University of Groningen Activation, regulation and physiology of natural competence in Lactococcus lactis Mulder, Joyce

(1)

University of Groningen

Activation, regulation and physiology of natural competence in Lactococcus lactis

Mulder, Joyce

DOI:

10.33612/diss.171825159

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.

Document Version

Publisher's PDF, also known as Version of record

Publication date: 2021

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):

Mulder, J. (2021). Activation, regulation and physiology of natural competence in Lactococcus lactis. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.171825159

Copyright

Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

(2)

560424-L-bw-Mulder 560424-L-bw-Mulder 560424-L-bw-Mulder 560424-L-bw-Mulder Processed on: 19-5-2021 Processed on: 19-5-2021 Processed on: 19-5-2021

Processed on: 19-5-2021 PDF page: 219PDF page: 219PDF page: 219PDF page: 219

SUMMARY

SAMENVATTING

(3)

220

SUMMAR

Y

Summary

One of the most important dairy lactic acid bacteria is Lactococcus lactis which is used for the production of, cheese, butter and butter milk by fermenting carbohy-drates that are present in milk (1, 2). This requires a set of genetically encoded traits in order to be able to grow in milk, e.g. lactose utilization and proteolytic activity (3–5). Lactococcal strains can be screened for genetically encoded traits by using comparative genomics. Typically, such approach can also distinguish regions that have been acquired through horizontal gene transfer. Horizontal gene transfer is an important mechanism in which bacteria acquire exogenous DNA from other genera or species. Phage transduction, nanotubes, conjugation and natural competence are forms of horizontal gene transfer of which the latter does not require a donor cell or virus. Bacteria that enable natural competence harbor early competence genes, involved in competence regulation, and late competence genes, encoding the component for the DNA-uptake machinery (6–8). In addition, cells that develop natural competence for transformation also express the recombination machinery, thereby facilitating integration of large fragments of exogenous DNA harboring homologous regions into the genome (9, 10). Besides, plasmids can be obtained during the natural competence state. L. lactis is considered as a non-competent species despite of the observation of many competence genes within the lacto-coccal genome (11) and the observation of their expression upon carbon starvation conditions (12–14). Establishing natural competence in this species will contribute to enhanced strain performance and might pave the way for natural strain improvement as, currently, genetically modified micro-organisms are not allowed in food (15).

Therefore, in Chapter 2 (16), it was examined whether a set of subsp. cremoris and subsp. lactis strains, originating from different habitats, harbors a complete set of competence genes. Intriguingly, none of the dairy lactococcal strains assessed in Chapter 2 harbor a complete set of competence genes whereas some plant isolates (from both subsp. cremoris and lactis) appear to encode a complete set of competence genes. One of these strains, L. lactis KF147, is known to express the

com genes upon starvation after retentostat culturing (Ercan et al. 2015). Next, we

created a construct harboring the gene encoding the master regulator of compe-tence, comX, under control of the nisin A promotor. This construct was successfully transferred to L. lactis KF147 and induction of this strain with moderate levels of nisin led to transformation that was dependent on the expression of the ComE op-eron. Moreover, also the L. lactis strains IL1403 and KW2, both encode a complete

(4)

221

SUMMAR

Y

set of com genes, were able to be transformed upon moderate comX overexpres-sion. Conclusively, several L. lactis strains with a complete set of competence genes can express a functional DNA-uptake machinery and allow transformation upon moderate levels of ComX.

In Chapter 3, the competence state in L. lactis was further investigated in as it was previously observed that high expression levels of ComX led to growth stag-nation and nontransformability. A micro-array was performed to assess gene ex-pression of lactococcal genes upon no, intermediate and full induction of comX. Primarily genes involved in general stress response, recombination were induced upon comX induction and correlated positively with com gene expression. Inter-estingly, genes involved in translation and amino acid metabolism were downreg-ulated upon comX induction and correlated negatively with com gene expression. Among these positively and negatively correlated genes, many of these harbor the CodY motif in their promotor region suggesting a role for CodY and possibly the stringent response during natural competence in L. lactis. A more pronounced stress response, including induction of a potential ppGpp alarmone synthase YijE, was observed in cells expressing high levels of ComX when compared to cells ex-pressing moderate levels of ComX thereby possibly explaining the growth stagna-tion phenotype.

