Chronische sediment toxiciteittest met de slijkgarnaal Corophium volutator
Trefwoorden: Amphipode, slijkgarnaal (Corophium volutator), sediment, chronische toxiciteit, groei, reproductie, mortaliteit
Inhoud
1. Onderwerp,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,*
2. Toepassingsgebied,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,*
3. Termen en definities,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 4. Principe van de methode,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,#
5. Reagentia en hulpstoffen,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,#
6. Apparatuur en hulpmiddelen,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,- 7. Monstername,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,.
., / ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,.
.,* / ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,.
8. Werkwijze,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,.
0, " ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,.
0,* ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0
0, " ! ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0
0,+ / & % ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,)
0,# ' 1 2 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 0,- 3 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, # 0,. ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, - 9. Berekeningen,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, -
), 2 ! %,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, -
),* 4'# 2 5& ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, -
), ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, .
),+ 6 7,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, .
10. Rapportage,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 0 11. Kwaliteitszorg,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ) 12. Veiligheid,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,*
13. Achtergrond informatie,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,*
14. Bijlagen,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,**
Ministerie van Verkeer en Waterstaat Directoraat -Generaal Rijkswaterstaat
Rijksinstituut voor Kust en Zee/RIKZ
*
1. Onderwerp
Dit voorschrift beschrijft de methode voor het uitvoeren van een chronische sediment toxiciteittest met de bentische amphipode Corophium volutator, de slijkgarnaal. De slijkgarnaal speelt een belangrijke rol in de bentische voedselketen van estuariene en mariene milieus en fungeert als voedselbron voor o.a. vissen, vogels, garnalen en krabben. De organismen hebben een grote tolerantie voor zoutgehalte, zuurstofgehalte en temperatuur. De slijkgarnaal leeft in verticale U-vormige buisjes en foerageert op kleine (organische) deeltjes op het sedimentoppervlak. Het principe van de chronische toxiciteittest is als volgt: juveniele slijkgarnalen van maximaal zeven dagen oud worden gedurende 49 dagen blootgesteld aan (gecontamineerd) veldsediment.
De toxiciteit van het sediment kan worden bepaald door het aantal overlevende slijkgarnalen, de groei en de reproductie te bepalen. Het percentage mortaliteit wordt uitgedrukt als aantal doden en vermisten t.o.v. het aantal ingezette organismen. De reproductie wordt uitgedrukt als het gemiddeld aantal juvenielen per overlevend vrouwtje.
De groei wordt uitgedrukt als gemiddelde lengte toename van de ingezette organismen tijdens de testperiode.
2. Toepassingsgebied
Met behulp van dit standaard voorschrift kan de chronische toxiciteit worden bepaald van sediment uit het mariene en estuariene milieu met een saliniteit van het poriewater tussen 5 – 35 promille. Slijkgarnalen vertonen een brede tolerantie voor slibgehalten, zodat hiervan geen negatieve effecten zijn te verwachten. Wel dient de textuur van het sediment stevig genoeg te zijn om de slijkgarnalen over het oppervlak te laten kruipen en moeten ze in staat zijn tot het bouwen van woonbuizen in het sediment. Bij een te slappe textuur dient het vochtgehalte van het sediment verlaagd te worden.
3. Termen en definities
Acclimatiseren : Het aanpassen van een testorganisme aan de omstandigheden die gelden in het laboratorium en tijdens de bioassay.
Bentisch : Levend op of in de waterbodem
Bioassay : Gestandaardiseerd laboratoriumexperiment waarin levende testorganismen worden blootgesteld aan een milieumonster om negatieve effecten van aanwezige stoffen op deze organismen te bepalen.
Compartiment : Deel van een testsysteem of sediment.
Contaminatie : Vervuiling van een compartiment met bijvoorbeeld zware metalen en/of organische microverontreinigingen
Controlesediment : Sediment dat dient als kwaliteitscontrole voor de respons van de testorganismen en testopstelling.
EC50 : ‘Effect Concentration’. De toxicant concentratie waarbij 50% van de testorganismen een bepaald effect ondervindt bij een bepaalde blootstellingduur.
Groei : Gemiddelde toename van lengte in mm/dag Juvenielen : Jong organisme
LC50 : ‘Lethal Effect Concentration’. De concentratie van een toxicant waarbij 50% van de testorganismen dood gaat bij een bepaalde
blootstellingduur.
LOEC : ‘Lowest Observed Effect Concentration’. De laagste concentratie van een toxicant waarbij een waarneembaar significant effect optreedt in de bioassay.
Mortaliteit : Sterfte van het testorganisme. De mortaliteit wordt meestal uitgedrukt als percentage ten opzichte van de inzet.
NOEC : ‘No Observed Effect Concentration’. De hoogste concentratie van een toxicant waarbij geen waarneembaar significant effect optreedt.
Overleving : De nog levende testorganismen na blootstelling aan gecontamineerd sediment.
+
Randvoorwaarden : Binnen de experimentele situatie geldende afgebakende grenzen voor saliniteit, temperatuur, ammoniumgehalte, pH en zuurstofgehalte, waarbinnen het experiment als betrouwbaar wordt beschouwd.
Referentietoxicant : Toxische stof waarmee de gevoeligheid van de gebruikte
testorganismen wordt vastgesteld. Hiervoor wordt vaak de LC50 of EC50
bepaald in een waterfasetest (met bijv. ammoniumchloride) Reproductie : Voortplanting
Vitaliteit : Levensvatbaarheid
#
4. Principe van de methode
Testorganismen worden gedurende 7 weken blootgesteld aan (gecontamineerd) sedi- ment. De toxiciteit van het sediment wordt bepaald door het aantal overlevende oorspronkelijk ingezette testorganismen te tellen en de sekse en evt. de lengte hiervan te bepalen. Tevens wordt het aantal juvenielen geteld. Vervolgens kan de overleving en evt.
de groei van de oorspronkelijk ingezette organismen worden bepaald en het aantal geboren juvenielen per overlevend vrouwtje.
