HK07 – Les 2 Sequentiealignering

HK07 – Les 2

Sequentiealignering

Yves Moreau 3de jr. Burg. Ir. Elektrotechniek Dataverwerking & Automatisatie

Practische regelingen

n _Cursus

n Transparanten

n Gedetailleerde lijst van hoofdstukken en aanvullende artikels

n Oefenzitting

n Afgeven van een kort verslag op het einde van iedere zitting

n Les 1 : Essential Cell Biology

Overzicht

n Aligneren van twee sequenties

n DNA n Proteïnen n Similariteit vs. homologie n Similariteit n Homologie n Orthologie n Paralogie

n Elementen van een alignering n _{Dynamisch programmeren}

Overzicht

n Globale alignering n Needleman-Wunsch algoritme n Lokale alignering n Smith-Waterman algoritme n Affiene gapkost n Substitutiematrices n PAM n BLOSUM n Gapkost n Significantieberekening n BLAST

DNA

n DNA helix n Complementaire strengen (A-T, G-C) n Georienteerd van 5’ naar 3’

Proteïne

n Groot polymeer op basis van 20 aminozuren F L I M V S P T A Y H N D Q K E C R S W G R

Evolutie van sequentiedatabanken

n Genbank n _SWISSProt

Moleculaire evolutie

n Genomen evolueren door imperfecte replicatie en

natuurlijke selectie

Similariteit vs. homologie

n _{Sequenties zijn similair als ze voldoende gelijkenis vertonen op}

sequentieniveau (DNA, proteïne, …)

n Similariteit kan voortvloeien uit

n Homologie

n Convergentie (functionele bepalingen)

n Toeval

n _{Sequenties zijn homoloog als ze stammen uit een}

gemeenschappelijke voorouder

n Homologe sequenties zijn paraloog als hun verschillen voortvloeien uit

een genduplicatie

n Homologe sequenties zijn ortholoog als hun verschillen niet gerelateerd

Orthologie vs. paralogie

δ-globin - hu man β-globin - human β-globin - mouse β-globin -ch icken leghemoglob in - lupin α-globin - ch imp α-globin -mouse myog lobin -wha le

Phylogenie

n Relaties tussen genen of proteïnen kunnen worden afgeleid op

basis van hun sequentie

Homologie voor structuur- en

functievoorspelling

n Homologe proteïnen hebben gelijkaardige structuren

n _{Homologe proteïnen hebben potentieel gelijkaardige functies}

Homologie voor voorspelling op het DNA

n Geconserveerde gebieden vloeien voort uit selectiedruk

en zijn dus functioneel belangrijk

n Genen

n Regulatiegebieden

n Comparatieve genomica

n Genen kunnen voorspeld worden door de vergelijking

van genomen op geschikte evolutieafstand (bvb., muis en mens)

Elementen van een alignering

n _{Type van alignering}

n DNA vs. proteïne

n Paarsgewijs vs. meervoudige alignering

n Globale alignering

n Lokale alignering

n Scoringsmodel voor aligneringen

n Substituties

n Gaps (inserties, deleties)

n Substitutiematrix en gapkost n Algoritme n Dynamisch programmeren n Heuristiek n _{Significantieberekening}

HEAGAWGHE-E

--P-AW-HEAE

Globale alignering

x y

Globale alignering

n Alignering van ‘human alpha globin’ tegen ‘human beta globin’, ‘lupin

leghemoglobin’ en ‘glutathionine S-transferase homolog F11G11.2’ (‘+’ voor goede substituties)

HBA_HUMAN GSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKL G+ +VK+HGKKV A+++++AH+D++ +++++LS+LH KL HBB_HUMAN GNPKVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKL HBA_HUMAN GSAQVKGHGKKVADALTNAVAHV---D--DMPNALSALSDLHAHKL ++ ++++H+ KV + +A ++ +L+ L+++H+ K LGB2_LUPLU NNPEFQAHAGKVFKLVYEAAIQLQVTGVVVTDATLKNLGSVHVSKG HBA_HUMAN GSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSD----LHAHKL GS+ + G + +D L ++ H+ D+ A +AL D ++AH+ F11G11.2 GSGYLVGDSLTFVDLL--VAQHTADLLAANAALLDEFPQFKAHQE Sterke homologie

