University of Groningen
MicroRNA expression and functional analysis in Hodgkin lymphoma
Yuan, Ye
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2019
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Yuan, Y. (2019). MicroRNA expression and functional analysis in Hodgkin lymphoma. University of Groningen.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
APPENDICES
Nederlandse samenvatting
Publications
Acknowledgements
Biography
173
NEDERLANDSE SAMENVATTING
Het Hodgkin lymfoom (HL) is een vorm van lymfeklierkanker die kan worden onderverdeeld in klassiek (cHL) en nodulair lymfocytenrijk (NLPHL). Minder dan 1 procent van de cellen in het aangedane weefsel zijn tumorcellen. De voorloper cellen van deze tumorcellen zijn kiemcentrum B cellen (GC-B cellen). MicroRNAs (miRNAs) zijn korte niet-eiwit coderende RNA moleculen die eiwit expressie kunnen remmen door te binden aan RNA transcripten van eiwit coderende genen. Het miRNA expressie patroon in B-cel lymfomen is significant veranderd ten opzichte van normale GC-B cellen. Voor een deel van deze miRNAs is aangetoond dat ze een belangrijke rol spelen in de pathogenese van B-cel lymfomen. De specifieke kennis over de rol van miRNAs in cHL is echter nog vrij beperkt. In dit proefschrift hebben we onderzocht (1) welke miRNAs een veranderde expressie hebben in cHL cellijnen ten opzichte van GC-B cellen, (2) welke miRNAs de groei van cHL cellen beïnvloedden en (3) welke genen worden gereguleerd door miRNAs in cHL. Hiervoor hebben we gebruik gemaakt van verschillende “high-throughput” screenings technieken.
1. Het miRNA expressie profiel van cHL cellen
In hoofdstuk 2 hebben we miRNA expressie profielen gemaakt om miRNAs te
identificeren die een verlaagde of verhoogde expressie hebben in cHL cellijnen t.o.v. GC-B cellen. Analyse van de hoogst tot expressie komende miRNAs liet zien dat meer dan 60% van alle miRNA moleculen in cHL en GC-B cellen toebehoren aan de top-10 miRNAs met de hoogste expressie. Zes van de top-10 miRNAs in cHL behoren ook tot de top-10 miRNAs in GC-B cellen. Verder vergelijk liet zien dat er in totaal 84 miRNAs significant verschillend tot expressie komen. Validatie van miRNA expressie met behulp van RT-qPCR was succesvol voor 11 van de 15 miRNAs met verhoogde expressie en voor 4 van de 7 miRNAs met verlaagde expressie. MiR-23a-3p, miR-24-3p en miR-27a-miR-24-3p, alle drie afkomstig van hetzelfde primaire RNA transcript, lieten een verhoogde expressie zien in cHL t.o.v. GC-B cellen.
2. Identificatie van miRNAs die de groei van cHL cellen beïnvloeden.
In hoofdstukken 3, 4 en 5 hebben we een screening gedaan om het effect van miRNA
inhibitie en overexpressie op de groei van cHL cellijnen te bestuderen. Dit soort screeningen zijn nog niet eerder gedaan voor cHL. Aangezien eerdere studies hebben aangetoond dat cHL cellijnen een kleine subpopulatie van kanker stamcellen (CSCs) kunnen bevatten hebben we eerst getest of de mogelijke aanwezigheid van deze
A
NEDERLANDSE SAMENVATTING
Het Hodgkin lymfoom (HL) is een vorm van lymfeklierkanker die kan worden onderverdeeld in klassiek (cHL) en nodulair lymfocytenrijk (NLPHL). Minder dan 1 procent van de cellen in het aangedane weefsel zijn tumorcellen. De voorloper cellen van deze tumorcellen zijn kiemcentrum B cellen (GC-B cellen). MicroRNAs (miRNAs) zijn korte niet-eiwit coderende RNA moleculen die eiwit expressie kunnen remmen door te binden aan RNA transcripten van eiwit coderende genen. Het miRNA expressie patroon in B-cel lymfomen is significant veranderd ten opzichte van normale GC-B cellen. Voor een deel van deze miRNAs is aangetoond dat ze een belangrijke rol spelen in de pathogenese van B-cel lymfomen. De specifieke kennis over de rol van miRNAs in cHL is echter nog vrij beperkt. In dit proefschrift hebben we onderzocht (1) welke miRNAs een veranderde expressie hebben in cHL cellijnen ten opzichte van GC-B cellen, (2) welke miRNAs de groei van cHL cellen beïnvloedden en (3) welke genen worden gereguleerd door miRNAs in cHL. Hiervoor hebben we gebruik gemaakt van verschillende “high-throughput” screenings technieken.
1. Het miRNA expressie profiel van cHL cellen
In hoofdstuk 2 hebben we miRNA expressie profielen gemaakt om miRNAs te
identificeren die een verlaagde of verhoogde expressie hebben in cHL cellijnen t.o.v. GC-B cellen. Analyse van de hoogst tot expressie komende miRNAs liet zien dat meer dan 60% van alle miRNA moleculen in cHL en GC-B cellen toebehoren aan de top-10 miRNAs met de hoogste expressie. Zes van de top-10 miRNAs in cHL behoren ook tot de top-10 miRNAs in GC-B cellen. Verder vergelijk liet zien dat er in totaal 84 miRNAs significant verschillend tot expressie komen. Validatie van miRNA expressie met behulp van RT-qPCR was succesvol voor 11 van de 15 miRNAs met verhoogde expressie en voor 4 van de 7 miRNAs met verlaagde expressie. MiR-23a-3p, miR-24-3p en miR-27a-miR-24-3p, alle drie afkomstig van hetzelfde primaire RNA transcript, lieten een verhoogde expressie zien in cHL t.o.v. GC-B cellen.
