMC’s geen HBsAg-specifieke geheugen T-cellen. Desalniettemin, konden we in een aantal donoren enige T-cel responsen tegen HBsAG detecteren. Hoewel we nog niet weten of deze responsen gemedieerd waren door naïeve of geheugen T-cellen kan dit suggereren dat het ontwikkelde in vitro platform niet alleen geschikt is om vaccineffecten op geheugen T-cellen te bepalen, maar ook om het vermogen van een vaccin tot activatie van naïeve T-cellen te bestuderen.
Concluderend kunnen we vaststellen dat de grootte van influenza en Hepatitis-B vaccins een meetbaar effect op de inductie van T-cel responsen had. Echter was het effect klein waardoor de biologische relevantie ervan twijfelachtig is.
In Hoofdstuk 6 belichten we allereerst de redenen om te zoeken naar
dierproefvrije alternatieve methoden voor de ontwikkeling van vaccins. Daarnaast wordt een samenvatting van alle bevindingen van dit proefschrift gegeven. Tevens worden de beperkingen en de uitdagingen van de verrichte onderzoeken besproken, en worden de mogelijkheden voor verdere ontwikkeling van in vitro vaccinevaluatiesystemen besproken.
List of publications
Appen
dix
List of Publications
1. Herrera Rodriguez*, Tapia-Calle G*, Guilfoyle K, Born PA, Engelhardt, O,
Hinrichs W, Huckriede A. A systematic comparison of different influenza vaccines reveals intrinsic differences in immunogenicity among H1, H3, H5 and H7 virus subtypes. (Ready for submission)
2. Tapia-Calle G, Born PA, Koutsoumpli G, Gonzalez-Rodriguez M.I.,
Hinrichs W, Huckriede A. Establishment of an in vitro system to assess T cell responses to vaccines. (Submitted)
3. Tapia-Calle G, Stoel M, de Vries-Idema J, Huckriede A. (2017) Distinctive responses in an in vitro human dendritic cell-based system upon stimulation with different influenza vaccine formulations. Vaccines
9;5(3).
4. Ramirez JD, Tapia-Calle G, Guhl F. (2013) Genetic structure of Trypanosoma cruzi in Colombia revealed by a high-throughput nuclear multilocus sequence typing (nMLST) approach. BMC Genetics 14:96.
5. Ramirez JD, Tapia-Calle G, Munoz-Cruz G, Poveda C, Rendon LM, Hincapie
E, Guhl F. (2013) Trypanosome species in neo-tropical bats: biological, evolotionary and epidemiological implications. Infection, Genetics and
Evolution 22:250-6
6. Ramírez JD, Turriago B, Tapia-Calle G, Guhl F. (2013) Understanding the role of dogs (Canis lupus familiaris) in the transmission dynamics of Trypanosoma cruzi genotypes in Colombia. Veterinary Parasitology
Curriculum Vitae
Gabriela was born in Santiago de Chile and when she was only 2 years old, her parents decided to move to Bogota, Colombia, where she was raised - that’s why she sometimes has some cultural identity issues. She studied in the Colombo American School and then, following her scientific desires she did a bachelor in Biology at la Universidad de Los Andes. After finishing her bachelor, she moved to the Netherlands looking for a more challenging opportunity (not necessarily a more challenging weather, but that came too) as well as for new insights both culturally and scientifically. In 2012, she started her masters in Medical and Pharmaceutical Drug Innovation at the University of Groningen. Here, her first internship was under the supervision of Prof. Dr. Marianne Rots, dealing with epigenetic editing and cancer in a project titled “Enhanced DNA methylation by Tet2 enzymes”. Her second internship, she did under the supervision of Prof. Dr. Anke Huckriede to work with vaccines, which is actually what she is most passionate about. During this internship she worked on a project called “Distinctive responses in an in vitro DC-based system upon stimulation with influenza vaccines”. At the end of her masters, she had the opportunity to design and write a PhD proposal together with Prof. Huckriede and got rewarded with a PhD scholarship. Her work dealt with the establishment of an in vitro system to assess responses to vaccines. Ideally, this system could help as a step in between to reduce the use of animals in preclinical experiments and to increase the odds of a vaccine succeeding in clinical trials. The results of this research are presented in this thesis. Since 2019, she has been working as project leader of Research and Development at Vaxxinova International. Still in The Netherlands, still challenged by the weather.
Appen
dix
Acknowledgements
Acknowledgements
Getting to this part of the thesis only means that this chapter in my life is officially closing. It is commonly presumed that PhDs have a great deal of scientific knowledge. However, what people outside academia don’t know, is that more than an ongoing journey of gathering scientific knowledge, this period is mainly an opportunity to learn about yourself and the different ways you unconsciously develop to thrive (especially as a foreigner). In my case, and just like in science, I learnt that life is always better, easier and definitely more fun when you do it in collaboration. And during this PhD, I have been the luckiest person to encounter so many new collaborations and also keep and boost my previous ones. Here, I would like to thank you for being with me throughout this journey, for the knowledge, the guidance, the support, the laughter and more importantly for caring.
