HK07 – Les 2 Sequentiealignering

HK07 – Les 2 Sequentiealignering

Yves Moreau

3de jr. Burg. Ir. Elektrotechniek

Dataverwerking & Automatisatie

2001-2002

Practische regelingen



Cursus



Transparanten



Gedetailleerde lijst van hoofdstukken en aanvullende artikels



Oefenzitting



Afgeven van een kort verslag op het einde van iedere zitting



Les 1 : Essential Cell Biology



Les 2 : Hoofdstuk 2 van Biological sequence analysis

Overzicht



Aligneren van twee sequenties



DNA



Proteïnen



Similariteit vs. homologie



Similariteit



Homologie



Orthologie



Paralogie



Elementen van een alignering



Dynamisch programmeren

Overzicht



Globale alignering



Needleman-Wunsch algoritme



Lokale alignering



Smith-Waterman algoritme



Affiene gapkost



Substitutiematrices



PAM



BLOSUM



Gapkost



Significantieberekening



BLAST

Biologische basis voor alignering

BLAST for discovery

DNA



DNA helix



Complementaire strengen

(A-T, G-C)



Georienteerd van

5’ naar 3’

Proteïne



Groot polymeer op basis van 20 aminozuren

F

L

I M

V

S

P

T

A

Y

H

N

D Q

K

C

R

S W

G

R

Evolutie van sequentiedatabanken



Genbank



SWISSProt

Genomen

Moleculaire evolutie



Genomen evolueren door imperfecte replicatie en natuurlijke selectie



Genduplicaties creëren families van genen

Similariteit vs. homologie



Sequenties zijn similair als ze voldoende gelijkenis vertonen op sequentieniveau (DNA, proteïne, …)



Similariteit kan voortvloeien uit

 Homologie

 Convergentie (functionele bepalingen)

 Toeval



Sequenties zijn homoloog als ze stammen uit een gemeenschappelijke voorouder

 Homologe sequenties zijn paraloog als hun verschillen voortvloeien uit een genduplicatie

 Homologe sequenties zijn ortholoog als hun verschillen niet gerelateerd zijn aan een genduplicatie

Orthologie vs. paralogie

-globin - human

-globin - human

-globin - mouse

-globin - chicken

leghemoglobin - lupin

-globin - chimp

-globin - mouse

myoglobin - whale

Phylogenie



Relaties tussen genen of proteïnen kunnen worden afgeleid op basis van hun sequentie



Reconstructie van de moleculaire evolutie = phylogenie

Homologie voor structuur- en functievoorspelling



Homologe proteïnen hebben gelijkaardige structuren



Homologe proteïnen hebben potentieel gelijkaardige functies

(orthologen: cellulaire rol; paralogen: biochemische functie)

Homologie voor voorspelling op het DNA



Geconserveerde gebieden vloeien voort uit selectiedruk en zijn dus functioneel belangrijk



Genen



Regulatiegebieden



Comparatieve genomica



Genen kunnen voorspeld worden door de vergelijking

van genomen op geschikte evolutieafstand (bvb., muis

en mens)

Principes van alignering

Elementen van een alignering



Type van alignering

 DNA vs. proteïne

 Paarsgewijs vs. meervoudige alignering

 Globale alignering

 Lokale alignering



Scoringsmodel voor aligneringen

 Substituties

 Gaps (inserties, deleties)

 Substitutiematrix en gapkost



Algoritme

 Dynamisch programmeren

 Heuristiek



Significantieberekening

HEAGAWGHE-E

--P-AW-HEAE

Globale alignering

x

y

Globale alignering



Alignering van ‘human alpha globin’ tegen ‘human beta globin’, ‘lupin leghemoglobin’ en ‘glutathionine S-transferase homolog F11G11.2’

(‘+’ voor goede substituties)

HBA_HUMAN GSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKL G+ +VK+HGKKV A+++++AH+D++ +++++LS+LH KL HBB_HUMAN GNPKVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKL HBA_HUMAN GSAQVKGHGKKVADALTNAVAHV---D--