2. Identificatie van miRNAs die de groei van cHL cellen beïnvloeden.
In hoofdstukken 3, 4 en 5 hebben we een screening gedaan om het effect van miRNA
inhibitie en overexpressie op de groei van cHL cellijnen te bestuderen. Dit soort screeningen zijn nog niet eerder gedaan voor cHL. Aangezien eerdere studies hebben aangetoond dat cHL cellijnen een kleine subpopulatie van kanker stamcellen (CSCs) kunnen bevatten hebben we eerst getest of de mogelijke aanwezigheid van deze
174
Appendix
CSCs een verstorende werking hebben op de uitkomsten van zo’n screenings benadering. Voor deze experimenten hebben we gebruik gemaakt van lentivirale constructen met elk een unieke DNA barcode. Deze constructen bevatten het GFP gen, die we gebruiken om geïnfecteerde cellen van niet-geïnfecteerde cellen te
onderscheiden (EV-BC set). In hoofdstuk 3 hebben we 2 cHL cellijnen geïnfecteerd
met een ppol van meer dan 200 EV-BC constructen om de techniek op te zetten en te kijken of eventuele CSCs de analyse verstoren. Daarnaast hebben we de data analyse aanpak opgezet en bepaald hoeveel vals positieve hits we krijgen met deze screenings aanpak. Het eerste experiment liet een grote variatie in het relatieve aantal cellen met een specifieke EV-BC zien per tijdspunt. Dit komt waarschijnlijk door de aanwezigheid van incorrecte DNA barcodes, verschillen in de sequenties van de gebruikte primers per tijdspunt per cellijn, en het gebruik van onafhankelijk gemaakte virus pools. In het
2e experiment hebben we elk van deze condities geoptimaliseerd wat resulteerde in
veel consistentere data. We hebben geen onverwachte veranderingen gezien in het aantal reads per EV-BC construct die zouden kunnen wijzen op een effect van CSCs.
De resultaten van dit 2e experiment hebben we gebruikt om de cutoff te bepalen voor
de miRNA overexpressie en inhibitie screeningen in de pilot studie in hoofdstuk 3B.
In hoofdstuk 3B hebben we een pilot screen gedaan met miRNA inhibitie en
overexpressie constructen in een cHL cellijn. Het doel was om de experimentele condities te optimaliseren en de data-analyse te ontwikkelen voor vervolg studies met grotere sets van constructen. De miRNA overexpressie constructen hebben we eerst gevalideerd door een miRNA microarray analyse te doen op RNA geïsoleerd van HEK293T controle cellen die geïnfecteerd waren met een virus pool bestaande uit 22 miRNA overexpressie constructen. Voor 16 van de constructen zagen we een 2-voudige toename in expressie voor tenminste 1 van de 2 armen van de miRNA (de 5p of 3p arm). Dit toont aan dat zelfs in deze polyklonaal geïnfecteerde cellen de meeste overexpressie constructen effectief zijn.
In de pilot screen met 30 miRNA overexpressie constructen zagen we veel variatie in het aantal reads per construct. Deze variatie bleek gecorreleerd te zijn met de insert grootte. We zagen een afname in het aantal reads op dag 27 t.o.v. dag 5 voor pCDH-miR-222, pCDH-miR-142 en pCDH-miR-141. De inhibitie pool bevatte 34 miRNA inhibitie en 4 short hairpin (shRNA) constructen. De shRNA constructen waren gericht tegen DICER en DROSHA. De miRNA inhibitie constructen lieten een gelijkmatige verdeling zien qua read aantallen wat goed past bij de veel beperktere variatie in insert grootte van deze constructen t.o.v. de overexpressie constructen. Het aantal reads voor de shRNA constructen was veel lager terwijl die inserts een vergelijkbare grootte
175
hebben met de miRNA inhibitie constructen. Zeer waarschijnlijk komt dit doordat de nucleotiden in de zogenaamde stem regio van de shRNAs perfect complementair zijn aan elkaar. Het is bekend dat het moeilijk is om zulke structuren efficiënt te sequencen. De nucleotiden in de miRNA inhibitie constructen zijn standaard niet perfect complementair in de stem regio en zijn daarom veel beter te sequencen. In totaal zagen we voor 9 miRNA inhibitie constructen een afname in het aantal reads op dag 27 t.o.v. dag 5 en voor 9 constructen een toename. Voor 3 van de 4 shRNA constructen werd een toename in het aantal reads waargenomen.
Op basis van deze pilot screens hebben we het plan van aanpak op verschillende punten verbeterd. We hebben de insert grootte van de miRNA overexpressie constructen aangepast naar rond de 500bp. Om de shRNA constructen efficiënter te sequencen hebben we de procedure voor het voorbereiden van de monsters voor het next generation sequencen aangepast. Met behulp van het restrictie enzym AgsI worden alle PCR producten in het midden van de haarspeld structuur geknipt zodat er geen secundaire structuren gevormd kunnen worden tijdens de sequence reactie. In hoofdstuk 4 hebben we met behulp van de geoptimaliseerde condities een screen
uitgevoerd met 40 miRNA overexpressie constructen en een controle construct in 2 cHL cellijnen. De cHL cellijnen werden in duplo geïnfecteerd met de virus pool en GFP positieve cellen werden gesorteerd op dag 5, 13 en 21 na infectie. In vergelijking met de pilot screen was de variatie in het aantal reads per construct duidelijk verlaagd alhoewel we nog steeds relatief veel reads zagen voor pCDH-miR-19b-1. Op basis
van de cutoff ratio’s zoals bepaald in hoofdstuk 3 werd een verlaging in het aantal
reads voor miR-141 gevonden op dag 21 t.o.v. dag 5 in 3 van de 4 infecties. Omdat er tussen de cellijnen en experimenten een verschil lijkt te zijn in de mate van achtergrond hebben we ook een alternatieve methode gebruikt waarmee afwijkende constructen kunnen worden geïdentificeerd op basis van het experiment zelf. Met deze zogenaamde Tukey IQR test, die werd toegepast op de berekende hellingen van de ratio’s van de reads, werd miR-19b-1 geïdentificeerd als een miRNA construct waarvan het aantal reads toenam in 3 van de 4 infecties.
