A FRET-based method to study the activity of electron or oxygen transfer proteins and redox enzymes
Zauner, G.
Citation
Zauner, G. (2008, October 23). A FRET-based method to study the activity of electron or oxygen transfer proteins and redox enzymes. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/13201
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/13201
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
Summary
Summary in English, Dutch and German
Summary
A cell needs all the players within its cell envelope in order to fullfill its tasks efficiently. Proteins have an essential role in this picture; they are required for many biological functions and their duties are wide spread. Proteins are large biomolecules consisting of a chain of amino acids that folds into a specific three dimensional structure. Proteins which are involved in redox events require an additional atom or small molecule in order to carry out specific redox reactions. They are therefore called redox proteins, which are the main topic of the research summarized in this thesis.
In order to follow the activity of the proteins, one needs a reliable method for detection. We aimed for fluorescence spectroscopy; in general the absorption spectrum of a redox protein serves as its fingerprint due to the characteristic properties of the redox cofactor which is changing depending on the redox state of the prosthethic group. By attaching a fluorescent molecule to the protein surface, it was possible to translate the above described intrinsic changes of the protein’s absorption spectrum into the emission of the linked fluorophore by means of Förster Resonance Energy Transfer (FRET). In Chapter I, a brief overview of the phenomenon of fluorescence is presented including a general introduction to the processes occurring between absorption and emission of light on the basis of the Jablonski diagram. Natural fluorophores and fluorescent probes are introduced as well as the different ways of reacting a fluorescent dye molecule with a specific residue on the surface of the protein of interest. Furthermore the theory behind FRET is discussed. Finally the prosthetic groups used in the experimental work of this thesis are introduced. This chapter also contains the objectives and outline of the thesis research.
The determination of the redox state of a redox protein can provide information about the function of the particular protein in general. If a protein passes an electron
on to the next molecule, it is known as ‘electron transfer’ (ET) protein. When conversion of a substrate is involved, i.e. the electron taken up is further used in a chemical reaction, one speaks of a redox enzyme. An investigation of such reactions is relevant for a better understanding of the function and mechanism of the protein/enzyme.
In Chapter II a new method based on fluorescence is introduced; it is shown that the approach can be applied to various redox proteins harbouring different active sites tested for proteins containing three types of prosthetic groups: a type-I copper site (azurin, amicyanin, plastocyanin and pseudoazurin), a heme group (cytochrome c550) and a flavin mononucleotide (flavodoxin). This method permits to reliably distinguish between reduced and oxidized proteins and to perform potentiometric titrations at submicromolar concentrations.
One particular extended application of the FRET based method, the ‘sensitized fluorescence approach’, is described in Chapter III. It employs so called type 3 copper proteins (such as tyrosinase and hemocyanin), which are capable of transporting oxygen in their active site. The protein, which was mainly tyrosinase from the soil bacterium Streptomyces antibioticus, has been covalently labeled with a variety of fluorescent dye molecules with emission maxima spanning the whole visible wavelength range. This method exploits the sensitivity of the endogenous fluorescence of type-3 copper proteins towards the presence of oxygen by translating the near-UV emission of the protein to label fluorescence in the visible range through a FRET mechanism. The label contrast between O2-free and O2-bound protein can be made to exceed the contrast observed for the tryptophan fluorescence. Another additional benefit is the possibility to monitor more than one construct at the same time leading to oxygen determinations with increased accuracy. A fluorescence-based biocompatible system to sense oxygen in solution is described.
Chapter IV can be seen as an extension of Chapter III, because the same construct (a type-3 copper protein labeled with a fluorophore) is used to sense oxygen. In the measurements described hemocyanin from Octopus vulgaris labeled with Cy5 is immobilized into two different optically transparent silica matrices, therefore providing us with a solid state oxygen sensing device for monitoring the concentration of oxygen in the gaseous as well as in the liquid phase. The polymeric materials for the encapsulation of the protein (tetramethoxysilicate and waterglass) appeared to be of same utility in our case. The present implementation of labeled hemocyanin as an oxygen sensor features a fast response, biocompatibility, reusability and outstanding stability.
Another application of the FRET based principle is described in Chapter V that concerns the P450 family of enzymes, which is of wide interest among scientists particularly due to their catalytic abilities. Here P450cam from Pseudomonas putida was labeled to monitor substrate binding to the active site of the protein. Two different substrates have been chosen to investigate the affinity to the active site of the enzyme by monitoring the emission of a linked fluorophore. The dissociation constants for both substrates were accurately determined as the values found match the data acquired by absorption spectroscopy. This method permits to perform fluorescence titrations at submicromolar concentrations of P450cam, which will be applicable to a wide range of P450’s.