Veldsedimenten worden in vijfvoud getest. Bij het testen van een concentratiereeks van gespiked sediment volstaat een uitvoering in drievoud.
De test wordt standaard uitgevoerd bij een zoutgehalte van 15 promille, maar kan ook met andere saliniteiten worden uitgevoerd. Wanneer een andere saliniteit wordt genomen, dan moeten alle stappen in dit protocol met deze saliniteit worden uitgevoerd (dit geldt ook voor het te gebruiken zeefwater voor sediment). In dit geval moet er naast de blanco met aangepaste saliniteit ook een controle monster worden meegenomen met de standaard saliniteit van 15 promille ter controle van de geldigheidscriteria.
De eerste drie weken wordt de test uitgevoerd in accubakken of glazen aquaria. Na deze periode worden de slijkgarnalen overgezet in bekerglazen tot het einde van de test. (Zie tijdschema, bijlage 6)
5. Reagentia en hulpstoffen 5.1 Zoutzuur 37%
5.2 Demiwater
5.3 Gefiltreerd zeewater
5.4 Dutch Standard Water, DSW 5.5 Lucht
5.6 Ammonium chloride oplossing (NH4Cl), van een bepaalde hoeveelheid ammonium chloride opgelost in demiwater.
5.7 Ammoniumtest (meetbereik: 0,02 – 15,0 mg NH4+/l, op 0.1 mg/l nauwkeurig, detectiegrens 0,02 mg/l)
5.8 Nitriettest (meetbereik 0,1 – 20 mg NO2-/l, op 1 mg/l nauwkeurig, detectiegrens 0,1 mg/l) (optioneel)
5.9 Formaline 4% (een oplossing van formaline 37% verdund met zeewater tot 4%) 5.10 Visvoer, bijvoorbeeld Yady of TetraMin
5.11 Gefiltreerd zeewater 15 ‰ (d.w.z. zeewater vermengt met DSW tot het juiste promillage).
Indien gewenst kunnen ook andere saliniteiten worden aangemaakt.
-
6. Apparatuur en hulpmiddelen
6.1 Klimaatkamer van 17 ± 2°C met temperatuurregistratie.
6.2 Polyethyleen vaten (± 25 l) met deksel
6.3 Platte opslagbakken voor het kweken van slijkgarnalen (ongeveer 40 x80 cm) 6.4 Bekerglazen (1 liter), borosilicaatglas
6.5 Accubakken of glazen aquaria (ongeveer 5 liter), met druppelsgewijze doorstroommogelijkheid
6.6 Rollenbank, mixer of mengmolen 6.7 Beluchtingspomp
6.8 Luchtfilter
6.9 Vortex magneetroerder met magneet 6.10 Vijzel
6.11 Kleine bekerglazen (± 50 ml) 6.12 Zuurstofmeter
6.13 Saliniteitsmeter 6.14 pH-meter 6.15 Pasteurpipetten
6.16 Zachte pincet met platte punten 6.17 Plastic wegwerp pipetten (5 ml) 6.18 Zeef 250 µm
6.19 Zeef 500 µm 6.20 Zeef 1000 µm 6.21 Horlogeglazen 6.22 Bekerglazen (100 ml) 6.23 Pipet 1 ml
6.24 Pipet 10 ml
6.25 Roestvrijstalen of kunststof schaal 6.26 Spectrofotometer
6.27 Binoculair 6.28 Koudlichtbron
6.29 Digitale fotocamera passend op binoculair 6.30 Plunjer
6.31 Petrischalen
6.32 Slang met fijn gaasfilter aan een zijde.
6.33 Temperatuurmeter
.
6.34 Acclimatisatie inrichting met druppelsgewijs doorstroomsysteem voor 15 promille zeewater 7. Monstername
Bemonstering van sediment
Bij bemonstering van sediment is het van belang dat uitsluitend sediment uit de toplaag van maximaal 25 cm diep wordt verzameld. Deze bemonstering dient uitgevoerd te worden met een van Veenhapper, steekbuizen of ander geschikt materiaal. Het sediment dient vervolgens te worden opgeslagen bij een temperatuur van ca. 4ºC.
Voor een uitgebreide beschrijving van de bemonstering van sediment wordt verwezen naar het Standaardvoorschrift SPECIE-08 “Bemonstering Zoute Baggerspecie”.
Bemonsteren van testorganisme
Op een intergetijde locatie met een relatief onvervuilde slibrijke bodem waar veel slijkgarnalen (C. volutator) aanwezig zijn, wordt de toplaag van het sediment met een schep weggenomen en voorzichtig gezeefd over een 500µm zeef (6.19) zodat slijkgarnalen van verschillende groottes op de zeef achterblijven. De slijkgarnalen en het debris worden in een PE-vat (6.2) gedaan, dat ter plaatse met zeewater wordt gevuld. Dit vat wordt naar het laboratorium gebracht. Op het laboratorium worden de slijkgarnalen van het debris gescheiden en op grootte geselecteerd. Het gezeefde materiaal wordt in een platte bak geplaatst, die uitstroomt op een op elkaar aansluitende 1000 en 500 µm zeef.
Schoon zeewater wordt in de platte bak gepompt en neemt zwemmende slijkgarnalen mee. Deze komen op de zeven terecht. Slijkgarnalen die door de 1000 µm zeef heen kruipen en op de 500 µm zeef blijven liggen worden gebruikt voor de kweek van juvenielen. Hierbij worden alleen de grootste dieren overgezet in de kweekbak. Wanneer kleinere dieren worden gebruikt duurt de kweekperiode langer.
8. Werkwijze
Voorzorgsmaatregelen
Gebruik handschoenen en laboratoriumjas tijdens de uitvoering van de experimenten. Zie ook hoofdstuk 12 Veiligheid.