In hoofdstuk 5 is een screen gedaan met 58 miRNA inhibitie constructen in 3 cHL
cellijnen. Het gemiddelde aantal reads varieerde tussen de 94 en 963. Op basis van de Tukey IQR test werden 4 miRNA inhibitie constructen (miR-449a-5p, miR-625-5p, let-7f-2-3p en miR-21-5p) geïdentificeerd met een significante afname in ten minste 4 van 6 infecties.
A
CSCs een verstorende werking hebben op de uitkomsten van zo’n screenings benadering. Voor deze experimenten hebben we gebruik gemaakt van lentivirale constructen met elk een unieke DNA barcode. Deze constructen bevatten het GFP gen, die we gebruiken om geïnfecteerde cellen van niet-geïnfecteerde cellen te onderscheiden (EV-BC set). In hoofdstuk 3 hebben we 2 cHL cellijnen geïnfecteerd
met een ppol van meer dan 200 EV-BC constructen om de techniek op te zetten en te kijken of eventuele CSCs de analyse verstoren. Daarnaast hebben we de data analyse aanpak opgezet en bepaald hoeveel vals positieve hits we krijgen met deze screenings aanpak. Het eerste experiment liet een grote variatie in het relatieve aantal cellen met een specifieke EV-BC zien per tijdspunt. Dit komt waarschijnlijk door de aanwezigheid van incorrecte DNA barcodes, verschillen in de sequenties van de gebruikte primers per tijdspunt per cellijn, en het gebruik van onafhankelijk gemaakte virus pools. In het 2e experiment hebben we elk van deze condities geoptimaliseerd wat resulteerde in
veel consistentere data. We hebben geen onverwachte veranderingen gezien in het aantal reads per EV-BC construct die zouden kunnen wijzen op een effect van CSCs. De resultaten van dit 2e experiment hebben we gebruikt om de cutoff te bepalen voor
de miRNA overexpressie en inhibitie screeningen in de pilot studie in hoofdstuk 3B.
In hoofdstuk 3B hebben we een pilot screen gedaan met miRNA inhibitie en
overexpressie constructen in een cHL cellijn. Het doel was om de experimentele condities te optimaliseren en de data-analyse te ontwikkelen voor vervolg studies met grotere sets van constructen. De miRNA overexpressie constructen hebben we eerst gevalideerd door een miRNA microarray analyse te doen op RNA geïsoleerd van HEK293T controle cellen die geïnfecteerd waren met een virus pool bestaande uit 22 miRNA overexpressie constructen. Voor 16 van de constructen zagen we een 2-voudige toename in expressie voor tenminste 1 van de 2 armen van de miRNA (de 5p of 3p arm). Dit toont aan dat zelfs in deze polyklonaal geïnfecteerde cellen de meeste overexpressie constructen effectief zijn.
In de pilot screen met 30 miRNA overexpressie constructen zagen we veel variatie in het aantal reads per construct. Deze variatie bleek gecorreleerd te zijn met de insert grootte. We zagen een afname in het aantal reads op dag 27 t.o.v. dag 5 voor pCDH-miR-222, pCDH-miR-142 en pCDH-miR-141. De inhibitie pool bevatte 34 miRNA inhibitie en 4 short hairpin (shRNA) constructen. De shRNA constructen waren gericht tegen DICER en DROSHA. De miRNA inhibitie constructen lieten een gelijkmatige verdeling zien qua read aantallen wat goed past bij de veel beperktere variatie in insert grootte van deze constructen t.o.v. de overexpressie constructen. Het aantal reads voor de shRNA constructen was veel lager terwijl die inserts een vergelijkbare grootte
hebben met de miRNA inhibitie constructen. Zeer waarschijnlijk komt dit doordat de nucleotiden in de zogenaamde stem regio van de shRNAs perfect complementair zijn aan elkaar. Het is bekend dat het moeilijk is om zulke structuren efficiënt te sequencen. De nucleotiden in de miRNA inhibitie constructen zijn standaard niet perfect complementair in de stem regio en zijn daarom veel beter te sequencen. In totaal zagen we voor 9 miRNA inhibitie constructen een afname in het aantal reads op dag 27 t.o.v. dag 5 en voor 9 constructen een toename. Voor 3 van de 4 shRNA constructen werd een toename in het aantal reads waargenomen.