Lage similariteit / structurele homologie

Lokale alignering

x y

Substitutiematrix en gapkost

n Het aligneren van twee residus kan meer of minder waarschijnlijk zijn n _{Om de kwaliteit van een alignering te berekenen, brengt het aligneren}

van twee residues een winst of kost met zich mee

n _{Substitutiematrix}

= BLOSUM50

n _{Gaps hebben ook een kost}

……… … … … … … … … ……… 7 -3 0 0 1 -1 Q ……… -3 13 -4 -2 -4 -1 C ……… 0 -4 8 2 -2 -2 D ……… 0 -2 2 7 -1 -1 N ……… 1 -4 -2 -1 7 -2 R ……… -1 -1 -2 -1 -2 5 A EGHILKMFPSTWYV Q C D N R A HEAGAWGHE-E --P-AW-HEAE BLOSUM50 substitutiematrix

Substitutiematrix voor DNA

n Standard 5 -4 -4 -4 T -4 5 -4 -4 G -4 -4 5 -4 C -4 -4 -4 5 A T G C A

Dynamisch programmeren

n Aligneren is het vinden van het minimum-kost/maximum-winst pad

door de kosttabel = DYNAMISCH PROGRAMMEREN

n _{Gapkost = -8} -8 -8 -8 -8 -8 -8 -8 0 * -8 -8 -8 -8 -8 -8 -8 -8 -8 -8 * 6 -1 6 0 -3 -1 -1 E 6 -1 6 0 -3 -1 -1 E 0 -2 0 10 -3 -2 -2 H -3 -3 -1 -3 -1 6 0 E 0 -3 5 0 5 -1 -2 A -3 -3 -1 -3 -1 6 0 E -2 -3 -2 -2 -2 0 10 H -3 15 -3 -3 -3 -3 -3 W 0 -3 5 0 5 -1 -2 A -2 -4 -1 -2 -1 -1 -2 P G W A G A E H HEAGAWGHE-E --P-AW-HEAE -8 -8 -8 -8 -8

Dynamisch programmeren

S₁ S₂ S₃ S₄ S₅ S₇ S₆ S₈ 5 7 3 4 2 5 2 6 4 3 5 3 5 Kortste pad van S₁ naar S₈

Kortste pad van S₁ naar S₅ Kortste pad van S₅ naar S₈

n Optimaliteitsprincipe van Belman

Globale alignering

n Needleman-Wunsch algoritme

n Progressief invullen van een tabel F(i,j) (!!! kolom, rij) die de

maximum winst bijhoudt voor de alignering van sequentie x tot x_i met sequentie y tot y_j

n _{Substitutie matrix s(x, y) en gapkost d} n Recurrentie

I G A x_i A I G A x_i G A x_i

-L G V y_j G V y_j - - S L G V y_j

{ F(i-1,j-1) + s(x_i, y_j) substitutie

F(i,j) = max { F(i-1,j) – d deletie

{ F(i,j-1) – d insertie

-56 -48 -40 -32 -24 -16 -8 0 * -80 -72 -64 -56 -48 -40 -32 -24 -16 -8 * 1 2 -5 -19 -37 -60 -73 E -9 -5 3 -11 -29 -52 -65 E -12 -15 -7 -3 -21 -44 -57 H -15 -14 -12 -6 -11 -24 -38 E -12 -12 -11 -11 -3 -16 -30 A -15 -12 -9 -16 -16 -8 -22 E -7 -13 -9 -8 -13 -18 -14 H -13 -5 -15 -7 -6 -11 -18 W -36 -28 -20 -12 -4 -3 -10 A -49 -42 -33 -25 -17 -9 -2 P G W A G A E H F(i,j) F(i-1,j) F(i,j-1) F(i-1,j-1) s(x_i, y_j) – d – d

Start links boven

Vul progressief in met recurrentie Gebruik traceback pointers

{ F(i-1,j-1) + s(x_i, y_j)

