University of Groningen RNA regulation in Lactococcus lactis van der Meulen, Sjoerd Bouwe

(1)

University of Groningen

RNA regulation in Lactococcus lactis

van der Meulen, Sjoerd Bouwe

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.

Document Version

Publisher's PDF, also known as Version of record

Publication date: 2018

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):

van der Meulen, S. B. (2018). RNA regulation in Lactococcus lactis. Rijksuniversiteit Groningen.

Copyright

Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

(2)

525070-L-bw-Meulen 525070-L-bw-Meulen 525070-L-bw-Meulen 525070-L-bw-Meulen Processed on: 24-10-2018 Processed on: 24-10-2018 Processed on: 24-10-2018

(3)

Processed on: 24-10-2018 PDF page: 164PDF page: 164PDF page: 164PDF page: 164

164

Wetenschappelijke samenvatting

Het centrale dogma in de biologie beschrijft dat genen, gecodeerd in het DNA, eerst afgeschreven worden naar RNA en vervolgens vertaald in eiwitten. Decennia lang werden RNA moleculen voornamelijk beschouwd als boodschappers (mRNAs). Enkele andere soorten RNAs met functionele eigenschappen, zoals ribosomale RNAs (rRNAs) en transfer RNAs (tRNAs) zijn allen betrokken zijn bij de vertaling van mRNA naar eiwit. Op dit moment is bekend dat op bacteriële genomen vele tientallen tot enkele honderden RNAs met een regulatoire functie te vinden zijn. Het eerste bewijs van een chromosomaal gecodeerde regulatoire RNA is geleverd in 1983, maar de laatste 10 tot 15 jaar zijn de aantallen nieuwe ontdekkingen en functionele karakterisaties ervan in een duikvlucht gekomen dankzij de ontwikkelingen in next generation sequencing. Regulatoire RNAs in bacteriën en Archaea

zijn met 50-350 nucleotiden gemiddeld een stuk kleiner dan mRNAs en worden daarom “small regulatory RNAs” of sRNAs genoemd. sRNAs kunnen één of meerdere mRNAs reguleren door middel van baseparing. Dit kan een positief of een negatief effect op de genexpressie hebben doordat het de translatie en/of stabiliteit van het mRNA beïnvloedt. Naast sRNAs kunnen ook de zogenaamde antisense RNAs (asRNAs) genregulatie uitvoeren. Omdat asRNAs afgeschreven worden van dezelfde locus als het betreffende gen, maar dan van de complementaire DNA streng, hebben ze een (deels) perfecte complementariteit met het mRNA en kunnen ze daarmee een interactie aangaan via baseparing. Dit leidt vervolgens in de meeste gevallen tot het blokkeren van de translatie van het mRNA en/of tevens tot afbraak van het mRNA molecuul. In enkele gevallen wordt het mRNA gestabiliseerd door de plek waarop een RNase knipt op het mRNA te blokkeren. Ook kunnen sRNAs een mRNA structuur ongedaan maken waarbij de ribosomale bindingssite (RBS) wordt geblokkeerd. Dit heeft tot gevolgd dat ribosomen wel kunnen binden aan het mRNA waardoor de vertaling ervan plaats kan vinden.

Het modelorganisme dat gebruikt is voor dit promotieonderzoek is de melkzuurbacterie

Lactococcus lactis. Deze bacterie is van groot belang voor de zuivelindustrie: mengsels

van deze bacteriën (het “zuursel”) worden toegevoegd aan melk voor de productie van onder andere karnemelk, kwark en verschillende soorten (zachte) kazen. Tijdens deze zogenaamde fermentatie van melk wordt het melksuiker lactose door L. lactis omgezet in

melkzuur (lactaat). Hierdoor daalt de zuurgraad en kunnen ongewenste (pathogene) micro-organismen zich niet vestigen en het product bederven. Bijproducten van het metabolisme van L. lactis zorgen voor smaak, textuur en aroma’s. Het fermentatieproces kan gestuurd

worden door de genexpressie van L. lactis zo aan te passen dat bepaalde eigenschappen

van de bacterie optimaal benut worden. Door meer te weten te komen over de mogelijke aanwezigheid in L. Lactis van sRNAs en, vervolgens, over hun rol en werking in dit industrieel

belangrijke micro-organisme, kunnen mogelijk nieuwe strategieën worden ontwikkeld om genexpressie te sturen.