Op basis van deze pilot screens hebben we het plan van aanpak op verschillende punten verbeterd. We hebben de insert grootte van de miRNA overexpressie constructen aangepast naar rond de 500bp. Om de shRNA constructen efficiënter te sequencen hebben we de procedure voor het voorbereiden van de monsters voor het next generation sequencen aangepast. Met behulp van het restrictie enzym AgsI worden alle PCR producten in het midden van de haarspeld structuur geknipt zodat er geen secundaire structuren gevormd kunnen worden tijdens de sequence reactie. In hoofdstuk 4 hebben we met behulp van de geoptimaliseerde condities een screen
uitgevoerd met 40 miRNA overexpressie constructen en een controle construct in 2 cHL cellijnen. De cHL cellijnen werden in duplo geïnfecteerd met de virus pool en GFP positieve cellen werden gesorteerd op dag 5, 13 en 21 na infectie. In vergelijking met de pilot screen was de variatie in het aantal reads per construct duidelijk verlaagd alhoewel we nog steeds relatief veel reads zagen voor pCDH-miR-19b-1. Op basis van de cutoff ratio’s zoals bepaald in hoofdstuk 3 werd een verlaging in het aantal
reads voor miR-141 gevonden op dag 21 t.o.v. dag 5 in 3 van de 4 infecties. Omdat er tussen de cellijnen en experimenten een verschil lijkt te zijn in de mate van achtergrond hebben we ook een alternatieve methode gebruikt waarmee afwijkende constructen kunnen worden geïdentificeerd op basis van het experiment zelf. Met deze zogenaamde Tukey IQR test, die werd toegepast op de berekende hellingen van de ratio’s van de reads, werd miR-19b-1 geïdentificeerd als een miRNA construct waarvan het aantal reads toenam in 3 van de 4 infecties.
In hoofdstuk 5 is een screen gedaan met 58 miRNA inhibitie constructen in 3 cHL
cellijnen. Het gemiddelde aantal reads varieerde tussen de 94 en 963. Op basis van de Tukey IQR test werden 4 miRNA inhibitie constructen (miR-449a-5p, miR-625-5p, let-7f-2-3p en miR-21-5p) geïdentificeerd met een significante afname in ten minste 4 van 6 infecties.
176
Appendix
Op basis van deze experimenten kunnen we concluderen dat het uitvoeren van een screen in cHL mogelijk is, ook al zijn er nog wel wat experimentele factoren die we verder kunnen optimaliseren.
3. MiRNAs die relevant zijn voor de pathogenese van cHL
MiRNAs worden geïncorporeerd in zogenaamde ‘RNA induced silencing complexes’ (RISC) en deze complexen zorgen voor binding aan de target transcripten. Argonaut (Ago) eiwitten zijn een cruciale component van RISC. Bij de mens komen 2 van de 4 familie leden van Ago eiwit familie hoog tot expressie (Ago1 en Ago2). Om miRNA-target genen te identificeren die worden gereguleerd door miRNAs in cHL hebben we een Ago2-RNA immunoprecipitatie uitgevoerd, gevolgd door microarray analyse (Ago2-RIP-Chip) in cHL cellijnen.
In hoofdstuk 2 hebben we laten zien dat inhibitie van miR-24-3p een sterk negatief
effect heeft op de groei van cHL cellen. Dit toont aan dat dit miRNA kenmerken van een oncogen heeft. Om het onderliggende mechanisme van miR-24-3p verder te bestuderen hebben we gekeken of miR-24-3p inhibitie specifiek celdood induceerde en/of celcyclus progressie blokkeerde. Terwijl er geen effect op de celcyclus kon worden gemeten was er wel een duidelijk toename te meten in het aantal cellen dat dood aan het gaan was. Om de meest relevante miR-24-3p target genen te identificeren hebben we Ago2-IP experimenten gedaan en de functie van de 52 voorspelde en Ago2-IP verrijkte miR-24-3p target genen opgezocht. Voor 15 van deze 52 genen was een rol in celgroei en/of celdood beschreven. De vijf meest Ago2-IP verrijkte genen zijn vervolgens geselecteerd voor validatie met behulp van western blot.
Voor 2 van deze 5 genen, CDKN1B/P27kip1 en MYC was een toename in de eiwit
niveaus na miR-24-3p inhibitie waarneembaar. Aankleuring van CDKN1B/P27kip1 en
MYC eiwit met behulp van immunohistochemie in cHL weefsels liet een variabele expressie zien.
In hoofdstuk 5 hebben we met onze screen aangetoond dat de groei van cHL cellijnen
geremd werd door inhibitie van vier miRNAs. Vervolg experimenten bevestigden het negatieve effect van miR-21-5p inhibitie op de groei in alle drie onderzochte cHL cellijnen. Het negatieve effect op de celgroei kon tenminste ten dele worden toegeschreven aan een sterke toename in het aantal dode cellen na miR-21-5p inhibitie. Met behulp van de Ago2-IP data die waren verkregen in hoofdstuk 2 is een lijst samengesteld van 36 Ago2-IP verrijkte genen die of voorspelde of bewezen miR-21-5p targets zijn. Van deze lijst hadden 13 genen een functie gerelateerd aan cel
177
groei of cel dood. Vier van de 13 genen hadden een significant lagere expressie in cHL cellijnen t.o.v. GC-B cellen. Voor BTG2 en PELI1, de twee genen die het hoogst tot expressie komen in cHL, hebben we de binding van miR-21-5p gevalideerd met behulp van luciferase reporter assays en voor PELI1 ook met behulp van western blot.
4. Conclusies
In dit proefschrift hebben we het miRNA expressie profiel bepaald van cHL cellijnen en GC-B cellen. In totaal kwamen 84 miRNAs differentieel tot expressie tussen beide groepen. We hebben miRNA overexpressie en inhibitie screens opgezet om miRNAs te identificeren die van belang zijn voor de groei van cHL cellen. Daarnaast hebben we alle genen die door miRNAs worden gereguleerd bepaald met behulp van AGO2-RIP-Chip. Twee miRNAs zijn in meer detail bestudeerd om hun rol bij de pathogenese van cHL te bepalen. Voor miR-24-3p hebben we aangetoond dat dit miRNA cHL cellen
beschermt tegen celdood door expressie van CDKN1B/P27kip1 en MYC te reguleren.
Voor miR-21-5p hebben we aangetoond dat het remmen van de expressie van BTG2 en PELI1 mogelijk een rol speelt.