All the measurements described so far have in common that they were monitored in an ensemble. There are, however, also specialized instruments to follow molecules individually. The challenge in this field was to demonstrate that our method holds promise also on the single molecule level, which is mainly dependent on the photophysical stability of the fluorescence dye attached to the protein/enzyme. The other important factor is to find an immobilization scheme for the labeled enzyme allowing it to keep its unrestrained activity. In Chapter VI the first single molecule approach employing our FRET based method is introduced. The enzyme investigated
in this study was copper-containing nitrite reductase from Alcaligenes faecalis S-6 immobilized on a glass surface. From the fluorescence time traces of the enzyme monitored under turn-over conditions, the kinetic parameters could be extracted and connected to the macroscopic ensemble averaged kinetic constants. The described approach allows to open up new vistas in the field of single-redox enzyme studies and the precise investigation of the underlying kinetics.
Finally in Chapter VII the main outcome of the thesis work is described. The major finding for each individual chapter is highlighted and recapitulatory the overriding advantages of the FRET based methodology are listed. A short outlook for the future is given; experiments in relation to the suggestions in this thesis are ongoing in our laboratory.
Samenvatting
Een cel heeft alle spelers in de cel nodig om haar taken efficiënt uit te kunnen voeren. Hierbij zijn eiwitten van cruciaal belang; ze zijn nodig voor vele biologische functies en hun taken zijn zeer divers. Eiwitten zijn grote biomoleculen. Ze bestaan uit een keten van aminozuren die wordt gevouwen tot een specifieke driedimensionale structuur. Eiwitten die betrokken zijn bij redoxreacties hebben een extra atoom of klein molecuul nodig om specifieke redoxreacties uit te kunnen voeren. Deze zogenoemde redoxeiwitten zijn het hoofdonderwerp van dit proefschrift.
Om de activiteit van een eiwit te kunnen bestuderen is een betrouwbare detectiemethode nodig. Wij hebben voor fluorescentiespectroscopie gekozen.
Omdat de karakteristieke eigenschappen van de redoxcofactor afhankelijk zijn van de redox toestand van de prosthetische groep kan het absorptiespectrum van een redoxeiwit in het algemeen worden gebruikt als een soort vingerafdruk van het eiwit. Door een fluorescerend molecuul aan het eiwit te koppelen is het gelukt om de bovengenoemde veranderingen in het absorptiespectrum van het eiwit te “vertalen” naar de emissie van de gekoppelde fluorofoor via Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Hoofdstuk I geeft een kort overzicht van het fenomeen fluorescentie, inclusief een algemene introductie van de processen die plaatsvinden tussen de absorptie en emissie van licht op basis van het Jablonskidiagram. Tevens worden in de natuur voorkomende fluoroforen en fluorescerende probes geïntroduceerd, tezamen met verschillende manieren om een fluorescerend klein molecuul te laten reageren met een specifiek residue aan het oppervlak van een eiwit. Verder wordt de theorie van FRET behandeld en tot slot worden de prosthetische groepen die
voor het experimentele werk in dit proefschrift gebruikt zijn, geïntroduceerd.
Dit hoofdstuk bevat bovendien ook de doelstellingen en een overzicht van het onderzoek.
Het bepalen van de redoxtoestand van een redoxeiwit kan informatie verschaffen over het algemene functioneren van het eiwit. Als een eiwit een elektron afgeeft aan een ander molecuul wordt het een electron transfer (ET) eiwit genoemd. Als er ook sprake is van omzetting van een substraat, waneer het afgegeven elektron wordt gebruikt in een chemische reactie, spreekt men van een redoxenzym. Het onderzoeken van dergelijke redoxreacties is van belang om de functie en het mechanisme van het enzym/eiwit beter te kunnen begrijpen.
In hoofdstuk II wordt een nieuwe methode geïntroduceerd gebaseerd op fluorescentie; er wordt gedemonstreerd dat deze methode toegepast kan worden op verschillende redoxeiwitten met verschillende actieve centra. De methode is getest voor eiwitten met drie soorten van prosthetische groepen:
type-I kopercentra (azurine, amicyanine, plastocyanine en pseudoazurine), heemgroepen (cytochrome c550) en flavine mononucleotiden (flavodoxine).
Deze methode maakt het betrouwbaar onderscheiden van gereduceerde en geoxideerde eiwitten mogelijk, evenals potentiometrische titraties bij submicromolaire concentraties.