0
8.2 Kweken van de in te zetten organismen
Van de geselecteerde slijkgarnalen (zie 7.2) worden ongeveer 400 organismen
opgeslagen in een opslagbak (6.3) met controle sediment dat gezeefd is over een 250 µm zeef (6.18) en zeewater van 15‰ dat wordt belucht.
De dikte van de laag sediment in de opslagbak is ongeveer drie centimeter. Daar bovenop staat ongeveer 15 cm water. In deze kweekbak, worden de slijkgarnalen geacclimatiseerd aan dezelfde laboratoriumcondities die gelden tijdens de chronische bioassay.
De slijkgarnalen worden drie maal per week bijgevoerd met één gram fijngemalen visvoer (5.10) opgelost in 100 ml kraanwater (m.b.v. een vijzel (6.10) worden de visvoer vlokken vermalen tot kleine deeltjes). Deze oplossing wordt vervolgens volledig in het water gepipetteerd om drijvend voer te voorkomen. Tevens wordt zo’n tweederde van het bovenstaande water twee maal per week ververst.
Wekelijks wordt een steekmonster genomen dat wordt gezeefd over een 500 µm zeef. De volwassen dieren die op de zeef achterblijven worden bekeken. Wanneer de meeste vrouwtjes eieren hebben wordt de hele kweekbak uitgezeefd en de volwassen vrouwtjes met eieren overgezet in een nieuwe kweekbak. De oude kweekbak en de overige beesten worden verwijderd. De nieuwe kweekbak wordt op dezelfde manier onderhouden als de eerste. Zeven dagen na het overzetten van de vrouwtjes wordt de gehele kweekbak weer uitgezeefd, maar nu over een zeef van 250 µm. De volwassen dieren op de zeef worden verwijderd. De juvenielen die op de zeef achterblijven kunnen worden ingezet in de chronische test. Deze jongen zijn allen tussen de 0 en 7 dagen oud.
8.3 Voorbehandeling van een sediment
• Het sediment wordt opgeslagen in het donker bij 4°± 2° C voor maximaal een maand.
Bij voorkeur wordt uiterlijk een week na monstername de chronische bioassay gestart (sediment is in de koeling 4 weken houdbaar, maar na drie weken wordt de test overgezet op vers sediment en kan dit sediment binnen de houdbaarheidstermijn gebruikt worden)
• Voordat de bioassay kan worden gestart, dient het sediment gehomogeniseerd te worden op de rollenbank, mengmolen of met een mixer (6.6) Het materiaal dient zodanig gehomogeniseerd te worden, dat de sedimentdeeltjes en het aanwezige water vermengd worden tot een egale, min of meer vloeibare massa, uniform van kleur en textuur.
• Voor gebruik dient het sediment gezeefd te worden over een zeef van 250 µm. Het sediment moet nat gezeefd worden, met gebruik van zo min mogelijk zeewater van
)
15‰. Vervolgens moet het sediment bezinken en het bovenstaande water worden afgeheveld. Het water dat wordt afgeheveld wordt vervolgens weer in de test gebruikt als bovenstaand water. Dit om de evt. toxicanten die door het zeven in het water terecht zijn gekomen te behouden. Alleen het benodigde sediment voor de accubakken dient gezeefd te worden. Sediment dat nodig is voor de bekerglazen dient pas vlak voor het overzetten te worden gezeefd zodat het bovenstaande water dan weer gebruikt kan worden.
8.4 Biologische analyse van een sedimentmonster Voorbereiding inzetten van de analyse
8.4.1 Verricht onderstaande werkzaamheden in een ruimte van 17° ± 2°C. En zet de accubakken klaar onder een geacclimatiseerde inrichting met druppelsgewijs doorstroomsysteem voor 15 promille zeewater (6.35)
8.4.2 Zet per sediment één accubak of aquarium (6.5) klaar met daarin 2 cm gehomogeniseerd gezeefd sediment.
8.4.3 Zet tevens per controle één accubak of aquarium klaar met daarin 2 cm gehomogeniseerd gezeefd controlesediment.
8.4.4 Voeg voorzichtig gefiltreerd zeewater van 15 ‰ (5.11) aan de controle accubak toe zonder de toplaag van het sediment te verstoren. De testsediment bakken worden gevuld met het water waarmee het sediment is gezeefd en wanneer dit niet voldoende is
aangevuld met 15‰ gefiltreerd zeewater. De sediment/water verhouding moet 1:3 zijn. Dit wil zeggen dat er bij 2 cm sediment 6 cm water op moet staan.
8.4.5 Belucht de accubakken met minimaal 2 pasteurpipetten, zodat de lucht zachtjes net onder het wateroppervlak blaast.
8.4.6 Laat de accubakken vervolgens gedurende minimaal 12 uur in een klimaatruimte van 17°
± 2°C staan.
8.4.7 Meet vervolgens de randvoorwaarden: Zuurstofgehalte (%) (6.12), de pH (6.14), temperatuur (6.14) en zoutgehalte (6.13). Meet van bovenstaande water ook het
ammoniumgehalte (5.7) en het nitrietgehalte (5.8). Noteer de waarden in een tabel. (zie bijlage 3). Bij een overschrijding van een randvoorwaarde kan deze aangepast worden.
Inzetten van de analyse (tijdstip 0)
8.4.8 Na het uitzeven van de kweekbak (8.2) worden de juvenielen die zijn achtergebleven op de zeef overgespoeld in een petrischaal (6.31) met zeewater van 15‰.
8.4.9 Plaats een koudlichtbron (6.28) boven de petrischaal om de juvenielen beter te kunnen zien.
8.4.10 Zuig de juvenielen ad random voorzichtig op met een plastic pipet en zet er 150 over per accubak.
8.4.11 Optioneel: fotografeer, wanneer de groei bepaald dient te worden, tevens tenminste 20 juvenielen, die zijn gefixeerd met formaline (4%) onder de binoculair (6.27) met een digitale camera (6.29) om de gemiddelde lengte van de juvenielen op dag 0 te bepalen.