This phenotype was further examined in Chapter 4. A com reporter was created harboring the PcomGA promotor upstream a superfolder gfp sequence. Intermedi-ate expression of ComX led to heterogeneous activation of the lIntermedi-ate com promotor from comGA in approx. 40-50% of the population whereas high expression levels of ComX led to homogenous activation of the late com promotor from comGA. Furthermore, transformation could not be detected in cells expressing high levels of ComX. Besides, these cells lost the capacity to form a colony on an agar plate, however, remained intact and were able to continue acidification indicating meta-bolic activity.

In Chapter 5, attempts to discover the natural trigger for natural competence in

L. lactis were made by using a High- throughput screening method in which

con-ditions that induce starvation or the stringen response were mimicked. 8 L. lactis strain harboring a complete set of competence genes were used as a test panel in order to detect transformation within several conditions. None of these conditions showed detectable transformation in any of the 8 lactococcal strain despite of a phenotypic response in all strains upon exposure to these conditions that induce starvation and stringent responses. In all tested conditions, a sufficient amount of cells from the lactococcal strain was included which was confirmed by CFU counts

(5)

222

SUMMAR

Y

and considering the transformation rate of L. lactis. Thus far, it appears that the nat-ural trigger to activate natnat-ural competence in L. lactis has not been discovered yet. In the final Chapter, Chapter 6, all findings of Chapter 2 to 5 are subjected to a general discussion but in more detail. These discussions include, for example, a possible explanation on why the competence genes of dairy lactococcal strains de-cay in contrast to lactococcal strains that originate from plants. Besides, dairy strep-tococcal strains do not show a decay of competence genes in contrast to the dairy lactococcal strains. A possible explanation for this is also discussed in Chapter 6. Overall, all findings from Chapters 2 to 5 are discussed for further research regard-ing natural competence in L. lactis and the quest for the natural trigger of natural competence. Finally, a future perspective is outlined to discuss the opportunities of natural methods to improve strains, why further research in this field is important and what information is still needed in order to improve food by enhanced strain performance.

(6)

223

SUMMAR

Y

References

1. Leroy F, De Vuyst L. 2004. Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry. Trends Food Sci Technol 15:67–78.

2. Cavanagh D, Fitzgerald GF, McAuliffe O. 2015. From field to fermentation: The origins of Lactococcus lactis and its domestication to the dairy environ-ment. Food Microbiol 47:45–61.

3. Kelleher P, Bottacini F, Mahony J, Kilcawley KN, van Sinderen D. 2017. Com-parative and functional genomics of the Lactococcus lactis taxon; insights into evolution and niche adaptation. BMC Genomics 18:1–20.

4. Kelleher P, Mahony J, Bottacini F, Lugli GA, Ventura M, Van Sinderen D. 2019. The lactococcus lactis pan-Plasmidome. Front Microbiol 10:1–20.

5. Wels M, Siezen R, van Hijum S, Kelly WJ, Bachmann H. 2019. Comparative Genome Analysis of Lactococcus lactis Indicates Niche Adaptation and Re-solves Genotype/Phenotype Disparity. Front Microbiol 10:4.

6. Mell JC, Redfield RJ. 2014. Natural Competence and the Evolution of DNA Uptake Specificity. J bac 196:1471–1483.

7. Muschiol S, Balaban M, Normark S, Henriques-Normark B. 2015. Uptake of extracellular DNA: Competence induced pili in natural transformation of

Streptococcus pneumoniae. BioEssays 37:426–435.

8. Johnston C, Martin B, Fichant G, Polard P, Claverys JP. 2014. Bacterial trans-formation: Distribution, shared mechanisms and divergent control. Nat Rev Microbiol 12:181–196.