Een specifieke toepassing van de op FRET gebaseerde methode, de ‘sensitized fluorescence approach’, wordt in hoofdstuk III beschreven. De methode maakt gebruik van zogenaamde type-3 kopereiwitten (bijvoorbeeld tyrosinase en hemocyanine), die in staat zijn zuurstof te transporteren. Aan het eiwit, in
de meeste gevallen tyrosinase van de grondbacterie Streptomyces antibioticus, werden verschillende fluorescerende kleurstofmoleculen gekoppeld. Deze kleurstofmoleculen beslaan met hun emissiemaxima samen alle golflengten van het zichtbare spectrum van licht. De methode maakt gebruik van de gevoeligheid van de endogene fluorescentie van type-3 kopereiwitten voor de aanwezigheid van zuurstof, door de nabije-ultravioletemissie van het eiwit te vertalen naar label fluorescentie in het zichtbare deel van het spectrum middels een FRET-mechanisme. Het label contrast tussen O2-vrij en O2-gebonden eiwit kan groter worden gemaakt dan het contrast dat te zien is bij de tryptofaan-fluorescentie. Een ander voordeel is de mogelijkheid om meerdere constructen tegelijk te observeren, dat tot zuurstofbepalingen met hogere nauwkeurigheid leidt. Een op fluorescentie gebaseerd biocompatibel systeem om zuurstof in een oplossing te meten wordt beschreven.
Hoofdstuk IV kan worden gezien als een voortzetting van hoofdstuk III omdat hetzelfde construct (een type-3 kopereiwit gelabeld met een fluorofoor) wordt gebruikt om zuurstof te detecteren. In de hier beschreven metingen wordt hemocyanine van Octopus vulgaris, waar Cy5 aan is gekoppeld, geïmmobiliseerd in twee verschillende optisch transparante silicamatrices.
Daarmee wordt een vastestof preparaat verkregen dat als basis kan dienen voor zuurstofdetectie in zowel de gasfase als de vloeistoffase. De twee polymeren die hier zijn gebruikt om het eiwit in te kapselen (tetramethoxysilicaat en waterglas), bleken in ons geval allebei even goed te werken. Als zuurstofsensor werken beide preparaten snel, en ze zijn biocompatibel, herbruikbaar en bezitten een uitstekende stabiliteit.
Een andere toepassing van het op FRET gebaseerde principe wordt in hoofdstuk V beschreven. Dit hoofdstuk betreft de P450 familie van enzymen, welke van groot belang zijn vanwege hun katalytische eigenschappen. Wij hebben P450cam van Pseudomonas putida gelabeld om het binden van substraat in de actieve plaats van het eiwit te observeren. Twee verschillende substraten werden gekozen om de affiniteit voor de actieve plaats van het enzym te onderzoeken via de emissie van een gekoppeld fluorofoor. De dissociatieconstanten voor allebei de substraten werden nauwkeurig bepaald en kwamen goed overeen met de waarden bepaald met absorptiespectroscopie.
Deze methode maakt het mogelijk om fluorescentietitraties bij submicromolaire concentraties uit te voeren, wat van toepassing kan zijn op een breed scala van P450s.
Alle bovengenoemde metingen hadden een ding gemeen: een ensemble van moleculen werd bestudeerd. Er zijn echter ook gespecialiseerde instrumenten om individuele moleculen te volgen. De uitdaging was om aan te tonen dat onze methode ook bruikbaar is op het niveau van enkelvoudige moleculen. Dit hangt voornamelijk af van de fotostabiliteit van het aan het eiwit gekoppelde fluorescerende kleurstoflabel. Een tweede belangrijke factor is om een immobilisatieschema te vinden voor het gelabelde enzym dat de activiteit van het enzym niet beïnvloedt. In hoofdstuk VI worden de eerste ‘single molecule’
experimenten met onze op FRET gebaseerde methode gerapporteerd.
Allereerst werd het koper bevattende nitrietreductase van Alcaligenes faecalis S-6 geïmmobiliseerd op een glasoppervlak. Door de fluorescentie ‘timetraces’ van het enzym te bestuderen onder omstandigheden waarbij substraatomzet plaats vond, konden de kinetische parameters worden bepaald en gerelateerd aan de macroscopische kinetische constanten gemeten aan ensembles van moleculen.
De hier beschreven aanpak geeft de mogelijkheid tot het verkrijgen van nieuwe uitzichten op het gebied van ‘single-redox’ enzymstudies en het precieze onderzoek van de onderliggende kinetiek.