Firstly, I would like to thank my promotor. Anke, our journey started not 5
years ago but actually a couple of years before, in 2011. As part of a summer internship, your lab was my first dive into my international experience in The Netherlands. One year after that, I came back to your lab for one of my master internships and thereafter we wrote together a proposal which ended in this thesis. This only means 8 years in your lab (that’s almost 2 PhDs!!!!). Thank you! Thank you for all the time you invested in teaching and in showing me the smart way to do things, for the independence you gave me and for allowing me to grow as a scientist. Thanks for all those scientific and also the non-scientific conversations we had about life during our congresses. Thanks for always keeping a clear and steady mind. Big thanks for all the effort you put in making this thesis a reality on time, for arranging everything and everyone to bring this thesis to completion and more importantly for being a huge emotional support and keeping my mood high when I was feeling things were “just not working”.
I would also like to thank my co-promotor. Toos, your critical input and
your valuable suggestions during our meetings and while reading my manuscripts were very important, they sure made this thesis better. Special thanks to Wouter Hinrichs. Thank you for being so supportive,
pragmatic and always trying to look at the bright side and simple way of things. Although our interaction started mostly at the end of my PhD, your support and reassuring words were very important for me. Jolanda S., thanks for your critical remarks and insightful suggestions. Iza, thank
you so much for always keeping alive the scientific discussions. I really appreciate and enjoyed your insights, feedback and your challenging view about science. Thanks for showing so much enthusiasm and excitement about science, it was always refreshing and empowering .
I sincerely want to thank the reading committee Mieke Boots, Xavier Saelens and Edwin Bremer. I really appreciate the time and effort you
took to carefully read and approve my thesis. Thank you for your valuable comments.
To the Flu group: Marijke, Jacqueline, Maaike, Harshad, Pepe, Aurora
(Bella No. 1), Fede (Bella No.2), Dong Wei, Yoshita, Julia, Tjarko, Rick. First
of all, thanks for allowing me to play my “happy music” in the lab. Also, for the feedback during our meetings and the nice time we had together. Marijke, thanks for always being on top of things and helping me out when I most urgently needed and for being always caring and efficient.
Jacqueline, as with Anke, I feel like our journey started very long ago
during my summer internship. I am so happy I met you and that we could share so many special times (especially during our MLII experiments). I really enjoyed our talks and the way we could always share or views on our lives and also the funny things about each other’s cultures. Thanks a lot for being supportive, and for listening to me when I was not that much in the mood to listen to my “happy music”. Bellas!! Having you in the flu group
brought this kind of “pipiri papari” mood that was full of energy and mostly loud laughter. Auroritza, your laid-back attitude was very comforting when
things were just not working out (not only for you but for all of us). Fede,
your sweetness and kindness were a beautiful thing to have around and gave a very mellow and lovely vibe to the lab. Yoshita, it was always nice
to have lunch when you were around, thanks for being so generous and for preparing amazing food! Pepe, thanks for being so helpful all the time,
and always putting the need of others before yours (I will see you again somewhere, hopefully in Mexico). Bhags and Martin thanks for joining this
project, for bringing important insights and questions that helped develop our experiments but also help me improve my teaching skills. Martinsito,
ours was more a collaboration than anything else, thank you for your critical thinking, for your important input during our discussions and for teaching me that being relaxed is also a way to do things around the lab.
Philip (a.k.a. Filipito), thanks for being a partner in crime, our collaboration
was crucial for this thesis. It did not only give the push it needed, but also, it brought energy, comradery, team effort and lots of laughter… en ook een beetje nederlands! Bedankt voor jouw tijd, voor oefenen met mij, voor het lekker eten en gezellige tijd. It was great to have you as a colleague and to have somebody to rely on or to ask for help when I needed it. Now that this thesis is finished, it’s amazing to still have you as a friend. You are an amazing person and an amazing family man .