Houd er rekening mee dat er voldoende juvenielen in de kweekbak overblijven om een kwaliteitscontrole mee uit te voeren.
8.4.12 Belucht de accubakken met proefdieren met minimaal twee pasteurpipetten, zodat de lucht zachtjes net onder het wateroppervlak blaast.
8.4.13 Laat de accubakken vervolgens 21 dagen bij een temperatuur van 17° ± 2°C staan in een geacclimatiseerde inrichting met druppelsgewijs doorstroomsysteem. Voer alle
accubakken drie maal per week met 225 mg fijngemalen visvoer opgelost in 23 ml kraanwater (1.5 mg voer per slijkgarnaal, opgelost in 0.15 ml water), dat
gehomogeniseerd wordt m.b.v. een magneetje en een vortex roerder. Pipetteer het voer met een pipet in het water om drijvend voer te voorkomen. Ververs het water
druppelsgewijs, zodat ongeveer 3 maal het volume van het water in de accubak per week ververst wordt (per replica komt dit meestal neer op 1.5 liter per dag, afhankelijk van de grootte van het testsysteem). Let op dat er gevoerd dient te worden na een
verversingsperiode om de uitspoeling van het voer zo veel mogelijk te voorkomen.
8.4.14 Controleer elke werkdag de beluchting. Bij dagelijkse controle op de beluchting blijft het zuurstof gehalte boven de 80%. Bij verstopping of uitval zal het zuurstofgehalte dalen.
Indien de beluchting bij een accubak is uitgevallen, dient het zuurstofgehalte direct gemeten te worden in elk bekerglas dat uitval of verstopping heeft gehad.
8.4.15 Wekelijks worden de randvoorwaarden (zuurstofgehalte, pH, saliniteit, temperatuur, ammoniumgehalte en nitrietgehalte (optioneel)) in het bovenstaande water gemeten, ongeveer in het midden van de waterkolom. Deze waarden worden genoteerd in een tabel (zie bijlage 3)
Verversen van het sediment (Tijdstip 21 dagen)
8.4.16 Homogeniseer het benodigde sediment en zeef het m.b.v. zeewater van 15 promille over 250 µm op dag 20. Bewaar het water waarin het sediment is gezeefd.
8.4.17 Breng op dag 20 per monster in vijfvoud ca. 275 ml gehomogeniseerd sediment aan (gespiked sediment in drievoud) in bekerglazen (6.4)
8.4.18 Breng tevens per controle sediment ca. 275ml sediment aan in 5 bekerglazen.
8.4.19 Voeg voorzichtig 825 ml (± 10 ml) van het water waarin gezeefd is aan de bekerglazen toe, zonder de toplaag van het sediment te verstoren. De verhouding tussen sediment en water is nu 1:3 (in een 1 liter bekerglas kan 1100ml. Dan is deze tot de rand van het schenktuitje gevuld, waar het water zal overlopen).
8.4.20 Dek de bekerglazen met een horlogeglas (6.21) af en belucht deze m.b.v. een pasteurpipet die net onder het wateroppervlak zacht blaast.
8.4.21 Laat de bekerglazen gedurende minimaal 12 uur in een klimaatruimte van 17° ± 2°C staan.
8.4.22 Neem op dag 21, voor het overzetten van de test in de bekerglazen, uit elke replica 10 ml watermonster en maak een mengmonster. Meet vervolgens de randvoorwaarden:
zuurstofgehalte (%), pH, temperatuur en zoutgehalte. Meet van bovenstaande water ook het ammoniumgehalte en het nitrietgehalte (optioneel). Noteer deze waarden in een tabel.
(zie voorbeeld in bijlage 3)
8.4.23 Meet daarnaast op dag 21 ook de randvoorwaarden zuurstofgehalte (%), pH, temperatuur en zoutgehalte en het ammoniumgehalte en nitrietgehalte (optioneel) in de accubakken, voordat de slijkgarnalen hieruit worden gezeefd.
8.4.24 Zeef vervolgens de inhoud van de accubakken (sediment en water) uit over een zeef van 250 m. De oorspronkelijk ingezette dieren blijven nu op de zeef achter.
8.4.25 Tel het aantal slijkgarnalen op de zeef om de sterfte in de eerste drie weken te bepalen.
Wanneer de sterfte in de eerste drie weken zo hoog is dat niet alle bekerglazen gevuld kunnen worden, zet dan minder replica’s in.
8.4.26 Zet vervolgens, m.b.v. een platte pincet (6.16) voorzichtig, ad random, 20 dieren over in ieder bekerglas met sediment. De overgebleven dieren worden verwijderd, deze hoeven niet te worden gemeten.
*
8.4.27 Belucht vervolgens de bekerglazen m.b.v. een pasteurpipet (6.15) en bedek de bekerglazen met een horlogeglas.
8.4.28 Laat de bekerglazen 28 dagen bij een temperatuur van 17° ± 2°C staan in een geacclimatiseerde inrichting met druppelsgewijs doorstroomsysteem. Voer de slijkgarnalen in de bekerglazen drie maal per week met 30 mg fijngemalen visvoer opgelost in 3 ml kraanwater, dat gehomogeniseerd wordt m.b.v. een magneetje en een vortex roerder. Voor alle te voeren bekerglazen kan de oplossing tegelijk worden
aangemaakt in een bekerglas. Pipetteer het voer met een pipet in het water om drijvend voer te voorkomen. Ververs het water druppelsgewijs, zodat ongeveer 3 maal het volume van het water in het bekerglas per week ververst wordt (per replica komt dit ongeveer neer op 350 ml per dag) Let op dat er gevoerd dient te worden na een druppelperiode om de uitspoeling van het voer zo veel mogelijk te voorkomen.