9. Zaccaria E, Wells JM, van Baarlen P. 2016. Metabolic Context of the Compe-tence-Induced Checkpoint for Cell Replication in Streptococcus suis. PLoS One 11:e0153571.

10. Yadav T, Carrasco B, Hejna J, Suzuki Y, Takeyasu K, Alonso JC. 2013. Bacillus

subtilis DprA Recruits RecA onto Single-stranded DNA and Mediates

An-nealing of Complementary Strands Coated by SsbB and SsbA *. J Biol Chem 288:22437–22450.

11. Wydau S, Dervyn R, Anba J, Dusko Ehrlich S, Maguin E. 2006. Conservation of key elements of natural competence in Lactococcus lactis ssp. FEMS Mi-crobiol Lett 257:32–42.

12. Redon E, Loubiere P, Cocaign-Bousquet M. 2005. Transcriptome analysis of the progressive adaptation of Lactococcus lactis to carbon starvation. J Bac-teriol 187:3589–3592.

(7)

224

SUMMAR

Y

adaptations of Lactococcus lactis at near-zero growth rates. Appl Environ Mi-crobiol 81:320–331.

14. Ercan O, Wels M, Smid EJ, Kleerebezem M. 2015. Genome-Wide Transcrip-tional Responses to Carbon Starvation in Nongrowing Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol 81:2554–2561.

15. Pedersen MB, Iversen SL, Sørensen KI, Johansen E. 2005. The long and wind-ing road from the research laboratory to industrial applications of lactic acid bacteria. FEMS Microbiol Rev 29:611–624.

16. Mulder J, Wels M, Kuipers OP, Kleerebezem M, Bron PA. 2017. Unleashing natural competence in Lactococcus lactis by induction of the competence regulator ComX. Appl Environ Microbiol 83:e01320-17.

(8)

225

SUMMAR

(9)

226

NEDERLANDSE SAMENV

A

TTING

Nederlandse samenvatting

Miljoenen mensen over de wereld eten gefermenteerde voeding. Voorbeelden hiervan zijn zuivelproducten zoals kaas en yoghurt, maar ook producten zoals bier en wijn (1–3). De Gram-positieve bacterie L. lactis is een belangrijke bacterie in de zuivelindustrie (4) omdat het de lactose in melk verbruikt en omzet naar o.a. melkzuur, een proces dat fermentatie heet (2). Deze bacterie is geclassificeerd als veilig en heeft de GRAS (Generally Regarded As Safe) status en is in overvloed aan-wezig in starter cultures die ontwikkeld zijn voor de productie van kaas, maar ook voor de productie van boter, zure melk en karnemelk (4–6). Ook al wordt L. lactis dus veelvuldig gebruikt voor de productie van zuivel, de huidige aanname is dat

L. lactis oorspronkelijk een bacterie is die van planten komt (7–10). In het genoom

(verzameling van alle genen) van de bacterie vinden continu veranderingen plaats, bijvoorbeeld mutaties op een positie in het DNA, waardoor de bacterie in sommige gevallen beter kan overleven dan zijn ‘’broers en zussen’’ in de leefomgeving waar deze zich op dat moment in bevindt, natuurlijke selectie. Daarnaast kunnen bac-teriën nieuwe eigenschappen verkrijgen door middel van ‘’horizontale gen over-dracht’’ waarbij ze gebruik maken van verschillende systemen zoals bacteriofaag transductie, nanotubes, conjugatie maar ook natuurlijke competentie.