DMPNALSALSDLHAHKL

++ ++++H+ KV + +A ++ +L+ L+++H+ K LGB2_LUPLU

NNPEFQAHAGKVFKLVYEAAIQLQVTGVVVTDATLKNLGSVHVSKG

HBA_HUMAN GSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSD----LHAHKL

Lage similariteit / structurele homologie

Lokale alignering

x

y

Substitutiematrix en gapkost



Het aligneren van twee residus kan meer of minder waarschijnlijk zijn



Om de kwaliteit van een alignering te berekenen, brengt het aligneren van twee residues een winst of kost met zich mee



Substitutiematrix

= BLOSUM50



Gaps hebben ook een kost

R -2 7 -1 -2 -4 1 ………

N -1 -1 7 2 -2 0 ………

D -2 -2 2 8 -4 0 ………

C -1 -4 -2 -4 13 -3 ………

Q -1 1 0 0 -3 7 ………

… ^{… … … … … …} ………

HEAGAWGHE-E --P-AW-HEAE

BLOSUM50 substitutiematrix

Substitutiematrix voor DNA



Standard

A 5 -4 -4 -4

C -4 5 -4 -4

G -4 -4 5 -4

T -4 -4 -4 5

Dynamisch programmeren



Aligneren is het vinden van het minimum-kost/maximum-winst pad door de kosttabel = DYNAMISCH PROGRAMMEREN



Gapkost = -8

* H E A G A W G H E E

* 0 -8 -8 -8 -8 -8 -8 -8 -8 -8 -8 P -8 -2 -1 -1 -2 -1 -4 -2 -2 -1 -1 A -8 -2 -1 5 0 5 -3 0 -2 -1 -1 W -8 -3 -3 -3 -3 -3 15 -3 -3 -3 -3 H -8 10 0 -2 -2 -2 -3 -2 10 0 0 E -8 0 6 -1 -3 -1 -3 -3 0 6 6 A -8 -2 -1 5 0 5 -3 0 -2 -1 -1 E -8 0 6 -1 -3 -1 -3 -3 0 6 6

HEAGAWGHE-E --P-AW-HEAE

-8 -8

-8

-8

-8

Dynamisch programmeren

S

S

S

S

S

S

S

S

5

7

3

4 2 5

2

6 4 3

5 3

5

Kortste pad van S

naar S

Kortste pad van S

naar S

Kortste pad van S

naar S



Optimaliteitsprincipe van Belman



Voorbeeld : vinden van de kortste treinroute tussen twee steden

Aligneringsalgoritmen

Globale alignering



Needleman-Wunsch algoritme



Progressief invullen van een tabel F(i,j) (!!! kolom, rij) die de

maximum winst bijhoudt voor de alignering van sequentie x tot x

met sequentie y tot y



Substitutie matrix s(x, y) en gapkost d



Recurrentie

I G A x

A I G A x

G A x

- - L G V y

G V y

- - S L G V y

{ F(i-1,j-1) + s(x

, y

) substitutie F(i,j) = max { F(i-1,j) – d deletie

{ F(i,j-1) – d insertie

F(0,0) = 0

* H E A G A W G H E E

* 0 -8 -16 -24 -32 -40 -48 -56 -64 -72 -80

P -8 -2 -9 -17 -25 -33 -42 -49 -57 -65 -73

A -16 -10 -3 -4 -12 -20 -28 -36 -44 -52 -60

W -24 -18 -11 -6 -7 -15 -5 -13 -21 -29 -37

H -32 -14 -18 -13 -8 -9 -13 -7 -3 -11 -19

E -40 -22 -8 -16 -16 -9 -12 -15 -7 3 -5

A -48 -30 -16 -3 -11 -11 -12 -12 -15 -5 2

F(i-1,j-1) F(i,j-1) F(i-1,j) F(i,j) s(x

, y

) – d

– d

Start links boven

Vul progressief in met recurrentie Gebruik traceback pointers

{ F(i-1,j-1) + s(x

, y

) F(i,j) = max { F(i-1,j) – d

{ F(i,j-1) – d

Lokale alignering



Smith-Waterman algoritme



Beste alignering tussen subsequenties van x en y



Als de huidige alignering een negatieve score heeft, is het beter een nieuwe alignering te starten