F(i,j) = max { F(i-1,j) – d { F(i,j-1) – d

Lokale alignering

n Smith-Waterman algoritme

n Beste alignering tussen subsequenties van x en y

n Als de huidige alignering een negatieve score heeft, is

het beter een nieuwe alignering te starten

{ 0 restart

{ F(i-1,j-1) + s(x_i, y_j) substitutie

F(i,j) = max { F(i-1,j) – d deletie

{ F(i,j-1) – d insertie

6 14 22 18 12 0 0 0 2 10 0 H 0 0 0 0 0 0 0 * 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 * 26 27 -19 0 0 0 E 16 20 28 0 0 0 E 4 10 18 4 0 0 H 0 4 12 18 13 6 0 E 4 0 5 13 21 8 0 A 10 4 0 0 8 16 2 E 12 20 0 2 0 0 0 W 0 0 5 0 5 0 0 A 0 0 0 0 0 0 0 P G W A G A E H AWGHE AW-HE

Start links boven

Vul progressief in met recurrentie Traceback vanaf de hoogste score en stop op nul

Alignering met affiene gapkost

n Lineaire kost voor de gap is vaak te streng

n Willekeurige gapkost verhoogt complexiteit van O(n2₎

naar O(n3_{) (lookbacks op grote afstand)}

n O(n2_{) complexiteit voor affiene gapkost = – d – (g – 1)e}

n Het is dan nodig om drie variabelen M, I_x, I_y (match,

deletie, insertie) te tracken in plaats van enkel F

I G A x_i A I G A x_i G A x_i

-L G V y_j G V y_j - - S L G V y_j

-n – d – e kleiner dan kleinste substitutiekost om te vermijden dat een deletie direct door een insertie gevolgd wordt

n _{Alignering gevonden door het maximum over de drie variabelen te}

tracken

Recurrentie

{ M(i-1,j-1) + s(x_i, y_j)

M(i,j) = max { I_x(i-1,j-1) + s(x_i, y_j) { I_y(i-1,j-1) + s(x_i, y_j) { M(i-1,j-1) – d

I_x(i,j) = max { I_x(i-1,j-1) – e { M(i-1,j-1) – d

Finite state automaton

n Voorstelling van het algoritme als een finite state automaton

M (+1,+1) – d – d s(x_i, y_j) s(x_i, y_j) s(x_i, y_j) I_y (0,+1) – e I_x (+1,0) – e

Significantieberekening

n Laten we kijken naar de distributie van N

aligneringscores S t.o.v. random sequenties

n Voor een ungapped alignering is de score van een

match de som van veel gelijkaardige random bijdragen en volgt daarom een normale distributie

n Voor een normale distributie volgt de distributie van het

maximum M_N van een reeks van N random variabelen de extreme value distribution (EVD)

Significantieberekening

n Voor ungapped aligneringen heeft (hoewel de random

variabelen niet normaal verdeeld zijn) de EVD de vorm

P(S<=x) = exp(Kmne−λS₎

met n lengte van de query, m lengte van de databank

n Verwachte score van een random sequentie met

probabiliteit P_i voor de aminozuren moet negatief zijn : – ∑_i,j P_iP_js(i,j)<0

n Ungapped alignering: parameters afgeleid uit P_i and s(i,j) n Gapped aligneringen: parameters geschat via regressie n _{Een alignering is relevant als de probabiliteit voldoende}

Normalizatie van scores

n Verschillende substitutiematrices geven verschillende

scaleringen van de scores

n Met P_i and s(i,j) kan de score S van een ungapped

alignering genormalizeerd worden via de twee afgeleide parameters λ and K :

Lengtecorrectie

n Als de sequenties in de databank van verschillende

lengte zijn, zullen de langere sequenties hogere scores krijgen in het algemeen

n _{Dit kan verbeterd worden door de gemiddelde score als}

functie van het logaritme van de lengte te berekenen en een lineaire functie hierdoor te fitten en af te trekken