A
Op basis van deze experimenten kunnen we concluderen dat het uitvoeren van een screen in cHL mogelijk is, ook al zijn er nog wel wat experimentele factoren die we verder kunnen optimaliseren.
3. MiRNAs die relevant zijn voor de pathogenese van cHL
MiRNAs worden geïncorporeerd in zogenaamde ‘RNA induced silencing complexes’ (RISC) en deze complexen zorgen voor binding aan de target transcripten. Argonaut (Ago) eiwitten zijn een cruciale component van RISC. Bij de mens komen 2 van de 4 familie leden van Ago eiwit familie hoog tot expressie (Ago1 en Ago2). Om miRNA-target genen te identificeren die worden gereguleerd door miRNAs in cHL hebben we een Ago2-RNA immunoprecipitatie uitgevoerd, gevolgd door microarray analyse (Ago2-RIP-Chip) in cHL cellijnen.
In hoofdstuk 2 hebben we laten zien dat inhibitie van miR-24-3p een sterk negatief
effect heeft op de groei van cHL cellen. Dit toont aan dat dit miRNA kenmerken van een oncogen heeft. Om het onderliggende mechanisme van miR-24-3p verder te bestuderen hebben we gekeken of miR-24-3p inhibitie specifiek celdood induceerde en/of celcyclus progressie blokkeerde. Terwijl er geen effect op de celcyclus kon worden gemeten was er wel een duidelijk toename te meten in het aantal cellen dat dood aan het gaan was. Om de meest relevante miR-24-3p target genen te identificeren hebben we Ago2-IP experimenten gedaan en de functie van de 52 voorspelde en Ago2-IP verrijkte miR-24-3p target genen opgezocht. Voor 15 van deze 52 genen was een rol in celgroei en/of celdood beschreven. De vijf meest Ago2-IP verrijkte genen zijn vervolgens geselecteerd voor validatie met behulp van western blot. Voor 2 van deze 5 genen, CDKN1B/P27kip1 en MYC was een toename in de eiwit
niveaus na miR-24-3p inhibitie waarneembaar. Aankleuring van CDKN1B/P27kip1 en
MYC eiwit met behulp van immunohistochemie in cHL weefsels liet een variabele expressie zien.
In hoofdstuk 5 hebben we met onze screen aangetoond dat de groei van cHL cellijnen
geremd werd door inhibitie van vier miRNAs. Vervolg experimenten bevestigden het negatieve effect van miR-21-5p inhibitie op de groei in alle drie onderzochte cHL cellijnen. Het negatieve effect op de celgroei kon tenminste ten dele worden toegeschreven aan een sterke toename in het aantal dode cellen na miR-21-5p inhibitie. Met behulp van de Ago2-IP data die waren verkregen in hoofdstuk 2 is een lijst samengesteld van 36 Ago2-IP verrijkte genen die of voorspelde of bewezen miR-21-5p targets zijn. Van deze lijst hadden 13 genen een functie gerelateerd aan cel
groei of cel dood. Vier van de 13 genen hadden een significant lagere expressie in cHL cellijnen t.o.v. GC-B cellen. Voor BTG2 en PELI1, de twee genen die het hoogst tot expressie komen in cHL, hebben we de binding van miR-21-5p gevalideerd met behulp van luciferase reporter assays en voor PELI1 ook met behulp van western blot.
4. Conclusies
In dit proefschrift hebben we het miRNA expressie profiel bepaald van cHL cellijnen en GC-B cellen. In totaal kwamen 84 miRNAs differentieel tot expressie tussen beide groepen. We hebben miRNA overexpressie en inhibitie screens opgezet om miRNAs te identificeren die van belang zijn voor de groei van cHL cellen. Daarnaast hebben we alle genen die door miRNAs worden gereguleerd bepaald met behulp van AGO2-RIP-Chip. Twee miRNAs zijn in meer detail bestudeerd om hun rol bij de pathogenese van cHL te bepalen. Voor miR-24-3p hebben we aangetoond dat dit miRNA cHL cellen beschermt tegen celdood door expressie van CDKN1B/P27kip1 en MYC te reguleren.
Voor miR-21-5p hebben we aangetoond dat het remmen van de expressie van BTG2 en PELI1 mogelijk een rol speelt.
179
PUBLICATIONS
Yuan Y, Niu F, Nolte IM, Koerts J, de Jong D, Rutgers B, Osinga J, Azkanaz M, Terpstra
M, Bystrykh L, Diepstra A, Visser L, Dzikiewicz-Krawczyk A, Kok K, Kluiver J, van den Berg A. MicroRNA high throughput loss-of-function screening reveals an oncogenic role for miR-21-5p in Hodgkin lymphoma. Cell Physiol Biochem. 2018;49(1):144-159. Epub 2018 Sep 5.
Yuan Y, Kluiver J, Koerts J, de Jong D, Rutgers B, Abdul Razak FR, Terpstra M, Plaat
BE, Nolte IM, Diepstra A, Visser L, Kok K, van den Berg A. miR-24-3p Is Overexpressed in Hodgkin Lymphoma and Protects Hodgkin and Reed-Sternberg Cells from Apoptosis. Am J Pathol. 2017 Jun;187(6):1343-1355.
Teteloshvili N, Smigielska-Czepiel K, Yuan Y, Seitz A, de Jong D, Rutgers B, Jellema
P, van der Lei RJ, Slezak-Prochazka I, Brouwer E, Boots AM, Kroesen BJ, van den
Berg A, Kluiver J.Argonaute 2 immunoprecipitation revealed large tumor suppressor
kinase 1 as a novel proapoptotic target of miR-21 in T cells. FEBS J. 2017 Feb;284(4):555-567.