{ 0 restart

{ F(i-1,j-1) + s(x

, y

) substitutie F(i,j) = max { F(i-1,j) – d deletie

{ F(i,j-1) – d insertie

F(0,0) = 0

* H E A G A W G H E E

* 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

A 0 0 0 5 0 5 0 0 0 0 0

W 0 0 0 0 2 0 20 12 4 0 0

H 0 10 2 0 0 0 12 18 22 14 6

E 0 2 16 8 0 0 4 10 18 28 -19

A 0 0 8 21 13 5 0 4 10 20 27

E 0 0 6 13 18 12 4 0 4 16 26

AWGHE AW-HE

Start links boven

Vul progressief in met recurrentie

Traceback vanaf de hoogste score

en stop op nul

Alignering met affiene gapkost



Lineaire kost voor de gap is vaak te streng



Willekeurige gapkost verhoogt complexiteit van O(n

) naar O(n

) (lookbacks op grote afstand)



O(n

) complexiteit voor affiene gapkost = – d – (g – 1)e



Het is dan nodig om drie variabelen M, I

, I

(match, deletie, insertie) te tracken in plaats van enkel F

I G A x

A I G A x

G A x

- - L G V y

G V y

- - S L G V y

M : max score | x

#y

I

: max score | x

# - I

: max score | y

# -



– d – e kleiner dan kleinste substitutiekost om te vermijden dat een deletie direct door een insertie gevolgd wordt



Alignering gevonden door het maximum over de drie variabelen te tracken

Recurrentie

{ M(i-1,j-1) + s(x

, y

) M(i,j) = max { I

(i-1,j-1) + s(x

, y

) { I

(i-1,j-1) + s(x

, y

)

{ M(i-1,j-1) – d I

(i,j) = max { I

(i-1,j-1) – e

{ M(i-1,j-1) – d

I (i,j) = max { I (i-1,j-1) – e

Finite state automaton



Voorstelling van het algoritme als een finite state automaton

M

(+1,+1)

– d

– d s(x

, y

)

s(x

, y

) s(x

, y

)

I

(0,+1) – e

I

(+1,0) – e

Significantieberekening



Laten we kijken naar de distributie van N aligneringscores S t.o.v. random sequenties



Voor een ungapped alignering is de score van een

match de som van veel gelijkaardige random bijdragen en volgt daarom een normale distributie



Voor een normale distributie volgt de distributie van het maximum M

van een reeks van N random variabelen de extreme value distribution (EVD)

P(M

<= x) = exp(–KNe

)

Significantieberekening



Voor ungapped aligneringen heeft (hoewel de random variabelen niet normaal verdeeld zijn) de EVD de vorm

P(S<=x) = exp(Kmne

)

met n lengte van de query, m lengte van de databank



Verwachte score van een random sequentie met

probabiliteit P

voor de aminozuren moet negatief zijn : – 

P

P

s(i,j)<0



Ungapped alignering: parameters afgeleid uit P

and s(i,j)



Gapped aligneringen: parameters geschat via regressie



Een alignering is relevant als de probabiliteit voldoende

laag is (bvb., P<0.01)

Normalizatie van scores



Verschillende substitutiematrices geven verschillende scaleringen van de scores



Met P

and s(i,j) kan de score S van een ungapped

alignering genormalizeerd worden via de twee afgeleide parameters  and K :

S’ = (S – lnK)/ln 2 (uitgedrukt in bits)

Lengtecorrectie



Als de sequenties in de databank van verschillende

lengte zijn, zullen de langere sequenties hogere scores krijgen in het algemeen



Dit kan verbeterd worden door de gemiddelde score als

functie van het logaritme van de lengte te berekenen en

een lineaire functie hierdoor te fitten en af te trekken

Substitutiematrices



Hoe een redelijke substitutiematrix kiezen?