8.4.29 Controleer elke werkdag de beluchting. Bij dagelijkse controle op continue beluchting blijft het zuurstofgehalte hoger dan 80%. Bij verstopping of uitval zal het zuurstofgehalte dalen. Indien de beluchting bij een bekerglas is uitgevallen, dient het zuurstofgehalte direct gemeten te worden in elk bekerglas dat uitval of verstopping heeft gehad.
8.4.30 Meet wekelijks de randvoorwaarden van elk sediment in een mengmonster uit alle replica’s.
Afbreken van de test (tijdstip 49 dagen)
8.4.31 Neem na 49 dagen blootstelling (waarvan 28 dagen in de bekerglazen) uit elke replica 10 ml watermonster en maak een mengmonster. Meet met een elektrode het zuurstofgehalte (zie boven), de pH, de temperatuur en het zoutgehalte. Meet van bovenstaande water ook het ammoniumgehalte en nitrietgehalte (optioneel). Noteer de waarden in een tabel, zie bijlage 3.
8.4.32 Zeef de inhoud van de bekerglazen (sediment en water) over een 250 µm zeef.
8.4.33 De oorspronkelijk ingezette en nog levende adulte dieren worden geteld. Organismen die na stimulatie met een pincet binnen 10 seconden niet meer bewegen, worden als dood beschouwd.Ook organismen die ontbreken worden als dood beschouwd. Tevens wordt de sekse bepaald (zie bijlage 5) en er wordt bepaald of de vrouwtjes nog eipakketten dragen. Alle gegevens worden genoteerd in een tabel (zie bijlage 4).
8.4.34 Vervolgens worden deze dieren met een platte pincet in een petrischaal overgezet en gefixeerd met een 4% formaline oplossing. (alleen wanneer de groei bepaald moet worden)
8.4.35 Optioneel: fotografeer vervolgens de gefixeerde volwassenen per replica met de digitale camera om de gemiddelde groei van de oorspronkelijk ingezette dieren te bepalen.
(optioneel)
8.4.36 Op de zeef zijn nu alleen de in de test geboren juvenielen en het debris over. Spoel dit m.b.v. een spuitfles over in een bekerglas met gefiltreerd zeewater.
8.4.37 Door met een plunjer (6.30) door dit water te bewegen wordt de oplossing zo goed mogelijk gehomogeniseerd.
8.4.38 Verdeel de oplossing vervolgens in gelijke delen over een aantal petrischalen.
8.4.39 Belicht de petrischaal met een koudlichtbron en bekijk vervolgens elke petrischaal onder de binoculair en tel nauwkeurig de aanwezige juvenielen. De gegevens worden genoteerd in een tabel (zie bijlage 4).
8.4.40 De gemiddelde sterfte, het aantal juvenielen per overlevend vrouwtje en evt. de groei van de oorspronkelijk ingezette slijkgarnalen kunnen nu worden bepaald (zie hoofdstuk 9).
Opmerking: Let bij het druppelsysteem erop dat de druppelsnelheid niet te hoog is. Anders is het mogelijk dat de geboren juvenielen wegspoelen en dus niet geteld worden tijdens het uithalen van de test.
8.5 Controle- en referentie monsters
Voor het toetsen van de kwaliteit van de proefdieren worden testen met controle- sediment (8.5.1) en referentietoxicant(en) (8.5.2) uitgevoerd. Als kwaliteitsborging wordt de referentietoxicant ammoniumchloride toegepast.
8.5.1 Controlesediment
Als controlesediment wordt schoon sediment gebruikt (bijvoorbeeld sediment van de locatie waar de testorganismen verzameld zijn, gezeefd over 250µm) waarop slijkgarnalen na 49 dagen blootstelling minder dan 20%sterfte laten zien. Tevens moet de gemiddelde reproductie per overlevend vrouwtje minimaal 20 juvenielen zijn. Het controlesediment wordt parallel aan het te testen sediment uitgevoerd. Wanneer meerdere veldsedimenten tegelijk worden beoordeeld kan het aantal controles beperkt worden tot de wortel uit het aantal te beoordelen sedimenten. Hierbij wordt iedere controle in vijfvoud uitgevoerd.
8.5.2 Referentietoxicant
Door middel van een referentietoxicant wordt de gevoeligheid van de testorganismen gecontroleerd. Dit gebeurt wanneer de kweek gereed is om gebruikt te worden (dus wanneer de in te zetten juvenielen maximaal 7 dagen oud zijn). Deze controle omvat een blootstelling middels een 3-daagse waterfase test met ammoniumchloride.
+
8.5.3 Kwaliteitscontrole met Ammoniumchloride oplossing
8.5.3.1 Los 28,9 gram NH4Cl (5.6) op in 1 liter demiwater in een maatkolf (pH=8,0±0,5) (6.31).
De verkregen oplossing heeft een concentratie van 10 g/l NH 4+.
n m
M
g
gmol
= = 10 0 =
18 52, 0 54
, , mol mNH Cl4 = ×n M=0 54, mol×53 49, gmol=28 88, gram Waarin:
n = aantal mol (mol)
m = van NH4+ in 1 liter demiwater (g) M = molecuulmassa van NH4+ (g/mol) M (NH4 Cl) = 53,49 g/mol
M (NH4+) = 18,52 g/mol
8.5.3.2 Vul 12 bekerglazen (6.4) met 500 ± 10 ml gefiltreerd zeewater van 15‰ (5.11).
8.5.3.3 Bereidt hierin een concentratiereeks van NH 4+ (in duplo). Voeg NH 4+-oplossing (10 g/l) toe aan de bekerglazen, volgens tabel 2.
Tabel 2. Hoeveelheid toe te voegen NH 4+-stockoplossing van 10,0 g/l in 500 ml gefiltreerd zeewater van 15‰ (pH=8,0±0,5)
Concentratie NH4+ (mg/l) hoeveelheid stock oplossing (ml)
0 0
18 0,9
32 1,6
56 2,8
110 5,5
180 9,0
8.5.3.4 Bepaal op dag 0 in de zeewaterblanco en in de hoogste concentratie de pH, temperatuur, zuurstofgehalte en zoutgehalte. Meet het ammoniumgehalte in de concentratie 56 mg/l.
