University of Groningen Studies on the role of dopamine and serotonin in tumors and their microenvironment Peters, Marloes A.M.

(1)

University of Groningen

Studies on the role of dopamine and serotonin in tumors and their microenvironment Peters, Marloes A.M.

DOI:

10.33612/diss.135597229

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.

Document Version

Publisher's PDF, also known as Version of record

Publication date: 2020

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):

Peters, M. A. M. (2020). Studies on the role of dopamine and serotonin in tumors and their microenvironment. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.135597229

Copyright

Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

(2)

548127-L-bw-Peters 548127-L-bw-Peters 548127-L-bw-Peters 548127-L-bw-Peters Processed on: 17-9-2020 Processed on: 17-9-2020 Processed on: 17-9-2020

Processed on: 17-9-2020 PDF page: 135PDF page: 135PDF page: 135PDF page: 135

- 134 - - 135 -

CHAPTER 9

(3)

9

- 136 - - 137 -

NEDERLANDSE SAMENVATTING

Het micromilieu van een tumor levert een belangrijke bijdrage aan tumorprogressie. Bloedvaten in het micromilieu van de tumor transporteren zuurstof, eiwitten, hormonen en cellen naar de tumor, wat resulteert in vermindering van hypoxie en stimulering van tumor groei en metastasering. Tumor bloedvaten hebben functionele en structurele afwijkingen, wat zorgt voor een variabele bloeddoorstroming. Deze aberrante bloeddoorstroming kan gemakkelijk resulteren in de activatie van bloedplaatjes, die daarop hun inhoud vrijgeven. Bloedplaatjes functioneren als een circulerend reservoir voor pro- en anti-angiogene factoren. Hieronder vallen dopamine en serotonine, die zijn opgeslagen in de dense granules van bloedplaatjes. Bij mensen zijn dopamine en serotonine betrokken in verschillende fysiologische en pathologische processen, zoals stemmingsregulatie, motiliteit van het maagdarmkanaal, en de ziekte van Parkinson. Preklinische studies wijzen erop dat dopamine en serotonine ook tumorgedrag kunnen beïnvloeden.

Daarom is het doel van de onderzoeken die in dit proefschrift worden beschreven om de rol van dopamine en serotonine in tumoren te bestuderen. Dit doen we door middel van het doelgericht stimuleren van de dopamine receptor D2 (DRD2) in een in ovo ovariumcarcinoom model, het evalueren van serotonine en dopamine receptor expressie in solide tumoren, en het analyseren van de concentratie serotonine alsmede zijn precursors en metabolieten in bloedplaatjes en vrij in het plasma.

In hoofdstuk 1 wordt een algemene introductie van het onderwerp en de opzet van

het proefschrift beschreven. Een review van de literatuur, beschreven in hoofdstuk 2,

focust op de rol van dopamine en serotonine om tumor gedrag te beïnvloeden via angiogenese en tumorcel proliferatie. We doorzochten de literatuur, en gebruiken daarvoor de zoektermen “dopamine”, “serotonin”, “5-hydroxytryptamine”, “dopamine receptor”, “serotonin receptor”, “platelets”, “angiogenesis”, “neovascularization”, “neoplasm”, and “cancer”. In vitro remden dopamine en DRD2 agonisten vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF)-geïnduceerde proliferatie van endotheelcellen. Muizen hadden na behandeling met dopamine verminderde tumor groei, een lagere dichtheid van microbloedvaten in de tumor en minder endotheel voorloper cellen in de circulatie. Muizen met een uitgeschakeld DRD2 gen ontwikkelden grotere tumoren met een hogere dichtheid aan microbloedvaten in vergelijking met wild-type muizen. Bovendien hadden muizen die werden behandeld met DRD2 agonisten een relatief lagere dichtheid van microbloedvaten in de tumor. Gebaseerd op de literatuur van preklinische studies lijkt dopamine via DRD2 tumorgedrag te beïnvloeden. De rol van serotonine receptor 1 (5-HTR1), serotonine

(4)