Ten slotte worden in hoofdstuk VII de belangrijkste resultaten van dit proefschrift beschreven. De belangrijkste bevinding voor elk hoofdstuk wordt benadrukt en de voordelen van de op FRET gebaseerde methode worden samengevat. Een kort vooruitzicht op het toekomstige onderzoek wordt gegeven; experimenten om de nieuwe mogelijkheden te verkennen, die in dit proefschrift naar voren zijn gebracht, worden op dit moment in ons laboratorium uitgevoert.
Zusammenfassung
Eine Zelle braucht alle Mitglieder innerhalb ihres ‘Netzwerkes’ um effizient arbeiten zu können. Proteine spielen eine essentielle Rolle in diesem Bild, da sie für verschiedenste biologische Funktionen nötig sind. Sie erfüllen deshalb unterschiedlichste Aufgaben. Proteine sind große Biomoleküle, die aus einer in einer spezifischen dreidimensionalen Struktur gefalteten Kette von Aminosäuren bestehen. Proteine, die in Redox-Abläufen involviert sind, auch Redoxproteine genannt, brauchen zusätzlich ein Atom oder ein kleines Molekül um spezifische Redoxreaktionen durchzuführen. Diese bilden das Fundament dieser Dissertation.
Um der Aktivität von Proteinen zu folgen, ist eine verlässliche Detektionsmethode unumgänglich. Wir haben dafür Fluoreszenz angewendet.
Üblicherweise wird das Absorptionsspektrum eines Proteins, welches sich aufgrund von charakteristischen Eigenschaften des Redox Cofaktors verändert, zur Identifizierung verwendet. Durch die kovalente Verknüpfung eines fluoreszierenden Moleküls mit der Oberfläche des Proteins war es mittels Förster Resonance Energy Transfer (FRET) möglich die voran beschriebenen intrinsischen Veränderungen in der Proteinabsorption in die Emission des verknüpften Fluorophors zu übertragen. Kapitel I bietet einen kurzen Überblick über das Phänomen der Fluoreszenz und gibt anhand des Jablonski Diagramms eine generellen Einführung zu den Prozessen die zwischen Lichtabsorption und Emission passieren. Weiters werden natürliche Fluorophore und fluoreszierende Proben vorgestellt und die verschiedenen Möglichkeiten einen fluoreszierenden Farbstoff spezifisch mit einer Gruppe auf der Oberfläche eines Proteins zu verknüpfen. Darüber hinaus wird die
grundlegende Theorie von FRET diskutiert. Schlußendlich werden die verschiedenen prostethischen Gruppen, die in der experimentellen Arbeit dieser Dissertation verwendet werden, vorgestellt. Dieses Kapitel beinhaltet auch die Ziele und den Überblick der durchgeführten wissenschaftlichen Arbeit.
Die Bestimmung des Redox-Zustandes eines Redoxproteins kann generelle Informationen über die Funktion dieses Proteins liefern. Wenn ein Protein ein Elektron zwischen Molekülen weitergibt, nennt man es auch ein Elektronentransferprotein. Ist auch eine Substratumwandung involviert, zum Beispiel wenn ein aufgenommenes Elektron in einer chemischen Reaktion weiter verwendet wird, spricht man von einem Redoxenzym. Die Untersuchung von solchen Reaktionen ist relevant um die Funktion und den Mechanismus von Proteinen/Enzymen besser zu verstehen.
In Kapitel II wird eine neue, auf Fluoreszenz basierende Methode vorgestellt und es wird gezeigt, daß dieser Ansatz auf verschiedene Redoxproteine (mit unterschiedlichen Cofaktoren) angewendet werden kann. Proteine mit drei verschiedenen prostethischen Gruppen werden getestet: Eine Type-1 Cu Gruppe (Azurin, Amicyanin, Plastocyanin und Pseudoazurin), eine Heme Gruppe (Cytochrome c550) und ein Flavinmononucleotid (Flavodoxin). Diese Methode erlaubt zuverlässig zwischen reduzierten und oxidierten Proteinen zu differenzieren und außerdem potenziometrische Titrationen in submikromolaren Konzentrationen durchzuführen.