To the Molecular Virology group… Ellenita (your way of always looking
Appen
dix
Acknowledgements
for organizing so many things!), Nils (your views and stories were always
different and funny), Denisita (best person to go out on parties and dance
reggaetón with), Shipengsito (you had a great attitude since the moment
you arrived, always outgoing, fun and open), Amritica (your dancing
moves where just impressive!! Best Shakira hips I saw in the Netherlands, and I couldn’t love and support more your attitude towards food!), Jacky
(the medium sized wise fish), Mari (it was always nice to have you around,
good luck in Australia!), Steph (the immunology expert, thanks for the tips
and ideas!) Julia (our official event planner, having you around was a great
way to really push for bonding and doing fun things together), Darshak
and Ana Mile (you joined the lab at the end of my PhD, I hope you are
enjoying this awesome lab), Beritsita (it was fun sharing an office with you,
especially when it was time to sing Christmas carols preferably before or after December ), Ces (thanks for your tips and suggestions, they surely
were helpful when thinking about experiments!), Anne-Marie (probably
the person with always a smile on when saying good morning, thanks a lot for your help and support), Baukye and Heidi (thanks for always being
there willing to help). Thanks for all the nice moments we had together. I really enjoyed our King’s day celebrations, pot dinners and drinks. Jolanda O., I still cannot understand how you manage to be so efficient. Thank you
for always being willing to help and solve all sorts of issues with so much patience and dedication. Beto, I really enjoyed your company and having
the possibility to have scientific discussions. Working late was sometimes frustrating and tiring but somehow our spontaneous and late-night scientific discussions gave me a nice rest and the distraction I needed to continue working.
To the flow cytometry core facility… Geert and Johan (and Roleof and Henk). I probably spent half of my time in FACS. Geert, thanks a lot for all
the time you spend teaching me flow cytometry. I learnt a lot. Also, it was great to be able to talk about non-scientific things. Johan, thanks for your
time and for giving me feedback with my compensations and my analyses and for our conversations during the moments the machines were not responding.
Timmy, Suru, Nshunge. I was very lucky to meet you during our masters
and to have the chance to continue seeing each other during our PhD. I really enjoyed our occasional coffees and small escapes from the lab routine. It was nice and refreshing. Thank you so much for always being there, for helping me out, and for all the nice moments, dinners, parties and BBQs. Herrer and Petri, I was also very lucky to meet you since my
masters, although in a completely different context, de Swinderenstraat Huis!! Thank you so much for the nice moments, the food, the singing
and all the fun we had. Pumpkin, thanks for ALWAYS being there, and for making my problems so relatable for always being so sweet, empowering me and taking care of me! Love you girls!!
To my (mostly) Colombian family, a.k.a in other departments as the Colombian Gang or Latin Mafia: David, Alejo (mis bellezuritas), Jorgito, Esmee, Julito, Ailinesita (mijita bella y querida), Alfred (mi belleza tropical), Marty (loveliest Mexican ever), Mago (pinche norteña de mi corazon), Lils
(la “darks” lilipooh), Vlad, Dieguis, Cris, Genaris, Paola, Andres Q, Maryam, Andres G (Catica P: drenador de energia ), Maria (delegada de JapoM), Javi (amigui), Fifi (best support in Groningen), Nils (best “dutch” support in
Groningen), Mayris (la dura de la ciencia), Mitch, Laura, Tim, Susein, Rebe, Nataly, Angelica (mamichula), Vivi M. (Lindaa!), Nati E., Siriaco (owner of
all bars in Groningen). As inevitable as this was, most of you are now in a better place; COLOMBIA . Your company was the ultimate remedy to my days of frustration - it was actually the best remedy to anybody feeling a bit down. Also, being with you was the best way to celebrate with and (in most of the cases) without a reason. I really miss our spontaneous picnics, dinners and parties and being able to just laugh about everything. Having all of you in Groningen, made this city felt like home (like a very cold home…!). I hope we can repeat a finca plan again, and maybe, with the help of our MSL friends we will celebrate “por lo alto! Tas tas tas!”. Los extraño y Los quiero!!
David and Alejo, mis bellezuritas, you have been one of the best gifts life
put me in the way. Who would have thought that 2 very weird “uniandinos” looking for friends in Groningen would become so important in my life? I will be forever grateful for your support and the way you took care of me when I needed it the most. Thanks for all the PP (pizza y pelicula) and the RR (rosé y reggaetón) nights. Thanks for being my family, for teaching me basic Colombian things, for supporting me and for being the loveliest friends. Thanks for your honesty and your unconditional love throughout these years. I am very proud of you guys and what you have done with your relationship and your professional career. ¡¡¡Quiero ser como ustedes!!! Monguis!!! Deividsini, Maru, Diani, Juanis and Sebas… It’s been more than
10 years since we met, and it’s amazing to see that our friendship is still the same every time we get together. I am very happy and thankful that life has kept us close to each other so we can always celebrate and support each other when we need it the most Los quiero monguis!!! Linis y Vane,
despite the distance we have always have each other, in the moments we needed to talk, laugh or just for gossips. Im very grateful for still having you around and to know I can always count on you! Las quieroo!!
Appen
dix
Acknowledgements
Vergui y Lauri, Cachorritas….!! Nuestros encuentros cachorristicos fueron la
mejor fuente de energía durante los “lows” del PhD. Volver al lab después de un fin de semana cachorristico era casi tan eficiente como tener 3 semanas de vacaciones. Me siento muy feliz de tenerlas como amigas y de poder compartir cosas simples de la vida (di tu, KFC, DM, Gin Tonics, desayunos a la Taylor (thank you Taylorsito!), etc). Gracias por hacerme
miembro honorario de las cachorras del imperio por escucharme, aconsejarme, preocuparse y por siempre estar ahí pendientes. Las quiero mucho.