9

- 136 - - 137 -

NEDERLANDSE SAMENVATTING

Het micromilieu van een tumor levert een belangrijke bijdrage aan tumorprogressie. Bloedvaten in het micromilieu van de tumor transporteren zuurstof, eiwitten, hormonen en cellen naar de tumor, wat resulteert in vermindering van hypoxie en stimulering van tumor groei en metastasering. Tumor bloedvaten hebben functionele en structurele afwijkingen, wat zorgt voor een variabele bloeddoorstroming. Deze aberrante bloeddoorstroming kan gemakkelijk resulteren in de activatie van bloedplaatjes, die daarop hun inhoud vrijgeven. Bloedplaatjes functioneren als een circulerend reservoir voor pro- en anti-angiogene factoren. Hieronder vallen dopamine en serotonine, die zijn opgeslagen in de dense granules van bloedplaatjes. Bij mensen zijn dopamine en serotonine betrokken in verschillende fysiologische en pathologische processen, zoals stemmingsregulatie, motiliteit van het maagdarmkanaal, en de ziekte van Parkinson. Preklinische studies wijzen erop dat dopamine en serotonine ook tumorgedrag kunnen beïnvloeden.

Daarom is het doel van de onderzoeken die in dit proefschrift worden beschreven om de rol van dopamine en serotonine in tumoren te bestuderen. Dit doen we door middel van het doelgericht stimuleren van de dopamine receptor D2 (DRD2) in een in ovo ovariumcarcinoom model, het evalueren van serotonine en dopamine receptor expressie in solide tumoren, en het analyseren van de concentratie serotonine alsmede zijn precursors en metabolieten in bloedplaatjes en vrij in het plasma.

In hoofdstuk 1 wordt een algemene introductie van het onderwerp en de opzet van

het proefschrift beschreven. Een review van de literatuur, beschreven in hoofdstuk 2,

focust op de rol van dopamine en serotonine om tumor gedrag te beïnvloeden via angiogenese en tumorcel proliferatie. We doorzochten de literatuur, en gebruiken daarvoor de zoektermen “dopamine”, “serotonin”, “5-hydroxytryptamine”, “dopamine receptor”, “serotonin receptor”, “platelets”, “angiogenesis”, “neovascularization”, “neoplasm”, and “cancer”. In vitro remden dopamine en DRD2 agonisten vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF)-geïnduceerde proliferatie van endotheelcellen. Muizen hadden na behandeling met dopamine verminderde tumor groei, een lagere dichtheid van microbloedvaten in de tumor en minder endotheel voorloper cellen in de circulatie. Muizen met een uitgeschakeld DRD2 gen ontwikkelden grotere tumoren met een hogere dichtheid aan microbloedvaten in vergelijking met wild-type muizen. Bovendien hadden muizen die werden behandeld met DRD2 agonisten een relatief lagere dichtheid van microbloedvaten in de tumor. Gebaseerd op de literatuur van preklinische studies lijkt dopamine via DRD2 tumorgedrag te beïnvloeden. De rol van serotonine receptor 1 (5-HTR1), serotonine

(5)

9

- 138 -

receptor 2 (5-HTR2), en serotonine receptor 3 (5-HTR3) werd vooral in vitro bestudeerd. Activering van deze receptoren stimuleert proliferatie van endotheelcellen en tumorcellen van verschillende tumor types. In muizen met een serotonine depletie was tumor groei vertraagd, wat ongedaan gemaakt kon worden na aanvulling van de serotonine voorraad. Muizen die waren behandeld met een 5-HTR2B antagonist hadden verminderde tumor groei ten opzichte van controles. Gebaseerd op dit review van de literatuur lijken met name DRD2 en 5-HTR2B interessant om verder te bestuderen.