Substitutiematrices

n Hoe een redelijke substitutiematrix kiezen? n Kijken naar een verzameling van bevestigde

aligneringen (met gaps) en de aminozuurfrequenties q_a, de substitutiefrequenties p_ab, en de gapfunctie f(g)

berekenen

n _{Aannemelijkheidsmodel}

n Random sequenties : P(x,y|R) = Π_iq_xiΠ_jq_yj n Alignering : P(x,y|M) = Π_ip_xixj

n Odds ratios : P(x,y|M)/P(x,y|R) = Π_ip_xixj/(Π_iq_xiΠ_jq_yj)

n Log-odds score : S(x,y) = Σ_is(x_i,y_i) with s(a,b) = log(p_ab/q_aq_b)

PAM matrix

n Point Accepted Mutation matrix n _Problemen

n Aligneringen zijn niet onafhankelijk voor gerelateerde proteïnen

n Verschillende aligneringen komen overeen met verschillende

evolutietijden

n PAM1 matrix

n Boom van proteïnefamilies

n Schat ancestrale sequenties

n Schat mutaties op korte evolutieafstand

n Scalering naar een substitutiematrix

n 1% Point Accepted Mutation (PAM1)

n PAM250 is 250% Point Accepted Mutations (~20% similariteit) =

BLOSUM matrix

n BLOCKS SUbstitution Matrix

n _{PAM werkt minder goed op grotere evolutieafstanden} n Ungapped aligneringen van proteïnefamilies uit de

BLOCKS databank

n Groepering van de sequenties met meer dan L%

identieke aminozuren (bvb., BLOSUM62)

n Substitutiefrequentie van aminozuren tussen de

verschillende groepen (met verbetering i.f.v. de

groepsgrootte) wordt gebruikt om de substitutiematrix af te leiden

BLAST

n Voor heel grote databanken is Smith-Waterman lokale

alignering te traag

n _{Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) is een snel}

heuristiek algoritme voor lokale alignering (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)

n BLASTP – proteïnequery op proteïnedatabank

n BLASTN – nucleotidequery op nucleotidedatabank

n BLASTX – vertaalde nucleotidequery op proteïnedatabank

(vertaling naar de zes leesramen)

n TBLASTN – proteïnequery op vertaalde nucleotidedatabank

BLASTP

n Stap 1 : Vind alle woorden van lengte w (bvb., w=3)

waarvoor er een match is in de querysequentie met

score groter of gelijk aan T (bvb., T=11) met de gekozen substitutiematrix (bvb., BLOSUM62 met gapkost 10+g)

n Stap 2 : Gebruik een finite state automaton om alle

matches met de woordlijst te vinden in de databank (hits)

BLASTP

n Stap 3 : Check voor welke hits er een andere hit zonder

overlap bestaat binnen een afstand van A (bvb., A=40) (de afstand moet dezelfde zijn op de query als op de target) (two-hits)

n Stap 4 : Breid de linkse hit van de two-hits uit in beide

richtingen via ungapped alignering ; stop de uitbreiding wanneer de score met X_g (bvb., X_g=40) valt onder de

BLASTP

n Stap 5 : Breid de HSPs met genormalizeerde score

boven S_g (S_g =22 bits) via gapped alignering en stop de uitbreiding wanneer de score met X_g (bvb., X_g=40) valt onder de beste score tot nu toe ; selecteer de beste gapped lokale alignering

n Stap 6 : Bereken de significantie van de aligneringen ;

voor de significante aligneringen herhaal de gapped

aligneringen met een hogere dropoff parameter X_g voor meer nauwkeurigheid

BLASTP

Query Target Two-hits + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Hits Lokale alignering

0.34 36 Running time 197 198 P20705 H+_{-transport ATP synthase}

81 83 P14942 Glutathione transferase 211 211 P10635 Cytochrome P450 261 262 P10318 Histocompatibility antigen 137 138 P07327 Alcohol dehydrogenase 53 53 P05013 Interferon alpha 128 128 P03435 Hemagglutinin 28 28 P02232 Globin 252 255 P01111 Ras 108 108 P01008 Serine protease inhibitor

275 275 P00762 Serine protease BLAST (# matches) Smith-Waterman Query (SWISS-PROT) Protein family

BLASTP example

Samenvatting

n _{Similariteit vs. homologie} n Dynamisch programmeren n _{Lokale alignering} n Needleman – Wunsch n Globale alignering n Smith – Waterman n Affiene gapkost n Substitutiematrices n PAM n BLOSUM n Significantieberekening n BLAST