Yuan Y, Du W, Wang Y, Xu C, Wang J, Zhang Y, Wang H, Ju J, Zhao L, Wang Z, Lu Y,
Cai B, Pan Z. Suppression of AKT expression by miR-153 produced anti-tumor activity in lung cancer. Int J Cancer. 2015 Mar 15;136(6):1333-40.
Wang L*, Yuan Y*, Li J, Ren H, Cai Q, Chen X, Liang H, Shan H, Fu ZD, Gao X, Lv Y,
Yang B, Zhang Y. MicroRNA-1 aggravates cardiac oxidative stress by
post-transcriptional modification of the antioxidant network. Cell Stress Chaperones. 2015
May;20(3):411-20. *contributed equally.
Pan Z, Sun X, Shan H, Wang N, Wang J, Ren J, Feng S, Xie L, Lu C, Yuan Y, Zhang
Y, Wang Y, Lu Y, Yang B. MicroRNA-101 inhibited postinfarct cardiac fibrosis and improved left ventricular compliance via the FBJ osteosarcoma oncogene/transforming growth factor-β1 pathway. Circulation. 2012 Aug 14;126(7):840-50.
A
PUBLICATIONS
Yuan Y, Niu F, Nolte IM, Koerts J, de Jong D, Rutgers B, Osinga J, Azkanaz M, Terpstra
M, Bystrykh L, Diepstra A, Visser L, Dzikiewicz-Krawczyk A, Kok K, Kluiver J, van den Berg A. MicroRNA high throughput loss-of-function screening reveals an oncogenic role for miR-21-5p in Hodgkin lymphoma. Cell Physiol Biochem. 2018;49(1):144-159. Epub 2018 Sep 5.
Yuan Y, Kluiver J, Koerts J, de Jong D, Rutgers B, Abdul Razak FR, Terpstra M, Plaat
BE, Nolte IM, Diepstra A, Visser L, Kok K, van den Berg A. miR-24-3p Is Overexpressed in Hodgkin Lymphoma and Protects Hodgkin and Reed-Sternberg Cells from Apoptosis. Am J Pathol. 2017 Jun;187(6):1343-1355.
Teteloshvili N, Smigielska-Czepiel K, Yuan Y, Seitz A, de Jong D, Rutgers B, Jellema
P, van der Lei RJ, Slezak-Prochazka I, Brouwer E, Boots AM, Kroesen BJ, van den Berg A, Kluiver J.Argonaute 2 immunoprecipitation revealed large tumor suppressor kinase 1 as a novel proapoptotic target of miR-21 in T cells. FEBS J. 2017 Feb;284(4):555-567.
Yuan Y, Du W, Wang Y, Xu C, Wang J, Zhang Y, Wang H, Ju J, Zhao L, Wang Z, Lu Y,
Cai B, Pan Z. Suppression of AKT expression by miR-153 produced anti-tumor activity in lung cancer. Int J Cancer. 2015 Mar 15;136(6):1333-40.
Wang L*, Yuan Y*, Li J, Ren H, Cai Q, Chen X, Liang H, Shan H, Fu ZD, Gao X, Lv Y,
Yang B, Zhang Y. MicroRNA-1 aggravates cardiac oxidative stress by post-transcriptional modification of the antioxidant network. Cell Stress Chaperones. 2015 May;20(3):411-20. *contributed equally.
Pan Z, Sun X, Shan H, Wang N, Wang J, Ren J, Feng S, Xie L, Lu C, Yuan Y, Zhang
Y, Wang Y, Lu Y, Yang B. MicroRNA-101 inhibited postinfarct cardiac fibrosis and improved left ventricular compliance via the FBJ osteosarcoma oncogene/transforming growth factor-β1 pathway. Circulation. 2012 Aug 14;126(7):840-50.
181
ACKNOWLEDGEMENTS
The successful completion of my thesis would not have been made without the support, help and friendship of many people whom I wish to acknowledge below.
My sincere thanks and utmost appreciation go to my promoter, Prof. Anke van den
Berg. Dear Anke, thank you for giving me opportunity to pursue my PhD in the
Netherlands, and for guiding me along the way I have greatly benefited fron your knowledge and experience, and have learned from you. Thank you for always keeping an open door, and helping me to solve seemlingly unsolvable. You have been very kind and supportive, which I am truly grateful. You always encouraged me to be very independent, and from this I learned much. I enjoyed our discussions during the meeting every week. Until now, I still remember the situation that you introduce me an overview of our group in your office when I came to UMCG at the first day.
I also would like to thank my copromotor, Dr. Joost Kluiver, your knowledge was
invaluable to me, and I learned much from your critical and rigorous approach. I enjoyed our discussions, and I appreciate your help, supervision, and overall contribution.
I would express my appreciation to the members of reading committee, Prof. G. de
Haan, Prof. E. Vellenga, and Prof. D. de Jong. Thank you for your positive remarks
and efficient evaluation of my thesis.
I would like to show my gratitude to the co-authors and collaborators. Dr. Leonid
Bystrykh, Dr. Boudewijn E. Plaat, Dr. Ilja M. Nolte, Maria Sarkis Azkanaz and others. Thank you for all your comments on my paper. Ilja, thanks for your help on
data analysis of sequencing and GFP competition assay.
I would like to thank all people for your valuable comments and suggestions, and for facilitating increasing disscussions at the lunch meetings.
A
ACKNOWLEDGEMENTS
The successful completion of my thesis would not have been made without the support, help and friendship of many people whom I wish to acknowledge below.