(4)

165 Identificatie van nieuwe RNAs en hun expressie tijdens stress in Lactococcus lactis

Bij aanvang van dit promotieonderzoek waren geen regulatoire RNAs beschreven in L. lactis. Met differentiële RNA-sequencing (dRNA-seq) konden we transcriptiestartplaatsen

(TSSs) opsporen van tot nu toe onbekende RNAs van L. lactis. Dit aldus verkregen

“transcriptoomlandschap” resulteerde in de identificatie van enkele honderden potentiële RNA-regulatoren; het is bovendien gebruikt om de annotatie van bestaande genen te verbeteren. Deze nieuwe RNAs werden geclassificeerd als sRNA (186 in totaal) waarvan de genen gelokaliseerd zijn tussen eiwit-coderende genen, of antisense RNAs (60). Verder werden 129 lange mRNA leaders (5’UTR’s ≥ 100 nt) geïdentificeerd die mogelijk riboswitches herbergen. Riboswitches zijn RNA structuren die een verscheidenheid aan ionen en metabolieten kunnen binden. Die interactie heeft gevolgen voor de expressie van het downstream gelegen gen of operon. Op basis van homologieonderzoek met behulp van

een specifieke database voor bacteriële regulatoire RNAs (BSRD-database) zijn riboswitches voor verschillende tRNAs (T-boxes), flavine-mononucleotide (FMN), fluoride, lysine, purine, thiamine-pyrofosfaat (TPP) en prequeuosine 1 (preQ1) gevonden in de verschillende lange 5’-UTRs.

De aanwezigheid en grootte van 15 van de sRNAs werden gevalideerd door Northern hybridisatie. Ook werd informatie over de expressie van de 15 sRNAs verkregen door RNA te isoleren uit L. lactis cellen op verschillende momenten tijdens de groei of na blootstelling

aan verschillende stress-omstandigheden. Om de primaire reactie op genexpressieniveau in kaart te kunnen brengen, is het RNA na een korte stressperiode van slechts 5 minuten geanalyseerd. De onderzochte stresscondities zijn industrieel relevant en kunnen optreden tijdens het melkfermentatieproces: koude (10°C), hitte (42°C), zuur (pH 4,5), osmotische stress (2,5% NaCl), oxidatiestress (door de culture te schudden) of verhongering (incubatie van de cellen in een buffer (PBS)). Het geïsoleerde RNA werd geanalyseerd door RNA-seq. Een groot aantal (eiwit-coderende) genen waarvan bekend is dat ze reageren op een bepaalde stressconditie werd met deze studie bevestigd. Uit de expressiedata van alle nieuwe sRNAs en asRNAs blijkt dat veel sRNAs sterk reageren op bepaalde stresscondities. De expressie van tRNAs ging overwegend naar beneden na de korte periode van toepassing van verschillende stressoren. De expressie van een van de sRNAs, CisR, bleek duidelijk geïnduceerd te zijn na koude stress, een observatie die ertoe heeft geleid een vervolgstudie aan dit sRNA te wijden.

Functies van sRNAs in L. lactis

Vier sRNAs werden nader onderzocht om hun mogelijk mRNA-doelen (targets) te identificeren. Daartoe werden de sRNA genen gekloneerd in een induceerbaar genexpressieplasmide, gedurende 10 minuten tot overexpressie gebracht in L. lactis,

waarna RNA-seq werd uitgevoerd op geïsoleerd totaal RNA. Overexpressie van het sRNA LLMGnc_147 leidt tot een sterke toename van de expressie van een operon dat volgens de

(5)

166

Wetenschappelijke samenvatting

annotatie betrokken zou zijn bij “koolstofopname en metabolisme”. Hoewel LLMGnc_147 sterk tot expressie komt wanneer de cellen werden gekweekt in aanwezigheid van cellobiose, leidde overexpressie van het sRNA in vergelijking met de controle tot een betere groei van

L. lactis wanneer galactose als enige koolstofbron beschikbaar was. Overexpressie van het

sterk geconserveerde en geëxpresseerde 6S-RNA (LLMGnc_004), een globale regulator die werkt op de σ70_{-holoenzym van het RNA polymerase, bracht geen duidelijke mRNA targets}

aan het licht. De expressie van 6S bleek afhankelijk te zijn van de beschikbare koolstofbron, hetgeen suggereert dat 6S in L. lactis wordt gereguleerd door de transcriptionele repressor