8.5.3.5 Voeg aan elk bekerglas 20 juveniele slijkgarnalen toe.
#
8.5.3.6 Regel de beluchting met pasteurpipetten zodat de pipetpunt in het water blaast.
8.5.3.7 Bepaal op dag 3 de pH, temperatuur, zuurstofgehalte, zoutgehalte in de zeewaterblanco en in de hoogste concentratie.
8.5.3.8 Tel na 3 dagen de overlevende slijkgarnalen.
8.5.3.9 Bereken op basis van de overleving de 72h-LC50 waarde volgens hoofdstuk 9.2.
8.5.3.10 De acceptatierange 72h-LC50 voor ammonium dient nog nader onderzocht te worden.
8.6 Randvoorwaarden
De parameters die gemeten worden in het bovenstaande water van de sedimenttest en in het testwater van de referentietoxicanten moeten gedurende de blootstellingsperiode binnen de volgende grenzen blijven:
• temperatuur 17 ± 2°C
• saliniteit 5-35, met standaard uitvoering bij 15 ± 3 ‰
• zuurstof > 85 % (gemiddeld gedurende de test!)
De effecten van verlaagde zuurstofconcentraties zijn bij meerdere behandelingen getest. De behandeling met een gemiddelde zuurstofconcentratie van circa 85%
bleek de NOEC te zijn. Deze behandeling werd verder gekarakteriseerd met minimale zuurstof waarden van circa 75%. Bij de behandeling hieronder (met een gemiddelde zuurstofconcentratie van 71% en een minimum van 43% werden reeds effecten vastgesteld)
• licht (breedspectrum) 16 uur licht, 8 uur donker (lichtkwaliteit 500-1000 lux)
• pH 7,5 – 8,5
• ammonium < 1.8 mg/l. (gemiddeld gedurende de test!)
-
• nitriet < 18 mg/l.
Uit onderzoek blijkt dat de nitrietconcentratie bijna nooit hoger is dan 18 mg/l. Deze randvoorwaarde is daarom niet kritisch en hoeft dan ook niet perse bepaald te worden.
Zie voor meer informatie over de effecten van deze parameters Van den Heuvel-Greve et al. (in prep.
8.7 Instelling apparatuur n.v.t.
9. Berekeningen
Gemiddelde sterfte in de bioassay
De gemiddelde sterfte in de bioassay wordt berekend door het aantal dode dieren gedurende de eerste drie weken en de laatste vier weken van de test afzonderlijk te berekenen. Vervolgens worden deze resultaten samengevoegd tot een sterfte percentage gedurende de gehele test.
In formule: û=S/(MxN)=S/n waarin:
û : geschatte sterftekans, gemiddelde sterfte S : totaal aantal gestorven testorganismen M : aantal replica’s
N : aantal dieren per replica
n : totaal aantal ingezette testorganismen
De procentuele sterfte wordt berekend door û met 100 te vermenigvuldigen.
LC50 waarde van de referentietoxicant
Voor de berekening van de LC50 van de referentietoxicant wordt de trimmed Spearman- Karber methode gebruikt. Voor deze methode zijn verschillende softwarepakketten voorhanden. Het aanbevolen softwarepakket is TOXCALC(Voor meer informatie over dit pakket zie http://members.aol.com/tidesoft/toxcalc/).
.
9.3 Gemiddeld aantal juvenielen per overlevend vrouwtje
Voor de berekening van het aantal geboren juvenielen per overlevend vrouwtje moet het aantal juvenielen gedeeld worden door het aantal overlevende vrouwtjes (voor kenmerken van vrouwtjes en mannetjes slijkgarnalen zie bijlage 4)
In formule: Nj = J/V waarin:
Nj: gemiddeld aantal juvenielen per overlevend vrouwtje V: aantal overlevende vrouwtjes
J: aantal overlevende juvenielen
9.4 Groei van de oorspronkelijk ingezette slijkgarnalen (optioneel)
De gemiddelde groei van de oorspronkelijk ingezette slijkgarnalen wordt berekend door de gemiddelde lengte van de juvenielen op dag 0 van de gemiddelde lengte op dag 49 af te trekken. Hierbij worden de gegevens van alle replica’s gemiddeld. Vervolgens kan de gemiddelde groei per dag berekend worden.
Voor de bepaling van de lengte wordt aanbevolen het softwarepakket Image Pro Plus te gebruiken. (voor meer informatie over dit pakket zie www.mediacybernetics.com )
Uit eerder uitgevoerd onderzoek lijkt geconcludeerd te kunnen worden dat de parameter lengte weinig toegevoegde waarde heeft ten opzichte van overleving en reproductie.
Aangezien ook deze parameter relatief bewerkelijk is, kan het vaststellen van deze parameter in een standaard voorschrift achterwege blijven. Voor speciale onderzoeksvragen kan deze natuurlijk altijd weer worden meegenomen.
In formule: L=L49-L0 waarin:
L : gemiddelde lengtegroei
L49 : gemiddelde lengte van testorganismen op dag 49 L0 : gemiddelde lengte van testorganismen bij inzet.
0
10. Rapportage
De volgende informatie dient te worden gerapporteerd:
• Sediment, monsterlocatie en bemonstering gegevens (volgens bijlage 1)
• De mortaliteit van de testorganismen in de sedimenttoxiciteitstest (volgens bijlage 4)
• Het aantal geboren juvenielen per overlevend vrouwtje.
• Indien randvoorwaardenoverschrijding plaatsvindt, deze rapporteren.
• De lengtegroei van de oorspronkelijk ingezette testorganismen (optioneel)
De volgende informatie dient op verzoek beschikbaar te zijn:
• Gemeten randvoorwaarden parameters (bijlage 3).