My sincere thanks and utmost appreciation go to my promoter, Prof. Anke van den Berg. Dear Anke, thank you for giving me opportunity to pursue my PhD in the
Netherlands, and for guiding me along the way I have greatly benefited fron your knowledge and experience, and have learned from you. Thank you for always keeping an open door, and helping me to solve seemlingly unsolvable. You have been very kind and supportive, which I am truly grateful. You always encouraged me to be very independent, and from this I learned much. I enjoyed our discussions during the meeting every week. Until now, I still remember the situation that you introduce me an overview of our group in your office when I came to UMCG at the first day.
I also would like to thank my copromotor, Dr. Joost Kluiver, your knowledge was
invaluable to me, and I learned much from your critical and rigorous approach. I enjoyed our discussions, and I appreciate your help, supervision, and overall contribution.
I would express my appreciation to the members of reading committee, Prof. G. de Haan, Prof. E. Vellenga, and Prof. D. de Jong. Thank you for your positive remarks
and efficient evaluation of my thesis.
I would like to show my gratitude to the co-authors and collaborators. Dr. Leonid Bystrykh, Dr. Boudewijn E. Plaat, Dr. Ilja M. Nolte, Maria Sarkis Azkanaz and others. Thank you for all your comments on my paper. Ilja, thanks for your help on
data analysis of sequencing and GFP competition assay.
I would like to thank all people for your valuable comments and suggestions, and for facilitating increasing disscussions at the lunch meetings.
182
Appendix
I am also grateful for the collaborations of many who have provided help and assistance from other departments throughout the UMCG. Thank you for all your help, and for sharing your knowledge and expertise.
Special thanks go to Dr. Lydia Visser and Dr. Arjan Diepstra who have provided
much support during these years. Dear Lydia, thank you very much for your always smiles and kind words. I cannot forget our conversation in the train, and experiences in Hodgkin lymphoma conference in Cologne. And I will also miss you and your delicious cakes. Dear Arjan, Thanks for helping me check and take pictures for TMA experiment.
I am also thankful to people from Genetics department, Dr. Klaas Kok, Martijn
Terpstra and Jan Osinga. Dear Klaas, thank you for your suggestions for analyzing
sequencing data. Dear Martijn, thank you for your help with data analysis for next generation sequencing. Dear Jan Osinga, thanks for your help in samples preparation for sequencing.
I would like to thank all people and technicians from DNA lab and O&O lab, Debora,
Jasper, Jantine, Bea, Annika, Roland, Hans, Wierd and others. Dear Debora and
Jasper, I would like to thank both of you for your valuable help. You were always kindly to answer my questions when I needed. Dear Bea, I appreciate your help with Western blot, ELISA and other experiments. I enjoyed working together with you. Dear Jantine, I was glad to work together with you at the beginning time when I came to the lab. I
also would like to thank Sem for your help on experiments when I went back to China.
I would also like to thank Geert Mesander and Henk Moes from FACS facility. Dear
Geert and Henk, thank both of you for your help on a lot of sorting experiments. I enjoyed working with you.
I am also thankful to all PhD students from the department of Pathology Jennie, Ali,
Emine, Hatatip, Reeny, Nato, Rianne, Kushi, Wouter, Jan Brouwer, Mathilde, Agnieszka, Melanie, Mina and others. I have enjoyed the time that I spent with all of
183
you. Good luck! Dear Reeny and Rianne, it was unforgettable experience with both of
you in Cologne. Dear Agnieszka, Melanie andMina, thank you for always answering
all my questions. Dear Emine, I enjoyed talking, shopping, having lunch together with you. Good luck! Dear Jennie, you are a warm-hearted girl. I am very glad to be your friend. Thank you for connecting and going to airport to get my lost bag. I wish you, your boyfriend-Qiubin, and your little girl 黄馨颖-Xinying all the best. Hope you will enjoy your new life in Beijing.
I would also like to thank Chinese PhD students Hongjuan Yu, Yuxuan, Rae, Ben
(Benhui), Juan, Jun Li, Peijia, Zhijun, Jiacong, Pei, Wangzhao, Cheng, Chengcheng, Peng Wang, and others in UMCG. Dear Ben, Thank you for your help
especially in the first stage of my PhD. Dear Rae, thank you for your always help. I will never forget your cooking and our conversation. Good luck with your future life! Dear Juan, you are a hardworking girl. Take care! Dear Peijia, thank you for your help on keeping my luggage in your place. Dear Zhijun, Jiacong and Pei, good luck with your projects.
I would also like to thank my neighbours Xiaoming Zhang, your wife and your
children, Martin and your wife and others. Thank you very much for helping me
when we have any questions.
I am grateful to Fubiao and Wangzhao. Thank you for willing to be my paranymphs
Dear Fubiao, thank you for your delicious food. I wish you, your wife Dandan, and your little boy all the best. And good luck with your project. Dear Wangzhao, thank you for always kindness. Take care!
I would also like to acknowledge Xuefei Cao and your family. Dear Xuefei, thank you
very much for giving me the opportunity to study in the UMCG. I enjoyed our conversion. I wish all the best with your family.
I would especially thank Prof. Baofeng Yang, Prof. Zhimin Du, Prof. Yunwei Wei,
A
I am also grateful for the collaborations of many who have provided help and assistance from other departments throughout the UMCG. Thank you for all your help, and for sharing your knowledge and expertise.
Special thanks go to Dr. Lydia Visser and Dr. Arjan Diepstra who have provided
much support during these years. Dear Lydia, thank you very much for your always smiles and kind words. I cannot forget our conversation in the train, and experiences in Hodgkin lymphoma conference in Cologne. And I will also miss you and your delicious cakes. Dear Arjan, Thanks for helping me check and take pictures for TMA experiment.