Natuurlijke competentie is een mechanisme dat genetisch gecodeerd is in de bacterie en dat onder speciale omstandigheden tot expressie komt (review: (11– 13). Wanneer dit gebeurt, dan zorgt de regulator ComX er voor dat er een groot ei-witcomplex, gecodeerd door de late competentiegenen, in het celmembraan inge-bouwd wordt (11, 14). Dit eiwitcomplex heeft een ingang, langs de eiwitten ComEA en ComEC, waardoor DNA van de omgeving de cel binnen kan treden en in het genoom geplakt kan worden of, in het geval van plasmides, als autonoom stukje erfelijk materiaal zich in de cel kan bevinden (15). Er zijn nog vele andere eiwitten betrokken, bijvoorbeeld de eiwitten gecodeerd in het comG cluster die een pili structuur vormen of om het DNA bij het complex te krijgen door het te ‘’vangen’’ of om gaten te boren in de celwand zodat het DNA makkelijker bij het eiwitcomplex kan (12). De eiwitten ComFA en ComFC zijn betrokken bij het internaliseren van het DNA (16–18), dat enkelstrengs wordt, en vervolgens beschermd wordt door andere eiwitten zoals DprA, SsbA, zodat het niet afgebroken wordt (19).

In de yoghurt bacterie Streptococcus thermophilus, weten we ook welke genen betrokken zijn bij het ‘’aanzetten’’ van de master regulator ComX die het late petentie systeem tot expressie brengt. Deze genen behoren tot de ‘’early’’

(10)

com-560424-L-bw-Mulder 560424-L-bw-Mulder 560424-L-bw-Mulder 560424-L-bw-Mulder Processed on: 19-5-2021 Processed on: 19-5-2021 Processed on: 19-5-2021

227

NEDERLANDSE SAMENV

A

TTING

petentiegenen en coderen voor een transcriptie factor (ComR) en een feromoon (ComS) (20, 21). ComR en ComS komen tot expressie wanneer S. thermophilus in minimaal chemisch gedefinieerd medium wordt gegroeid (22), waardoor uitein-delijk via ComX ook de late competentiegenen tot expressie worden gebracht en het eiwitcomplex gevormd wordt in de celwand zodat DNA transformatie mogelijk wordt (20).

Op deze manier kan een bacterie, op een natuurlijke manier, nieuwe eigenschap-pen verkrijgen die gecodeerd liggen op het nieuwe stukje erfelijke materiaal dat via natuurlijke competentie de cel is binnen getreden. Dit is dus een belangrijk mechanisme dat de bacterie kan helpen om belangrijke eigenschappen te verkrij-gen waarop de kans op overleving, bijvoorbeeld in een nieuwe omgeving, mo-gelijk vergroot wordt. Bovendien, dit natuurlijke proces kan ook gebruikt worden om betere stammen van bacteriën te krijgen waardoor de fermentatie van voedsel bijvoorbeeld efficiënter verloopt of de smaak en textuur van een product worden verbeterd. Een voordeel van natuurlijke competentie ten opzichte van traditione-le lab technieken om DNA in een cel te krijgen is dat veel grotere stukken DNA opgenomen kunnen worden via natuurlijke competentie en ook wordt DNA veel efficiënter geïntegreerd in het genoom. In de huidige EU wetgeving is het gebruik van genetisch gemodificeerde micro-organismen in voedsel niet toegestaan (23), maar een bacterie die zijn eigen mechanisme gebruikt, zoals natuurlijke competen-tie, om nieuw DNA te verkrijgen valt daar niet onder.

Echter, we weten niet of alle bacteriën dit kunnen en, tot voor kort, wisten we niet of L. lactis dit ook zou kunnen. De aanwezigheid van de competentiegenen wil namelijk niet altijd betekenen dat deze ook functioneel zijn door bijvoorbeeld mu-taties die leiden tot een verkort eiwit. Daarom heb ik in dit onderzoek gekeken of L.

lactis de genetische en functionele capaciteit heeft om dit mechanisme aan te

zet-ten en hoe ik dit systeem kan induceren om te kijken of er DNA opgenomen wordt.