In hoofdstuk 3 beschrijven we de effecten van dopamine en de DRD2 agonist

quinpirole op overleving van endotheelcellen en ovariumcarcinoom cellen in vitro alsmede op tumor angiogenese en tumor gewicht in een in ovo ovariumcarcinoom model. In vitro werd na 96 uur continue blootstelling aan dopamine hydrochloride 50% reductie in cel overleving gezien bij een dosering van 67 µM in humane navelstreng endotheelcellen en bij een dosering van 42 µM in A2780 ovariumcarcinoom cellen. Van quinpirole werd in vitro geen effect gezien op de overleving van beide celtypen. Voor het in ovo onderzoek gingen bevruchte kippeneieren gedurende 14 dagen in een roterende incubator. Op de 6e_{dag werden A2780 ovariumcarcinoom cellen op het}

chorioallantoïsche membraan aangebracht. Van dag 10 tot en met 13 werden de eieren dagelijks behandeld met vehikel, dopamine hydrochloride (500 µM of 1000 µM), of quinpirole hydrochloride (10 µM, 100 µM, 500 µM of 1000 µM). De tumoren, die op dag 14 werden geoogst, hadden een lagere dichtheid van microbloedvaten na behandeling met 10-500 µM quinpirole en een lager tumor gewicht na behandeling met 100 µM quinpirole. In tegenstelling tot de in vitro resultaten had behandeling met dopamine geen anti-angiogeen of anti-tumor effect in ovo. Concluderend remde dopamine overleving van endotheel en ovariumcarcinoom cellen in vitro maar had het geen effect op tumor groei en dichtheid van microbloedvaten in ovo, terwijl quinpirole wel angiogenese en tumorgroei remde in ovo maar geen effect had in vitro Dit suggereert dat het anti-tumor effect van quinpirole gebaseerd is op interacties met het micromilieu van de tumor, maar meer onderzoek is nodig voordat dergelijke conclusies getrokken kunnen worden.

In hoofdstuk 4 beschrijven we de resultaten van een screening op expressie van

serotonine en dopamine receptoren in solide tumoren. We gebruikten functional genomic mRNA profiling om mRNA overexpressie van 5-HTR1B, 5-HTR2B, dopamine receptor D1 (DRD1), en DRD2 te bepalen in 11,756 tumor samples van 43 verschillende solide tumoren in vergelijking met gezond weefsel. Daarnaast hebben we met immunohistochemie de expressie en lokalisatie van deze receptoren bepaald in tumor weefsel van acht tumor typen: colon carcinoom, ovariumcarcinoom,

- 139 -

mammacarcinoom, renaalcelcarcinoom (RCC), pancreascarcinoom, gastro-intestinale stromale tumoren (GIST), melanoom en feochromocytoom. Functional genomic mRNA profiling toonde aan dat 5-HTR2B mRNA frequenter tot overexpressie kwam dan 5-HTR1B, DRD1 en DRD2. Interessant genoeg werd overexpressie van de laatstgenoemde receptoren ook gezien in zeldzame tumor types met beperkte behandelopties. Voorbeelden hiervan zijn 5-HTR1B overexpressie in 17% van de nasopharynxcarcinomen, DRD1 overexpressie in 30% van de ependymomen en 21% van de synovium sarcomen, en DRD2 overexpressie in 13% van de astrocytomen. Immunohistochemie toonde aan dat 5-HTR2B hoog tot expressie komt op endotheelcellen van coloncarcinoom, ovariumcarcinoom, mammacarcinoom, RCC, en pancreascarcinoom alsmede op tumorcellen van melanomen en GIST. 5-HTR1B kwam voornamelijk laag tot expressie. Hoge expressie van DRD1 werd gezien in subsets van alle bestudeerde tumor types, variërend van 14% van de melanomen tot 57% van de RCC’s. DRD2 expressie was hoog in circa 50% van de bestudeerde feochromocytomen, pancreascarcinomen en ovariumcarcinomen. Gebaseerd op de gecombineerde resultaten van functional genomic mRNA profiling en immunohistochemie is 5-HTR2B de meest interessante receptor voor toekomstig onderzoek naar eventuele behandelopties.