My G’s!!!! Georgia and Guido. I cannot thank you enough!!! Not only for
being my paranymphs (although I know is not the nicest job), but for being so unconditional and amazing. Since our masters we clicked and we managed to build up this beautiful friendship. It has been great to share so many moments together and to always feel the support from you guys. I know that I can always count on you. Thank you for being part of my life in Groningen and for making it possible to build up so many memorable moments. Sweetie pie, Georgita, Γεωργία, thank you so much
for being a great support and for always being there for me in the good and in the bad moments. Thanks for opening the doors of your home and your family and for making me part of it (lots of love and filakia to
Christinita, Elefterito, Kostantinito, and of course lovely Victorakas).
From the beginning, you guys always felt like my adoptive Greek family. I feel very grateful for having you in my life, and also for having had the opportunity to spend so much time together. Life made sure we enjoyed each other’s company to the maximum. Thanks for being the best office mate one could ask for (one with a constant stash of chocolate and teas), for the best yoga partner, especially when we were not that much in the shavasana or the “love your boDie” mood, the best gin tonic partner, or even the best “sparkling water buddy” (the latter was restricted only to those days when we REALLY wanted to go crazy and celebrate). I love you so much!! Guidin, simplemente gracias. Gracias por ser un hombre
autentico (a veces un poco lleno de si mismo) pero así y todo autentico y honesto. Gracias por todo el apoyo y los consejos que me has dado. Por estar SIEMPRE pendiente y presente en las buenas y en las malas. Por aguantarnos a Georgia y a mi y por darnos animo cuando sentíamos que todo pintaba mal. Con el tiempo, he aprendido que ese argentino creído que conocí el primer día del master es una de las personas más lindas de corazón que conozco, de las más generosas, honestas y amorosas. Gracias por estar siempre ahí Guidito, por aguantarme en mis buenos y mis malos momentos y por ser un apoyo incondicional. Ven a visitarme más seguido ! Te quiero un montón!!
Jens. Lindito…. Much of this thesis was thanks to your patience, support
and scientific/geek input. Thank you! Thank you for understanding all my late nights and weekends of lab work, and for sacrificing your time just to accompany me when I only had time to work. Thank you for always giving me your feedback, discussing with me experiments and for checking parts of this thesis. Your feedback was always very insightful and to the point. I am very grateful for your geeky enthusiasm, good spirit and true love for science, these attitudes were very important when I was not feeling very scientish-like and really kept me going. I admire your excitement, which was (and still is) very contagious. As much of my personal scientific support, since the moment we met, you have been my rock for everything. I always feel like a you are my biggest fan, always believing in my ideas, my dreams and my capacities, rooting for me no matter what. For that, thank you! I feel very grateful and lucky to share my life with you, you are the most kind-hearted, generous and humble man I know. Thank you for all your love and for putting everything of you to make things work. Thanks for being my partner and for your unconditional and infinite love. ¡Te amo lindito! Also, big thanks to Gudula, Jürgen and Marc, thanks for always
being there willing to help me in any way possible, for your support and for making me feel like home!
Finally, the biggest of all acknowledgements go to my lovely family, who are the reason I have managed to get where I am and who have constantly supported and empower me to be the person that I am. Mama, Papa y Nene, esta tesis es el resultado de su apoyo, de su confianza en mí y de su amor, esta tesis es para ustedes. No hay palabras para decir lo feliz y afortunada que soy por tener una familia como la nuestra. Todo su amor, alegría y fuerza han sido motores fundamentales para mi desarrollo personal y profesional, y sé que sin su amor y apoyo incondicional no hubiera llegado a este punto de mi vida. Mami, gracias por siempre estar
acompañándome desde la distancia, por llenarme de energía positiva, por escucharme cuando lo necesito y por siempre estar pendiente de esos pequeños detalles, “porque la vida está hecha de pequeños detalles”.
Papi, tu humor durante situaciones difíciles y no tan difíciles siempre me
alegra la vida y me llena de energía y por eso siempre estoy intentando
“ponerle COLOR a la vida”. Gracias por ser ese apoyo incondicional, y
ayudarme a poner cabeza fría en los momentos de tensión. Nenesito, tu
eres simplemente la mezcla perfecta entre los papas, y con tu autenticidad y chispa siempre tienes las palabras necesarias en el momento preciso. Gracias por siempre llenarme de consejos tan ajenos a mi campo de acción, pero tan relevantes para la vida real, simplemente gracias por ser un polo a tierra y darme perspectiva. Los amo con todo mi corazón.
Appen
dix