Overzicht van de inhoud van het proefschrift

In dit proefschrift is de ontdekking van een functioneel competentie systeem in L.

lactis beschreven waarbij de master regulator van natuurlijke competentie, ComX,

tot overexpressie is gebracht in stammen met een complete set aan competentie-genen (24). In hoofdstuk 2 is er een vergelijkende genomische analyse uitgevoerd om te bepalen welke L. lactis stammen een complete set competentiegenen heb-ben. De L. lactis stam KF147 werd geselecteerd uit een groep stammen aangezien deze stam een complete set competentiegenen had, maar ook omdat deze de

(11)

228

NEDERLANDSE SAMENV

A

TTING

juiste eigenschappen bevat om, met behulp van het nisine systeem, ComX tot overexpressie te brengen zodat de cel het natuurlijke competentie complex gaat aanmaken. Dit is tot uiting gebracht door middel van het inbrengen van een plas-mide waarbij het gen comX onder controle ligt van de nisine A promotor die ge-activeerd wordt door nisine toe te voegen aan het medium. Alleen middelmatige concentraties van nisine leiden tot transformatie van de cel met DNA dat aangebo-den is in de omgeving en het uitschakelen van de belangrijke competentiegenen

comEA en comEC leidt er toe dat dit niet gebeurt. Hierbij hebben we laten zien

dat het transformeren van de cel daadwerkelijk gebeurd via het natuurlijke compe-tentie systeem. Naast L. lactis KF147, wisten we ook de stammen L. lactis IL1403 en L. lactis KW2 te transformeren conform de voorspelling door de vergelijkende genomische analyse.

Hoofdstuk 3 beschrijft het transcriptoom (het gen expressie profiel) van L. lactis KF147 wanneer ComX middelmatig, maar ook tot hoge expressie wordt gebracht. Door middel van een Fisher correlatie werd bepaald welke genen een positieve of negatieve correlatie hebben in verhouding tot de com genen. Hierbij werd duideli-jk dat, naast de competentiegenen, genen betrokken bij stress, recombinatie, en inorganisch ion transport een positieve correlatie hebben tot de com gen expressie en dat genen die betrokken zijn bij translatie en aminozuur biosynthese juist een negatieve correlatie hebben. Hierbij lijkt de pleiotropische regulator CodY ook een rol te spelen. Deze regulator is belangrijk voor het induceren van een ‘stringent re-sponse’, een waarschuwingssysteem voor de bacteriële cel. Cellen die grote hoev-eelheden ComX produceren stoppen met groeien, maar ook detecteren we geen transformanten. Daarnaast is er ook een dramatischere stress en stringent response dan cellen die middelmatige expressie van ComX hebben en wel transformeerbaar zijn.

In hoofdstuk 4 is de natuurlijke competentie staat van L. lactis KF147 onderzocht in de gehele populatie. Hierbij is er een zogeheten reporter construct gemaakt waarin de coderende sequentie van een groen fluorescent eiwit (gfp) onder con-trole staat van de promotor van comGA in vector pIL253. Dit construct hebben we geplaatst in L. lactis KF147 naast het construct dat ComX tot overexpressie brengt wanneer er met nisine geïnduceerd wordt (pNZ6200). De cellen die beide constructen bevatten werden vervolgens geïnduceerd met middelmatige en hoge concentraties van nisine om expressie van ComX te stimuleren. Bij middelmatige expressie van ComX in deze cellen zagen we heterogene, oftewel veel verschillen, activatie van de competentie promotor in de hele populatie terwijl bij hoge expres-sie van ComX zagen we een meer homogene activatie van de competentie

(12)

promo-560424-L-bw-Mulder 560424-L-bw-Mulder 560424-L-bw-Mulder 560424-L-bw-Mulder Processed on: 19-5-2021 Processed on: 19-5-2021 Processed on: 19-5-2021

229

NEDERLANDSE SAMENV

A

TTING

tor. Bovendien, transformatie kon niet worden gedetecteerd en de capaciteit om een kolonie te vormen was verminderd bij cellen met hoge expressie van ComX. Echter, deze cellen die hoge niveaus van ComX tot expressie brengen, bleven wel intact en konden blijven verzuren wat er wel op wijst dat cellen metabool actief blijven.