• De berekende LC50 waarde voor de referentietoxicant en de sterfte in het controlesediment
• Shewhartcontrolekaart van referentietoxicant. Deze moet nog nader bepaald worden a.d.h.v. nog nader te bepalen waarden voor de kwaliteitstesten
)
11. Kwaliteitszorg
Om de kwaliteit van de chronische slijkgarnalentest te kunnen waarborgen dient deze te voldoen aan de volgende kwaliteitscriteria:
1. Controlesediment 20 % sterfte
0,08 mm groei per dag
20 juvenielen per overlevend vrouwtje 2 Leeftijd in te zetten juvenielen Maximaal 7 dagen
3 Referentietoxicant Range 72h-LC50(NH4+) = nog nader te bepalen mg/l 4. Controle Zeewater < 10% sterfte bij 3 daagse waterfase test
5. Opslagtijd sediment Maximaal een maand 6. Testdataformulier Voorbeeld bijlage 2
7. Randvoorwaarden Noteren van pH, temperatuur, saliniteit, zuurstofverzadiging, ammonium en nitriet (optioneel)concentraties. Voorbeeld bijlage 3.
8. Analysekarakteristiek Noteren van o.a.herhaalbaarheid, detectiegrens, afrondingsinterval, 1e /2e /3e -lijnscontrole Voorbeeld bijlage1
9. Overschrijding van QA-criteria Overleg met projectleider wanneer overschrijding plaatsvindt van opslagtijd (sediment) of ouderdom van de juvenielen.
10. Test verwerpen • Bij overschrijding van de 3s-grens op de
Shewhartcontrolekaart met het referentietoxicant;
• ≥ 10% sterfte in controle zeewater;
• > 20 % sterfte controlesediment.
• < 20 juvenielen / vrouw in controlesediment
*
12. Veiligheid
12.1 Dragen van labjas en handschoenen is tijdens de uitvoering van de toxiciteitstest met sediment en de referentietoxicant verplicht.
12.2 Verontreinigd sediment, blootgestelde testorganismen en referentietoxicant worden als chemisch afval beschouwd en als zodanig afgevoerd.
13. Achtergrond informatie
1. Aquasense (1995). De toxiciteit van ammonia, nitriet en sulfide voor Corophium en Echinocardium o.i.v. het zuurstofgehalte en de pH., RIKZ, rapport 95.0565
2. AquaSense (2001). Randvoorwaarden voor ammonium in de 10-daagse bioassay met Corophium volutator. Mogelijke invloed van een seizoensafhankelijke gevoeligheid. Rapport 1894
3. AquaSense (2003). Een ammonium bestendige test voor Corophium volutator volgens Specie-01. Alternatieven op de standaard testmethode. Rapport 1996
4. AquaSense (2007). Verchroniseren van de Corophium-assay. Optimalisatie van de uitvoering en criteria voor saliniteit, zuurstof, ammonium en nitriet In opdracht van:
Rijkswaterstaat, Rijksinstituut voor Kust en Zee, Rapportnummer: 2041
5. AquaSense (in prep.), Verchroniseren van de Corophium-assay. Optimalisatie van het criterium voor ammonium en het testen van veldsedimenten. In opdracht van Rijkswaterstaat, Rijksinstituut voor Kust en Zee, Rapportnummer: 2089
6. ASTM. Standard guide for conducting 10-day static sediment toxicity tests with marine and estuarine amphipods. (1992). In: 1998 Annual Book of ASTM Standards, Pesticides, Resource Recovery, Hazardous Substances and Oil Spill Responses, Waste Disposal, Biological Effects, Vol.11.04. American Society for Testing and Materials Philadelphia, PA (1998a), ASTM E 1367-92: 732-757
7. Baker, R.J. & J.A. Nelder (1978). The Glim system release 3: Generalized linear interactive modeling; Handleiding, Numerical Algorithms Group, Oxford
8. Burton, A.G.,Jr., (1992). Sediment toxicitity assessment. Lewis Publishers, Inc.
9. Chapman, P.M. (1987). Marine sediment toxicity tests. In: J.J. Lichtenberg, F.A.
Winter, C.I. Weber and L. Fadkin (eds.). Chemical and Biological Characterization of Sludges, Sediments, Dredge Spoils, and Drilling Muds. American Society for Testing and Materials, ASTM STP 976: 391-402
10. Ciarelli, S., W.A.P.M.A. Vonck, & N.M. van Straalen (1997). Reproducibility of spiked-sediment bioassays using the marine benthic amphipod, Corophium volutator; Marine Environmental Research 43 (4): 329-343
*
11. DeWitt, T.H., T.S. Bridges, D.S. Ireland, L.L. Stahl, M.R. Pinza and L.D. Antrim, (2001) Methods for Assessing de Chronic Toxicity of Marine and Estuarine Sediment- associates Contaminants with the Amphipod Leptocheirus plumulosus.EPA 600/R- 01/020, Office of Research and Development, U.S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C. WED-01-073
12. Dikkenberg, van den, L.C. & C.A. Schipper (1998). Validatie rapport Corophium, RIKZ/IT.98.863X
13. Environment Canada (1992). Biological Test Method: Acute Test for Sediment Toxicity Using Marine or Estuarine Amphipods. Conservation and Protection, Ottawa, Ontario Report EPS1/RM/26
14. EPA (1994). Methods for assessing of sediment associated contaminants with estuarine marien amphipods, EPA/600/R-94/025, Washington, DC 20460
15. Hamilton, M.A., R.C. Russo & R.V. Thurston (1977). Trimmed Spearman Karber method for estimating median lethal concentration in toxicity bioassays. Environ.
Sci. Technol. 11(7): 714-719
16. Heuvel-Greve, M. van den et al (in prep), Confounding factors in chronic bioassays with the estuarine amphipod Corophium volutator.