CcpA. Het sRNA LLMGnc_072, dat we de naam ArgX gaven, is gelokaliseerd in de 3’-UTR van argR, een gen dat codeert voor de transcriptionele repressor ArgR van het

arginine-metabolisme in L. lactis. ArgX wordt afgeschreven van zijn eigen promotor maar deelt een

gemeenschappelijke terminator met argR. Door een transcriptionele fusie te maken van

de promoter van ArgX, P_ArgX, met het gen voor groen fluorescerend eiwit, gfp, kon arginine

als een belangrijke inducer en CcpA als een repressor van P_ArgX worden geïdentificeerd. De belangrijkste bevinding is dat ArgX het mRNA reguleert van arc, het operon dat codeert

voor de arginine-deaminase-route. In tegenstelling tot de regulator ArgR, die arc expressie

reguleert op het niveau van transcriptie, werkt ArgX op de stabiliteit van het arc mRNA. ArgX

doet dit naar verwachting door binding aan de ribosoombindingsplaats (RBS) van een van de genen in het arc operon, arcC1. Zodoende zou dit, naast arc mRNA afbraak bovendien

leiden tot remming van de translatie van dat laatste gen. ArcC1 is een carbamate kinase die de laatste stap uitvoert van de afbraak arginine, namelijk de omzetting van carbamoylfosfaat naar ammonia, ATP en CO₂. De translatieregulatie van dit gen leidt tot een ander gebruik van het carbamoylfosfaat, namelijk richting pyrimidine synthese. Het bestaan van het sRNA CisR (LLMGnc_082) werd extra bevestigd door Northern hybridisatie terwijl ook de promoter van het cisR gen nader werd bestudeerd. tRNAs en mRNAs die betrokken zijn bij bepaalde

stresscondities (busR en fruR) werden geïdentificeerd als potentiële doelwitten van CisR

door gebruik te maken van CisR overexpressie gecombineerd met MS2-affiniteitszuivering en RNA-seq (MAPS).

Analyse van grote datasets

Sinds het aanbreken van het ‘omics’ tijdperk genereren moleculaire biologen grote en grote aantallen datasets die afkomstig zijn van onderwerpen als genoom, transcriptoom en metaboloom studies. Deze hebben een enorm inzicht opgeleverd in hoe verschillende processen zoals metabolisme, celdeling en adaptatie van bacteriële cellen functioneren. De belangrijkste uitdaging voor onderzoekers die werken met grote datasets is de correcte omgang met die data en daaruit biologische conclusies te kunnen trekken. In dit proefschrift is bijvoorbeeld RNA-seq gebruikt om inzicht te krijgen in de cellulaire respons na een korte periode van verschillende stress-omstandigheden. Om de analyse van de daaruit voortkomende grote datasets te kunnen uitvoeren hebben we de RNA-seq

(6)

167

data-analyse toolbox uitgebreid. De afzonderlijke analysescripts die zijn ontwikkeld zijn uiteindelijk samengevoegd in een volledig geautomatiseerde pijplijn voor de analyse van transcriptoomdata. Deze Transcriptome analysis webserver for RNA-seq Expression data,

“T-REx”, maakt het biologen mogelijk statistische analyses uit te voeren en de gegevens daarvan te visualiseren, met een keuze aan tabellen, figuren en matrices. De hele analyse duurt enkele minuten en vereist slechts enkele tekstbestanden als invoer in T-REx. Bepaalde output van T-REx kan verder worden geanalyseerd op een interactieve webserver (http:// genome2d.molgenrug.nl). Om de biologische betekenis te ontrafelen in groepen van genen die differentieel tot expressie komen, zoals bijvoorbeeld door T-Rex geïdentificeerd is een

Gene Set Enrichment Analysis-tool ontwikkeld (GSEA-Pro; de Jong et al., in voorbereiding).

GSEA-Pro maakt een snelle scan van welke biologische functies mogelijk overgerepresenteerd zijn in de gegroepeerde genen op basis van verschillende classificaties zoals COG, KEGG, GO, InterPro en PFAM. Zowel de T-REx- als de GSEA-Pro-tool stelt biologen in staat om datasets snel en betrouwbaar te analyseren, terwijl dat ook gemakkelijk gereproduceerd kan worden door andere wetenschappers die dezelfde dataset analyseren.

Tot slot

In dit proefschrift werd het eerste transcriptoomlandschap van het gehele genoom van L. lactis gerapporteerd. Op basis van differentiële RNA-seq werden transcriptiestartplaatsen

gedetecteerd van bekende coderende genen, van lange 5’-UTRs en van nieuwe genen van mogelijke RNA-regulatoren. Uit de honderden geïdentificeerde RNAs is een aantal sRNAs in meer detail bestudeerd. LLMGnc_147 bleek een operon te induceren/stabiliseren dat betrokken is bij koolstofopname en metabolisme, terwijl ArgX het arc operon reguleert

parallel aan de transcriptiefactor ArgR. Voor het door koudestress geïnduceerde sRNA CisR zijn verschillende potentiële RNA doelwitten geïdentificeerd, waaronder tRNA’s, een klasse van RNAs die tot dusverre is ontsnapt aan het repertoire van mogelijke sRNA-doelen. Deze studie biedt een uitstekend startpunt voor verdere karakterisering van verschillende nieuwe RNAs in L. lactis.

(7)