In hoofdstuk 5 hebben is geprobeerd om te ontdekken wat de natuurlijke ‘’trig-ger’’ is voor natuurlijke competentie in L. lactis door een high-throughput screening methode op te zetten waarin we condities nabootsen waarin een voedsel tekort is of een stringent response kunnen induceren. 8 L. lactis stammen, die een complete set competentiegenen hebben, werden gebruikt als test panel om transformatie te detecteren in de verschillende condities. In geen van de condities werd transfor-matie waargenomen bij de 8 L. lactis stammen ondanks dat er een fenotypische re-sponse te zien was wanneer de stammen werden blootgesteld aan ‘’verhongering’’ en condities die een stringent-response kunnen induceren. Elke conditie bevatte genoeg cellen om transformatie te kunnen detecteren, dit bleek na het bepalen van de CFUs (Colony Forming Units) en de in acht genomen transformatie graad. Tot dusver is de natuurlijke trigger om natuurlijke competentie te activeren in L.

lactis dus nog niet ontdekt.

In het laatste hoofdstuk, hoofdstuk 6, worden de bevindingen van hoofdstuk 2 t/m 5 bediscussieerd in algemene zin. Hierin wordt o.a. besproken wat een mo-gelijke verklaring kan zijn waarom de competentiegenen van L. lactis vervallen in stammen die aangepast zijn om te kunnen groeien in zuivel in tegenstelling tot de

L. lactis stammen die aan de plant omgeving aangepast zijn. Ook is het frappant

dat de S. thermophilus stammen die gebruikt worden in zuivel productie (met name yoghurt) wel altijd een complete set competentiegenen hebben in tegenstelling tot de L. lactis stammen die ook in zuivel kunnen groeien. Een mogelijke verklaring hiervoor wordt ook in dit hoofdstuk besproken. Daarnaast wordt uiteen gezet in hoeverre de bevindingen in hoofdstuk 2 t/m 5 kunnen bijdrage aan toekomstig onderzoek betreft natuurlijke competentie in L. lactis en het vinden van de natuurli-jke trigger hiervan. Tot slot wordt er een toekomst perspectief geschetst waarin natuurlijke methodes voor het verbeteren van stammen bediscussieerd wordt, maar ook waarom dit onderwerp belangrijk blijft om te blijven bestuderen en welke informatie nodig is om voedsel te kunnen verbeteren door middel van een ver-beterde stam prestatie.

(13)

230

NEDERLANDSE SAMENV

A

TTING

Referenties

1. Tamang JP, Shin DH, Jung SJ, Chae SW. 2016. Functional properties of micro-organisms in fermented foods. Front Microbiol 7:578.

2. Marco ML, Heeney D, Binda S, Cifelli CJ, Cotter PD, Foligné B, Gänzle M, Kort R, Pasin G, Pihlanto A, Smid EJ, Hutkins R. 2017. Health benefits of fer-mented foods: microbiota and beyond. Curr Opin Biotechnol 44:94–102. 3. Rezac S, Kok CR, Heermann M, Hutkins R. 2018. Fermented foods as a

die-tary source of live organisms. Front Microbiol 9:1785.

4. Stiles ME, Holzapfel WH. 1997. Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. Int J Food Microbiol 36:1–29.

5. Leroy F, De Vuyst L. 2004. Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry. Trends Food Sci Technol 15:67–78.

6. Cavanagh D, Fitzgerald GF, McAuliffe O. 2015. From field to fermentation: The origins of Lactococcus lactis and its domestication to the dairy environ-ment. Food Microbiol 47:45–61.

7. Wels M, Siezen R, van Hijum S, Kelly WJ, Bachmann H. 2019. Comparative Genome Analysis of Lactococcus lactis Indicates Niche Adaptation and Re-solves Genotype/Phenotype Disparity. Front Microbiol 10:4.

8. Kelly WJ, Ward LJH, Leahy SC. 2010. Chromosomal diversity in Lactococcus

lactis and the origin of dairy starter cultures. Genome Biol Evol 2:729–744.