I am also thankful to people from Genetics department, Dr. Klaas Kok, Martijn Terpstra and Jan Osinga. Dear Klaas, thank you for your suggestions for analyzing
sequencing data. Dear Martijn, thank you for your help with data analysis for next generation sequencing. Dear Jan Osinga, thanks for your help in samples preparation for sequencing.
I would like to thank all people and technicians from DNA lab and O&O lab, Debora, Jasper, Jantine, Bea, Annika, Roland, Hans, Wierd and others. Dear Debora and
Jasper, I would like to thank both of you for your valuable help. You were always kindly to answer my questions when I needed. Dear Bea, I appreciate your help with Western blot, ELISA and other experiments. I enjoyed working together with you. Dear Jantine, I was glad to work together with you at the beginning time when I came to the lab. I also would like to thank Sem for your help on experiments when I went back to China.
I would also like to thank Geert Mesander and Henk Moes from FACS facility. Dear
Geert and Henk, thank both of you for your help on a lot of sorting experiments. I enjoyed working with you.
I am also thankful to all PhD students from the department of Pathology Jennie, Ali, Emine, Hatatip, Reeny, Nato, Rianne, Kushi, Wouter, Jan Brouwer, Mathilde, Agnieszka, Melanie, Mina and others. I have enjoyed the time that I spent with all of
you. Good luck! Dear Reeny and Rianne, it was unforgettable experience with both of you in Cologne. Dear Agnieszka, Melanie andMina, thank you for always answering all my questions. Dear Emine, I enjoyed talking, shopping, having lunch together with you. Good luck! Dear Jennie, you are a warm-hearted girl. I am very glad to be your friend. Thank you for connecting and going to airport to get my lost bag. I wish you, your boyfriend-Qiubin, and your little girl 黄馨颖-Xinying all the best. Hope you will enjoy your new life in Beijing.
I would also like to thank Chinese PhD students Hongjuan Yu, Yuxuan, Rae, Ben (Benhui), Juan, Jun Li, Peijia, Zhijun, Jiacong, Pei, Wangzhao, Cheng, Chengcheng, Peng Wang, and others in UMCG. Dear Ben, Thank you for your help
especially in the first stage of my PhD. Dear Rae, thank you for your always help. I will never forget your cooking and our conversation. Good luck with your future life! Dear Juan, you are a hardworking girl. Take care! Dear Peijia, thank you for your help on keeping my luggage in your place. Dear Zhijun, Jiacong and Pei, good luck with your projects.
I would also like to thank my neighbours Xiaoming Zhang, your wife and your children, Martin and your wife and others. Thank you very much for helping me
when we have any questions.
I am grateful to Fubiao and Wangzhao. Thank you for willing to be my paranymphs
Dear Fubiao, thank you for your delicious food. I wish you, your wife Dandan, and your little boy all the best. And good luck with your project. Dear Wangzhao, thank you for always kindness. Take care!
I would also like to acknowledge Xuefei Cao and your family. Dear Xuefei, thank you
very much for giving me the opportunity to study in the UMCG. I enjoyed our conversion. I wish all the best with your family.
I would especially thank Prof. Baofeng Yang, Prof. Zhimin Du, Prof. Yunwei Wei, Prof. yanjie Lv, Prof. Zhenwei Pan, Prof. Benzhi Cai, Prof. Yong Zhang and others
184
Appendix
in Harbin medical university. Thank you for giving me the opportunity and all your support.
In particular, I would like to thank my parents, my husband Weijie Du and all my family
for their continued support and encouragement. I would also like to thank all my colleagues and friends in China who have supported me along the way.
Finally, I wish to thank many other people whose names are not mentioned here but this does not mean that I have forgotten their help. Thank you all!
185
BIOGRAPHY
Ye Yuan was born in Heilongjiang province, China. After graduating from high school in 2006, she entered the University via the University Entrance Examination. She moved to Harbin and studied pharmacy in Harbin Medical University, and got a Bachelor of Science degree in 2010. In the same year she entered the graduate school at the Harbin Medical University. In the Department of Pharmacology at the Harbin Medical University, she investigated the role of miRNAs in lung cancer and the underlying mechanisms for her Master of Science degree under supervision by Prof. Baofeng Yang and Prof. Zhiguo Wang. In 2013 under the corporation between Harbin Medical University in China and Groningen University in the Netherlands she was selected as a sandwich PhD candidate. In October, 2013 she moved to Groningen, The Netherlands, to pursue a doctoral degree at the Department of Pathology, University Medical Center Groningen. The outcome of her research is presented in this thesis.
A
in Harbin medical university. Thank you for giving me the opportunity and all your support.
In particular, I would like to thank my parents, my husband Weijie Du and all my family
for their continued support and encouragement. I would also like to thank all my colleagues and friends in China who have supported me along the way.
Finally, I wish to thank many other people whose names are not mentioned here but this does not mean that I have forgotten their help. Thank you all!
BIOGRAPHY
Ye Yuan was born in Heilongjiang province, China. After graduating from high school in 2006, she entered the University via the University Entrance Examination. She moved to Harbin and studied pharmacy in Harbin Medical University, and got a Bachelor of Science degree in 2010. In the same year she entered the graduate school at the Harbin Medical University. In the Department of Pharmacology at the Harbin Medical University, she investigated the role of miRNAs in lung cancer and the underlying mechanisms for her Master of Science degree under supervision by Prof. Baofeng Yang and Prof. Zhiguo Wang. In 2013 under the corporation between Harbin Medical University in China and Groningen University in the Netherlands she was selected as a sandwich PhD candidate. In October, 2013 she moved to Groningen, The Netherlands, to pursue a doctoral degree at the Department of Pathology, University Medical Center Groningen. The outcome of her research is presented in this thesis.