17. Jol,J. (2003), werkdocument “bioassay” ontwikkeling, RIKZ/OS/2003.845X 18. Kater, B. (1999). Statistiek voor bioassays, RIKZ/OS-99.811x
19. Kooijman, S.A.L.M. (1981). Parametric analysis of mortality rates in bioassays. Water Res. 15:107-119
20. Kooman, H. (2002),pilotstudie naar de opzet van een chronische bioassay met de amphipode Corophium volutator, stageverslag.
21. Kooman, H. (2002), ontwikkeling van een chronische bioassay met de amphipode Corophium volutator, afstudeerrapport.
22. Postma, P. (1998). Randvoorwaarden voor mariene bioassays, rapport Aquasense 98.1295
23. Postma, J.F, S. de Valk, M. Dubbeldam, J.L. Maas, M. Tonkes, C.A. Schipper &
B.J. Kater (2002). Confounding factors in bioassays with freshwater and marine organisms. Ecotox. Environ. Saf. 53: 226-237
24. Rand, G.M. & S.R. Petrocelli (1985). Fundamentals of Aquatic Toxicology: Methods and Application. Hemisphere Publishing Corporation., McGraw-Hill International Book Co.
25. Schipper, C.A., R.M. Burgess, L.C. van de Dikkenberg, standaardvoorschrift sediment toxiciteittest met de slijkgarnaal Corophium volutator, SPECIE-01, versie 4, juli 2004 26. Schipper en Stronkhorst, (1999), RIKZ handboek toxiciteitstesten voor de zoute
**
baggerspecies, RIKZ/99.012
14. Bijlagen
Bijlage 1. Voorbeeld van analysekarakteristiek Corophium volutator
Bijlage 2. Voorbeeld testdataformulier voor sediment toxiciteitstest Corophium volutator Bijlage 3. Voorbeeld randvoorwaarden formulier Corophium volutator
Bijlage 4: Voorbeeld scorelijst voor overleving en sekse en aantal juvenielen Bijlage 5: kenmerken Corophium volutator
Bijlage 6: Tijdschema van de chronische test met Corophium volutator
*
Bijlage 1. Voorbeeld van analysekarakteristiek Corophium volutator
01 Test Matrix sediment
02 Analysevoorschrift Nummer : Specie-01
Versie : ………. Datum : ………..
03 Testcode ………..
04 Beginsel van de methode
Chonische toxiciteit van vervuild sediment uit mariene milieu vaststellen m.b.v. testorganisme Corophium volutator
05 Monster opslagtemp. …………°C 06 Monsteropslagtijd ………..dagen 07 Meetbereik ………..% mortaliteit 08 Detectiegrens ……….. % mortaliteit 09 Afrondingsgrens ………..%
10 Herhaalbaarheid (%r = 2√2 *CV*%)
sediment toets: …..%
waterfasetest met NH4+: ……..%
11 Reproduceerbaarheid ……….
12 Referentietoxicant …………
13 Controlesediment ………….
14 Controlekaarten Shewhartkaart van referentietoxicant:…. NH4+
15 1e lijn controle Controlekaart: ….…….
2e lijn controle Gecertificeerd sediment: ………..
3e lijn controle Ringonderzoek: …………
16 Storende componenten
NOEC NH4+ : ………..
*+
Bijlage 2. Voorbeeld testdataformulier voor sediment toxiciteitstest Corophium volutator
Test code: Project:
Naam analist
SEDIMENTEN LABNUMMERS Opdrachtgevers: Sediment verzameldatum Controlesediment 1
1 2 3 4 5
C. volutator afkomstig:
Referentietoxicant afk:
Sediment Toxiciteits Test Referentietoxicant Test
Inzetdatum…………..
Einddatum….………..
Inzetdatum….………..
Einddatum….………..
Conc.
mg/l
A B
0*
18*
32*
56*
110*
180*
Opmerkingen:
*voorlopig
Datum: Berekende 72h- LC50 :
Paraaf: Betrouwbaarheids interval:
*#
Bijlage 3. Voorbeeld randvoorwaarden formulier Corophium volutator project
Opdrachtgever
Parameter O2 pH Saliniteit Temp
. NH4+ NO2- Opmerkingen
Randvoorwaarden Corophium > 85 7.5-8.5 12-18 15-19 < 1.8 < 18
Lab. nummer tijd datum % - promille °°°°C mg/l mg/l paraaf
*-
Bijlage 4: Voorbeeld scorelijst voor overleving en sekse en aantal juvenielen Overleving
Opmerkingen Datum Lab
nummer Replica Mannetjes Vrouwtjes zonder eipakket
Vrouwtjes
eipakket met Totaal Aantal
juvenielen Paraaf
Controle A
B C D E Totaal
Nummer 1 A
B C D E Totaal
*.
Bijlage 5. kenmerken Corophium volutator
/ ! 5 ! 2 ,
! ! &
,( 2 ,6 8 & !
*0
7
*)
Bijlage 6. Tijdschema van de chronische test met Corophium volutator
dag-15--21 dag-8--14 dag -7--1 dag 0-7 dag 8-14 dag 15-21 dag 22-28 dag 29-35 dag 36-42 dag 43-49
Verzamelen velddieren 1*
Opstarten kweek 1*
Onderhouden kweek
Overzetten kweek 1.
&& ! 1
uithalen kweek
&& !
onderhouden test in accubakken
klaarzetten bekerglazen *
&& ! *
overzetten test in bekerglazen *
onderhouden test in bekerglazen
uithalen test in bekerglazen 49
randvoorwaarden meten -21 -14 -7 0 en 7 14 21 28 35 42 49
Wanneer een cijfer in het schema staat vermeld dient op die dag van de week de betreffende actie te worden uitgevoerd.
Let op: Zowel de week als de test dienen drie maal per week te worden gevoerd.
De kweek dient 2 maal per week te worden ververst