Wanneer bloedplaatjes worden geactiveerd in het micromilieu van de tumor treedt degranulatie van de bloedplaatjes op, wat zorgt voor het lokaal vrijkomen van serotonine. Daarom formuleerden we de hypothese dat serotonine concentraties in bloedplaatjes lager zijn in kankerpatiënten dan in gezonde leeftijdgenoten. In

hoofdstuk 5 vergeleken we de serotonine concentratie in bloedplaatjes van 20

patiënten met gemetastaseerd RCC en 20 patiënten met gemetastaseerde neuroendocriene tumoren van het pancreas (pNET) met 20 gezonde controles per groep. Deze tumor types waren gekozen vanwege hun uitgebreide tumorvascularisatie. Voor de analyse gebruikten we vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS). Serotonine concentraties in bloedplaatjes waren circa tweemaal zo laag in kankerpatiënten als in gezonde controles. Vervolgens onderzochten we mogelijke bijdragende oorzaken van de lage serotonine concentraties in bloedplaatjes. Als eerste maten we VEGF-A concentraties in bloedplaatjes met enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), omdat VEGF-A ook aanwezig is in bloedplaatjes en mogelijk met serotonine zou kunnen concurreren om opslagcapaciteit. Er werd echter geen relatie gevonden tussen de concentraties serotonine en VEGF-A in bloedplaatjes. Serotonine wordt geproduceerd uit tryptofaan en voornamelijk afgebroken tot 5-hydroxyindolazijnzuur (5-HIAA). Tryptofaan kan echter ook worden omgezet naar kynurenine door indoleamine 2,3-dioxygenase; een enzym dat vaak verhoogd tot expressie komt in tumoren bij patiënten. We vonden dat de plasma

(6)

9

- 138 -

receptor 2 (5-HTR2), en serotonine receptor 3 (5-HTR3) werd vooral in vitro bestudeerd. Activering van deze receptoren stimuleert proliferatie van endotheelcellen en tumorcellen van verschillende tumor types. In muizen met een serotonine depletie was tumor groei vertraagd, wat ongedaan gemaakt kon worden na aanvulling van de serotonine voorraad. Muizen die waren behandeld met een 5-HTR2B antagonist hadden verminderde tumor groei ten opzichte van controles. Gebaseerd op dit review van de literatuur lijken met name DRD2 en 5-HTR2B interessant om verder te bestuderen.

In hoofdstuk 3 beschrijven we de effecten van dopamine en de DRD2 agonist

quinpirole op overleving van endotheelcellen en ovariumcarcinoom cellen in vitro alsmede op tumor angiogenese en tumor gewicht in een in ovo ovariumcarcinoom model. In vitro werd na 96 uur continue blootstelling aan dopamine hydrochloride 50% reductie in cel overleving gezien bij een dosering van 67 µM in humane navelstreng endotheelcellen en bij een dosering van 42 µM in A2780 ovariumcarcinoom cellen. Van quinpirole werd in vitro geen effect gezien op de overleving van beide celtypen. Voor het in ovo onderzoek gingen bevruchte kippeneieren gedurende 14 dagen in een roterende incubator. Op de 6e_{dag werden A2780 ovariumcarcinoom cellen op het}

chorioallantoïsche membraan aangebracht. Van dag 10 tot en met 13 werden de eieren dagelijks behandeld met vehikel, dopamine hydrochloride (500 µM of 1000 µM), of quinpirole hydrochloride (10 µM, 100 µM, 500 µM of 1000 µM). De tumoren, die op dag 14 werden geoogst, hadden een lagere dichtheid van microbloedvaten na behandeling met 10-500 µM quinpirole en een lager tumor gewicht na behandeling met 100 µM quinpirole. In tegenstelling tot de in vitro resultaten had behandeling met dopamine geen anti-angiogeen of anti-tumor effect in ovo. Concluderend remde dopamine overleving van endotheel en ovariumcarcinoom cellen in vitro maar had het geen effect op tumor groei en dichtheid van microbloedvaten in ovo, terwijl quinpirole wel angiogenese en tumorgroei remde in ovo maar geen effect had in vitro Dit suggereert dat het anti-tumor effect van quinpirole gebaseerd is op interacties met het micromilieu van de tumor, maar meer onderzoek is nodig voordat dergelijke conclusies getrokken kunnen worden.

