Correlative light and electron microscopy : strategies and applications
Driel, L.F. van
Citation
Driel, L. F. van. (2011, October 11). Correlative light and electron microscopy : strategies and applications. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/17922
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Downloaded from: https://hdl.handle.net/1887/17922
Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).
_____________________________________________________________ Nederlandse Samenvatting
183
Nederlandse Samenvatting
Elektronenmicroscopie (EM) is een techniek waarmee biologische (en andersoortige materialen) met hoge resolutie kunnen worden bekeken. Dankzij de hoge resolutie kunnen cellen en subonderdelen van cellen tot aan moleculen toe worden afgebeeld. Biologisch materiaal moet meestal wel een uitgebreide voorbehandeling ondergaan voordat het onderzocht kan worden met EM. Traditioneel wordt het materiaal chemisch gefixeerd, gedehydreerd, behandeld met zware metalen, ingebed in plastic, en gesneden in coupes van 100 nm dun. De hele procedure voorziet de ultrastructuren in het materiaal van contrast, en zorgt ervoor dat het het hoge vacuüm in de microscoop kan weerstaan. Een grote beperking van EM is dat het contrast alleen goed te zien is op hele hoge vergrotingen, vanaf zo’n 3000 x. Aangezien veel biologische structuren schaars zijn, heeft dit tot gevolg dat het zoeken naar een structuur van interesse – bijvoorbeeld een infecterend virus of een cel die in een bepaalde fase van de celdeling is – een zeer tijdrovende zaak is. Een bijkomende complexiteit is dat niet alle structuren visueel te herkennen zijn. Voornamelijk de kleinere moleculen zien er in een zwart-wit EM beeld veelal hetzelfde uit.
Tegenover EM staat een andere tak van microscopie: de lichtmicroscopie (LM). Deze techniek wordt in de laatste jaren voornamelijk gebruikt in combinatie met gekleurd licht, en wordt dan fluorescentie microscopie (FM) genoemd. Bij FM wordt er aan specifieke moleculen in een biologisch preparaat een fluorescent signaal gehangen, dat met behulp van het gekleurde licht kan worden gevisualiseerd. Cellen kunnen met zo’n fluorescent signaal-molecuul gewoon in leven blijven, en het molecuul van interesse kan zo in de tijd gevolgd worden. Het is ook mogelijk om verschillende moleculen te labelen met een ander gekleurd signaal, zodat de bewegingen van de moleculen ten opzichte van elkaar kunnen worden bestudeerd. FM is daarmee een van de belangrijkste technieken in de (medische) biologie geworden in de laatste decennia. Een keerzijde van FM is echter dat de resolutie veelal beperkt is, en dat moleculen alleen indirect kunnen worden gevisualiseerd, namelijk via het label. De morfologie van de gelabelde structuur, noch de morfologie van de contextuele structuren, zijn daarom zichtbaar.
CLEM
Uit de voorgaande twee alinea’s valt te concluderen dat EM en LM technieken zijn, die elkaars zwakheden kunnen opheffen. De ene geeft morfologische informatie met hoge resolutie, de ander geeft meer een overzichtsbeeld waarin het schaars aanwezige structuren gemakkelijk kan detecteren. Deze complementariteit heeft geleid tot de opmars van een nieuwe familie van technieken die de sterke punten van beide soorten microscopie wil benutten: correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM). Hoewel de combinatie van de technieken triviaal lijkt – immers, het gaat om de combinatie van twee bestaande en wijdverspreide technieken – blijkt het in de
Nederlandse Samenvatting _____________________________________________________________
184
praktijk lastig om biologisch materiaal zo te behandelen, dat het zowel het fluorescente signaal behoudt, als contrast biedt voor EM.
Dit proefschrift beschrijft verschillende technieken om LM en EM toch te kunnen combineren. De CLEM technieken zijn vrij verschillend, en kunnen geprefereerd worden afhankelijk van de biologische vraagstelling die bestudeerd wordt. In hoofdstuk 2 staan technieken beschreven die fluorescente signalen toch kunnen behouden in dunne coupes van in plastic ingebed materiaal.
Het behoud van fluorescentie was mogelijk door, onder andere, een aanpassing in de formule van contrastvorming voor EM. De CLEM techniek is vooral bruikbaar voor complexe weefsels, zoals weefselmonsters en -biopten. De complexiteit van deze materialen maakt het vaak moeilijk voor een onderzoeker om zich te kunnen oriënteren bij de hoge EM vergrotingen. De fluorescentie kan in dit geval dus de oriëntatie aanzienlijk vergemakkelijken.