Eine spezielle, erweiterte Anwendung von unserer auf FRET basierenden Methode, ist die im Kapitel III beschriebene sensibilisierte Version. Hier
werden sogenannte Type-3 Kupfer Proteine (wie unter anderem Tyrosinase und Hemocyanin) verwendet, welche molekularen Sauerstoff binden und transportieren können. Das Protein, in unserem Fall hauptsächlich Tyrosinase vom Bakterium Streptomyces antibioticus, wird kovalent mit verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen verknüpft, von deren Emissionsspektren der ganze sichtbare Wellenlängenbereich abdeckt wird. Diese Methode macht Gebrauch von der Sensitivität der endogenen Fluoreszenz von Type-3 Kupfer Proteinen, um die Präsenz von Sauerstoff nachzuweisen. Die intrinsische Emission der Proteine wird über einen auf FRET basierenden Mechanismus in die Fluoreszenz des kovalent gebundenen Farbstoffes übertragen. Der Farbstoffkontrast zwischen Sauerstoff-freiem und Sauerstoff-gebundenem Protein kann so manipuliert werden, daß der Kontrast größer ist als der für die Tryptophanfluoreszenz. Ein anderer Vorteil ist die Möglichkeit mehr als ein mit einem Fabstoff verknüpftes Protein gleichzeitig zu messen was wiederum eine genauere Sauerstoffbestimmung ermöglicht. Der oben erläuterte Prozess beschreibt ein auf Fluoreszenz basierendes System zur Sauerstoffdetermination in Lösung.
Kapitel IV ist eine Erweiterung von Kapitel III, da dasselbe Schema (ein Type-3 Kupfer Protein verknüpft mit einem Farbstoff) verwendet wird um Sauerstoff zu detektieren. In den beschriebenen Messungen wird Hemocyanin von Octopus vulgaris mit Cy5 verknüpft, und in zwei verschiedenen, optisch transparenten, Siliconmatrizen immobilisiert, was wiederum eine 'Festkörper'- Einheit zur Messung von Sauerstoff in Gas- und Flüssigphase bildet. Diese polymeren Materialen zur Immobilisierung von Proteinen (Tetramethoxysilikat und sogenanntes Wasserglass) waren in unserem Fall von gleicher Brauchbarkeit. Die vorgestellte Implementierung von fluoreszierendem
Hemocyanin als Sauerstoffsensor bietet eine schnelle Reaktion, Biokompatibilität, Wiederverwertbarkeit und enorme Stabilität.
Eine andere Applikation basierend auf dem FRET Prinzip ist in Kapitel V beschrieben. Hier werden Proteine der P450 Enzymfamilie verwendet, welche aufgrund ihrer enormen katalytischen Fähigkeiten unter Wissenschaftlern von großem Interesse sind. Wir haben P450cam von Pseudomonas putida mit einem Farbstoff verknüpft um der Substratbindung zur prostethischen Gruppe dieses Enzyms zu folgen. Zwei verschieden Substrate wurden ausgewählt um ihre Affinität zum Cofaktor des Enzyms durch die Fluoreszenz des verknüpften Farbstoffes zu bestimmen. Die Dissoziationskonstanten wurden für beide Substrate akkurat bestimmt, da die erhaltenen Werte mit den Absorptionsdaten übereinstimmen. Diese Methode erlaubt Fluoreszenztitrationen mit submikromolaren Konzentrationen von P450 durchzuführen, was im Prinzip für alle P450 Enzyme anwendbar sein sollte.
Alle bis jetzt beschrieben Messungen wurden im Ensemble gemessen. Es gibt jedoch auch spezielle Instrumente zur Detektion von Einzelmolekülen. Die Herausforderung in diesem Feld war es zu demonstrieren, daß unsere Methode auch auf Einzelmolekülbasis angewandt werden kann, was hauptsächlich von der photophysikalischen Stabilität des, mit dem Protein/Enzym geknüpften, Farbstoffes abhängt. Der andere wichtige Faktor ist es ein Immobilisationsschema für das fluoreszierende Enzyme zu finden, welches seine Aktivität nicht beeinflußt. Im Kapitel VI stellen wir den ersten Einzelmolekülansatz basierend auf unserer FRET Methode vor. Das untersuchte Enzym in dieser Studie ist Nitritreduktase von Alcaligenes faecalis S- 6 immobilisiert auf einer Glasoberfläche. Von den Fluoreszenzdaten, gemessen
während das Enzym das Substrat umwandelt, können die kinetischen Parameter extrahiert und mit den makroskopischen Ensembledaten in Verbindung gestellt werden. Die beschriebene Methode ermöglicht uns neue Einblicke im Feld von Einzelmolekül- Enzymstudien und die präzise Untersuchung der zugrundeliegenden Kinetik.
Schlußendlich werden in Kapitel VII die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit beschrieben. Die wichtigsten Resultate jedes Kapitels werden hervorgehoben und die überragenden Vorteile unserer auf FRET basierenden Methode aufgelistet. Eine kurze Vorschau auf zukünftige Entwicklungen wird in Betracht gezogen. Experimente, die in dieser Dissertation vorgeschlagen werden, sind laufende Projekte in unserem Labor.