In hoofdstuk 4 beschrijven we de resultaten van een screening op expressie van

serotonine en dopamine receptoren in solide tumoren. We gebruikten functional genomic mRNA profiling om mRNA overexpressie van 5-HTR1B, 5-HTR2B, dopamine receptor D1 (DRD1), en DRD2 te bepalen in 11,756 tumor samples van 43 verschillende solide tumoren in vergelijking met gezond weefsel. Daarnaast hebben we met immunohistochemie de expressie en lokalisatie van deze receptoren bepaald in tumor weefsel van acht tumor typen: colon carcinoom, ovariumcarcinoom,

- 139 -

mammacarcinoom, renaalcelcarcinoom (RCC), pancreascarcinoom, gastro-intestinale stromale tumoren (GIST), melanoom en feochromocytoom. Functional genomic mRNA profiling toonde aan dat 5-HTR2B mRNA frequenter tot overexpressie kwam dan 5-HTR1B, DRD1 en DRD2. Interessant genoeg werd overexpressie van de laatstgenoemde receptoren ook gezien in zeldzame tumor types met beperkte behandelopties. Voorbeelden hiervan zijn 5-HTR1B overexpressie in 17% van de nasopharynxcarcinomen, DRD1 overexpressie in 30% van de ependymomen en 21% van de synovium sarcomen, en DRD2 overexpressie in 13% van de astrocytomen. Immunohistochemie toonde aan dat 5-HTR2B hoog tot expressie komt op endotheelcellen van coloncarcinoom, ovariumcarcinoom, mammacarcinoom, RCC, en pancreascarcinoom alsmede op tumorcellen van melanomen en GIST. 5-HTR1B kwam voornamelijk laag tot expressie. Hoge expressie van DRD1 werd gezien in subsets van alle bestudeerde tumor types, variërend van 14% van de melanomen tot 57% van de RCC’s. DRD2 expressie was hoog in circa 50% van de bestudeerde feochromocytomen, pancreascarcinomen en ovariumcarcinomen. Gebaseerd op de gecombineerde resultaten van functional genomic mRNA profiling en immunohistochemie is 5-HTR2B de meest interessante receptor voor toekomstig onderzoek naar eventuele behandelopties.

Wanneer bloedplaatjes worden geactiveerd in het micromilieu van de tumor treedt degranulatie van de bloedplaatjes op, wat zorgt voor het lokaal vrijkomen van serotonine. Daarom formuleerden we de hypothese dat serotonine concentraties in bloedplaatjes lager zijn in kankerpatiënten dan in gezonde leeftijdgenoten. In

hoofdstuk 5 vergeleken we de serotonine concentratie in bloedplaatjes van 20

patiënten met gemetastaseerd RCC en 20 patiënten met gemetastaseerde neuroendocriene tumoren van het pancreas (pNET) met 20 gezonde controles per groep. Deze tumor types waren gekozen vanwege hun uitgebreide tumorvascularisatie. Voor de analyse gebruikten we vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS). Serotonine concentraties in bloedplaatjes waren circa tweemaal zo laag in kankerpatiënten als in gezonde controles. Vervolgens onderzochten we mogelijke bijdragende oorzaken van de lage serotonine concentraties in bloedplaatjes. Als eerste maten we VEGF-A concentraties in bloedplaatjes met enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), omdat VEGF-A ook aanwezig is in bloedplaatjes en mogelijk met serotonine zou kunnen concurreren om opslagcapaciteit. Er werd echter geen relatie gevonden tussen de concentraties serotonine en VEGF-A in bloedplaatjes. Serotonine wordt geproduceerd uit tryptofaan en voornamelijk afgebroken tot 5-hydroxyindolazijnzuur (5-HIAA). Tryptofaan kan echter ook worden omgezet naar kynurenine door indoleamine 2,3-dioxygenase; een enzym dat vaak verhoogd tot expressie komt in tumoren bij patiënten. We vonden dat de plasma

(7)

9

- 140 -

kynurenine/tryptofaan ratio’s 1,5 keer zo hoog waren in RCC en pNET patiënten in vergelijking met gezonde controles. Dit zou een aanwijzing kunnen zijn dat in het micromilieu van de tumor tryptofaan frequenter wordt omgezet naar kynurenine in plaats van naar serotonine. Ondanks dat we inderdaad een verlaagde concentratie serotonine in bloedplaatjes van RCC en pNET patiënten aantoonden, zou het kunnen dat dit niet alleen te wijten is aan afgifte van serotonine in het micromilieu van de tumor, maar ook door activering van de kynurenine route.