Kijken naar een verzameling van bevestigde aligneringen (met gaps) en de aminozuurfrequenties q

, de

substitutiefrequenties p

, en de gapfunctie f(g) berekenen



Aannemelijkheidsmodel



Random sequenties : P(x,y|R) = 

q



q



Alignering : P(x,y|M) = 

p



Odds ratios : P(x,y|M)/P(x,y|R) = 

p

/(

q



q

)



Log-odds score : S(x,y) = 

s(x

,y

) with s(a,b) = log(p

/q

q

)



Substitutiematrix s(a,b) = log(p

/q

q

)

PAM matrix



Point Accepted Mutation matrix



Problemen



Aligneringen zijn niet onafhankelijk voor gerelateerde proteïnen



Verschillende aligneringen komen overeen met verschillende evolutietijden



PAM1 matrix



Boom van proteïnefamilies



Schat ancestrale sequenties



Schat mutaties op korte evolutieafstand



Scalering naar een substitutiematrix



1% Point Accepted Mutation (PAM1)



PAM250 is 250% Point Accepted Mutations (~20% similariteit) =

250ste macht van PAM1

BLOSUM matrix



BLOCKS SUbstitution Matrix



PAM werkt minder goed op grotere evolutieafstanden



Ungapped aligneringen van proteïnefamilies uit de BLOCKS databank



Groepering van de sequenties met meer dan L%

identieke aminozuren (bvb., BLOSUM62)



Substitutiefrequentie van aminozuren tussen de verschillende groepen (met verbetering i.f.v. de

groepsgrootte) wordt gebruikt om de substitutiematrix af

te leiden

BLAST

BLAST



Voor heel grote databanken is Smith-Waterman lokale alignering te traag



Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) is een snel heuristiek algoritme voor lokale alignering (

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)



BLASTP – proteïnequery op proteïnedatabank



BLASTN – nucleotidequery op nucleotidedatabank



BLASTX – vertaalde nucleotidequery op proteïnedatabank (vertaling naar de zes leesramen)



TBLASTN – proteïnequery op vertaalde nucleotidedatabank



TBLASTX – vertaalde nucleotidequery op vertaalde nucleotidedb

BLASTP



Stap 1 : Vind alle woorden van lengte w (bvb., w=3) waarvoor er een match is in de querysequentie met

score groter of gelijk aan T (bvb., T=11) met de gekozen substitutiematrix (bvb., BLOSUM62 met gapkost 10+g)



Stap 2 : Gebruik een finite state automaton om alle

matches met de woordlijst te vinden in de databank

(hits)

BLASTP



Stap 3 : Check voor welke hits er een andere hit zonder overlap bestaat binnen een afstand van A (bvb., A=40) (de afstand moet dezelfde zijn op de query als op de target) (two-hits)



Stap 4 : Breid de linkse hit van de two-hits uit in beide

richtingen via ungapped alignering ; stop de uitbreiding

wanneer de score met X

(bvb., X

=40) valt onder de

beste score dusver (high scoring segment pair HSP)

BLASTP



Stap 5 : Breid de HSPs met genormalizeerde score boven S

(S

=22 bits) via gapped alignering en stop de uitbreiding wanneer de score met X

(bvb., X

=40) valt onder de beste score tot nu toe ; selecteer de beste gapped lokale alignering



Stap 6 : Bereken de significantie van de aligneringen ; voor de significante aligneringen herhaal de gapped

aligneringen met een hogere dropoff parameter X

voor

meer nauwkeurigheid

BLASTP

Query

T ar ge t

Two-hits

+ +

+ + +

+

+ +

+

+ +

+

+

+ +

+ +

+ +

+

+ +

+

+ + +

+

+ + + +

+ +

+

+

Hits

Lokale alignering

Protein family Query

(SWISS-PROT) Smith-

Waterman BLAST (# matches)

Serine protease P00762 275 275

Serine protease inhibitor P01008 108 108

Ras P01111 255 252

Globin P02232 28 28

Hemagglutinin P03435 128 128

Interferon alpha P05013 53 53

Alcohol dehydrogenase P07327 138 137

Histocompatibility antigen P10318 262 261

Cytochrome P450 P10635 211 211

Glutathione transferase P14942 83 81

H⁺-transport ATP synthase P20705 198 197

Running time 36 0.34

BLASTP voorbeeld

Samenvatting



Similariteit vs. homologie



Dynamisch programmeren



Lokale alignering



Needleman – Wunsch



Globale alignering



Smith – Waterman



Affiene gapkost



Substitutiematrices



PAM



BLOSUM



Significantieberekening



BLAST