In hoofdstuk 3 worden CLEM technieken toegepast waarin FM wordt uitgevoerd alvorens de preparatie van het weefsel voor EM. De technieken zijn vaker toegepast, en het doel van dit specifieke hoofdstuk is dan ook meer om de toepasbaarheid ervan te laten zien aan de hand van een actueel biologisch vraagstuk. In het hoofdstuk bestuderen we de uitscheiding van een stollingsfactor uit endotheelcellen, de cellen die bloedvaten bekleden. Hoewel al lange tijd wordt aangenomen dat deze uitscheiding plaats vindt door de secretie van kleine hoeveelheden stollingsfactor vlak na elkaar, laten we zien dat dit ook regelmatig geschiedt door binnenin de cel eerst een hoge concentratie van de opgeslagen factoren te verzamelen, en die vervolgens als een grote hoeveelheid van moleculen uit te scheiden. Waarschijnlijk is dit een manier van de cellen om bloedstolling zo efficiënt mogelijk te doen plaatsvinden.
Hoofdstuk 4 behandelt een alternatieve techniek voor CLEM. Het betreft een geavanceerde methode voor weefselpreparatie, namelijk preparatie door middel van vitrificatie. Vitrificatie is het invriezen van weefsel met een snelheid die zo snel is, dat ijskristallen niet kunnen ontstaan. Het is dus een niet-invasieve methode van invriezen. Het gevitrificeerde materiaal kan het vacuüm in de EM weerstaan, zolang het koud genoeg gehouden wordt; onder de -150°C. EM van gevitrificeerd materiaal wordt al langer toegepast, en wordt cryo-EM genoemd. Het voordeel van deze methode is dat het structuren uiterst goed preserveert, in tegenstelling tot de traditionele, meer chemische preparatiemethoden waarvan bekend is dat ze allerlei ongewenste effecten hebben op de morfologie van weefsels. De gedachte in hoofdstuk 4 was dat vitrificatie niet alleen de morfologie van materiaal intact laat, maar ook de fluorescentie die in een preparaat is aangebracht. We ontwikkelden daarom een opzetstuk voor fluorescentie microscopen dat een gevitrificeerd preparaat bevroren kan houden terwijl het met FM wordt bekeken. Hetzelfde preparaat kan vervolgens direct gebruikt worden voor cryo-EM. De hele CLEM procedure wordt hiermee bij cryogene temperaturen uitgevoerd, en wordt daarom cryo-CLEM genoemd.
Hoofdstuk 5 en 6 beschrijven cryo-CLEM resultaten die met de methode uit hoofdstuk 4 verkregen zijn. In hoofdstuk 5 kijken we naar het proces van secretie van verteringsenzymen uit
_____________________________________________________________ Nederlandse Samenvatting
185 de cellen van de alvleesklier. Dit proces is opmerkelijk in dat tijdens de secretie een onderdeel van het cytoskelet, actine, netwerken maakt rondom de uit te scheiden blaasjes. Door het actine fluorescent te maken, zien we in cryo-FM oplichtende kleine ringetjes in het preparaat. In cryo-EM konden we vervolgens de morfologie van deze ringetjes bestuderen, om een idee te krijgen van hun functie.
Hoofdstuk 6 beschrijft een verbeterde versie van de cryo-FM opstelling, die we verder uitontwikkelden in samenwerking met een bedrijf. We laten zien wat in het huidige ontwerp de grenzen zijn van wat de opstelling kan visualiseren. Uiteraard zijn er beperkingen aan de kwaliteit van de FM beelden, aangezien bij zulke lage temperaturen moet worden gewerkt. Omdat de cryo- FM resultaten, van ons en van andere onderzoeksgroepen die aan vergelijkbare ontwikkelingen werken, veelbelovend waren, beschrijven we in hetzelfde hoofdstuk ook een alternatieve methode voor cryo-CLEM. Het betreft hier een fluorescentiemicroscoop die ingebouwd is in een elektronenmicroscoop. Het apparaat is een recente ontwikkeling dat in samenwerking met de universiteit Utrecht is gerealiseerd. We laten zien dat ook deze geïntegreerde microscoop in staat is om cryo-FM en cryo-EM beelden van hetzelfde preparaat vast te leggen.
Hoewel al veel onderzoeken kunnen profiteren van de huidige CLEM ontwikkelingen, hebben zij ook nog hun beperkingen. In dit proefschrift, en voornamelijk in het laatste hoofdstuk, is daarom ook geprobeerd om te concretiseren op welke aspecten er nog winst te behalen valt, en worden er voorstellen gedaan voor verbetering. Op deze manier is getracht in dit proefschrift een bijdrage te leveren aan zowel de huidige als de toekomstige CLEM ontwikkelingen.