De serotonine transporter op neuronen wordt geblokkeerd door selectieve serotonine heropname remmers (SSRI’s). De transporter wordt niet alleen geblokkeerd op neuronen, maar ook op bloedplaatjes. Daardoor is de serotonine concentratie in bloedplaatjes van SSRI gebruikers verlaagd. Er is slechts beperkte data over de invloed van SSRI’s op de vrije serotonine concentratie in het plasma, wat beschikbaar is voor receptor binding. Daarom hadden we in hoofdstuk 6 als doel om de vrije serotonine

concentratie in het plasma en in bloedplaatjes van SSRI gebruikers te bepalen. We namen voorzorgsmaatregelen om sample contaminatie te voorkomen door zorgvuldige bloedafname, snelle verwerking van de samples, en restricties aangaande het gebruik van overige medicatie en bepaalde voedingsmiddelen. Vrije serotonine concentraties in plasma en bloedplaatjes werden gemeten met LC-MS/MS. De vrije serotonine concentratie was tienmaal zo laag in het plasma en veertien maal zo laag in bloedplaatjes van 64 SSRI gebruikers in vergelijking met gezonde leeftijdgenoten. De SSRI dosering en de bindingsaffiniteit van SSRI’s voor de serotonine transporter waren omgekeerd gecorreleerd met de serotonine concentratie in plasma en bloedplaatjes. De concentratie 5-HIAA, de metaboliet van serotonine, was maar licht verhoogd in het plasma van SSRI gebruikers in vergelijking met gezonde controles. Dit suggereert dat de lage concentraties serotonine die werden gemeten niet werden veroorzaakt door een verhoogde afbraak van serotonine tot 5-HIAA.

Serotonine wordt niet alleen omgezet naar 5-HIAA, maar ook naar melatonine. Eerder gepubliceerde studies gebruikten ELISA om aan te tonen dat melatonine aanwezig is in bloedplaatjes. Wij stelden de hypothese dat analyse van melatonine met LC-MS/MS, wat een meer geavanceerde methode is, deze interessante observatie zou bevestigen. Daarom vergeleken we in hoofdstuk 7 de concentraties melatonine die werden

gemeten met LC-MS/MS en ELISA. Van 20 gezonde controles werd bloed afgenomen om 8:00 uur ‘s morgens, aangezien melatonine afgifte een circadiaans ritme volgt. Melatonine concentraties werden geanalyseerd in plaatjesrijk plasma (PRP) en plaatjesarm plasma (PAP) als een proxy voor de melatonine concentratie in bloedplaatjes, omdat het meten in geïsoleerde bloedplaatjes gevoelig is voor artefacten. In tegenstelling tot eerdere resultaten konden wij geen melatonine in bloedplaatjes

- 141 -

detecteren, omdat er geen verschil werd gevonden tussen de concentraties melatonine in PRP en PAP. Dit kan veroorzaakt worden doordat immunoassays gevoeliger zijn voor verstoringen door cross-reactiviteit en matrix verschillen zoals gebruik van PAP versus geïsoleerde bloedplaatjes. Deze observatie benadrukt het belang van goed gevalideerde assays, zoals in deze studie tot het nieuwe inzicht heeft geleid dat melatonine niet aanwezig is in bloedplaatjes.

(8)

9

- 140 -

kynurenine/tryptofaan ratio’s 1,5 keer zo hoog waren in RCC en pNET patiënten in vergelijking met gezonde controles. Dit zou een aanwijzing kunnen zijn dat in het micromilieu van de tumor tryptofaan frequenter wordt omgezet naar kynurenine in plaats van naar serotonine. Ondanks dat we inderdaad een verlaagde concentratie serotonine in bloedplaatjes van RCC en pNET patiënten aantoonden, zou het kunnen dat dit niet alleen te wijten is aan afgifte van serotonine in het micromilieu van de tumor, maar ook door activering van de kynurenine route.

De serotonine transporter op neuronen wordt geblokkeerd door selectieve serotonine heropname remmers (SSRI’s). De transporter wordt niet alleen geblokkeerd op neuronen, maar ook op bloedplaatjes. Daardoor is de serotonine concentratie in bloedplaatjes van SSRI gebruikers verlaagd. Er is slechts beperkte data over de invloed van SSRI’s op de vrije serotonine concentratie in het plasma, wat beschikbaar is voor receptor binding. Daarom hadden we in hoofdstuk 6 als doel om de vrije serotonine

concentratie in het plasma en in bloedplaatjes van SSRI gebruikers te bepalen. We namen voorzorgsmaatregelen om sample contaminatie te voorkomen door zorgvuldige bloedafname, snelle verwerking van de samples, en restricties aangaande het gebruik van overige medicatie en bepaalde voedingsmiddelen. Vrije serotonine concentraties in plasma en bloedplaatjes werden gemeten met LC-MS/MS. De vrije serotonine concentratie was tienmaal zo laag in het plasma en veertien maal zo laag in bloedplaatjes van 64 SSRI gebruikers in vergelijking met gezonde leeftijdgenoten. De SSRI dosering en de bindingsaffiniteit van SSRI’s voor de serotonine transporter waren omgekeerd gecorreleerd met de serotonine concentratie in plasma en bloedplaatjes. De concentratie 5-HIAA, de metaboliet van serotonine, was maar licht verhoogd in het plasma van SSRI gebruikers in vergelijking met gezonde controles. Dit suggereert dat de lage concentraties serotonine die werden gemeten niet werden veroorzaakt door een verhoogde afbraak van serotonine tot 5-HIAA.

Serotonine wordt niet alleen omgezet naar 5-HIAA, maar ook naar melatonine. Eerder gepubliceerde studies gebruikten ELISA om aan te tonen dat melatonine aanwezig is in bloedplaatjes. Wij stelden de hypothese dat analyse van melatonine met LC-MS/MS, wat een meer geavanceerde methode is, deze interessante observatie zou bevestigen. Daarom vergeleken we in hoofdstuk 7 de concentraties melatonine die werden

gemeten met LC-MS/MS en ELISA. Van 20 gezonde controles werd bloed afgenomen om 8:00 uur ‘s morgens, aangezien melatonine afgifte een circadiaans ritme volgt. Melatonine concentraties werden geanalyseerd in plaatjesrijk plasma (PRP) en plaatjesarm plasma (PAP) als een proxy voor de melatonine concentratie in bloedplaatjes, omdat het meten in geïsoleerde bloedplaatjes gevoelig is voor artefacten. In tegenstelling tot eerdere resultaten konden wij geen melatonine in bloedplaatjes

- 141 -

detecteren, omdat er geen verschil werd gevonden tussen de concentraties melatonine in PRP en PAP. Dit kan veroorzaakt worden doordat immunoassays gevoeliger zijn voor verstoringen door cross-reactiviteit en matrix verschillen zoals gebruik van PAP versus geïsoleerde bloedplaatjes. Deze observatie benadrukt het belang van goed gevalideerde assays, zoals in deze studie tot het nieuwe inzicht heeft geleid dat melatonine niet aanwezig is in bloedplaatjes.

(9)

1

- 142 - - 143 -

University of Groningen Studies on the role of dopamine and serotonin in tumors and their microenvironment Peters, Marloes A.M.

CHAPTER 9

9

NEDERLANDSE SAMENVATTING

9

NEDERLANDSE SAMENVATTING

9

9

9

9

1

APPENDIX

Dankwoord