9. Wels M, van Hylckama Vlieg JET, Siezen RJ, van Hijum SAFT, Felis GE, Star-renburg M, van der Sijde MR, Molenaar D, Bayjanov JR. 2011. Genome-scale diversity and niche adaptation analysis of Lactococcus lactis by comparative genome hybridization using multi-strain arrays. Microb Biotechnol 4:383– 402.

10. Bachmann H, Starrenburg MJC, Molenaar D, Kleerebezem M, Van Hylckama Vlieg JET. 2012. Microbial domestication signatures of Lactococcus lactis can be reproduced by experimental evolution. Genome Res 22:115–124.

11. Johnston C, Martin B, Fichant G, Polard P, Claverys JP. 2014. Bacterial trans-formation: Distribution, shared mechanisms and divergent control. Nat Rev Microbiol 12:181–196.

12. Muschiol S, Balaban M, Normark S, Henriques-Normark B. 2015. Uptake of extracellular DNA: Competence induced pili in natural transformation of

Streptococcus pneumoniae. BioEssays 37:426–435.

13. Mell JC, Redfield RJ. 2014. Natural Competence and the Evolution of DNA Uptake Specificity. J bac 196:1471–1483.

(14)

231

NEDERLANDSE SAMENV

A

TTING

14. Wydau S, Dervyn R, Anba J, Dusko Ehrlich S, Maguin E. 2006. Conservation of key elements of natural competence in Lactococcus lactis ssp. FEMS Mi-crobiol Lett 257:32–42.

15. Dubnau D. 1999. DNA Uptake in Bacteria. Annu Rev Microbiol 53:217–244. 16. Londoño-Vallejo JA, Dubnau D. 1993. comF, a Bacillus subtilis late

compe-tence locus, encodes a protein similar to ATP-dependent RNA/DNA helicas-es. Mol Microbiol 9:119–131.

17. Londono-Vallejo JA, Dubnau D. 1994. Mutation of the putative nucleotide binding site of the Bacillus subtilis membrane protein ComFA abolishes the uptake of DNA during transformation. J Bacteriol.

18. Londoño-Vallejo JA, Dubnau D. 1994. Membrane association and role in DNA uptake of the Bacillus subtilis PriA anaiogue ComF1. Mol Microbiol. 19. Yadav T, Carrasco B, Hejna J, Suzuki Y, Takeyasu K, Alonso JC. 2013. Bacillus

subtilis DprA Recruits RecA onto Single-stranded DNA and Mediates

An-nealing of Complementary Strands Coated by SsbB and SsbA *. J Biol Chem 288:22437–22450.

20. Fontaine L, Boutry C, Henry De Frahan M, Delplace B, Fremaux C, Horvath P, Boyaval P, Hols P. 2010. A Novel Pheromone Quorum-Sensing System Con-trols the Development of Natural Competence in Streptococcus

thermophi-lus and Streptococcus salivarius . J Bacteriol 192:1444–1454.

21. Fontaine L, Wahl A, Fléchard M, Mignolet J, Hols P. 2014. Regulation of com-petence for natural transformation in streptococci. Infect Genet Evol 33:343– 360.

22. Gardan R, Besset C, Guillot A, Gitton C, Monnet V. 2009. The oligopeptide transport system is essential for the development of natural competence in

Streptococcus thermophilus strain LMD-9. J Bacteriol 191:4647–4655.

23. Pedersen MB, Iversen SL, Sørensen KI, Johansen E. 2005. The long and wind-ing road from the research laboratory to industrial applications of lactic acid bacteria. FEMS Microbiol Rev 29:611–624.

24. Mulder J, Wels M, Kuipers OP, Kleerebezem M, Bron PA. 2017. Unleashing natural competence in Lactococcus lactis by induction of the competence regulator ComX. Appl Environ Microbiol 83:e01320-17.

(15)

(16)

DANKWOORD

ABOUT THE AUTHOR

LIST OF PUBLICATIONS

(17)

234

DANKWOORD

Dankwoord

En daar is ie dan, het proefschrift! Het was een fantastische ervaring, uiteraard met ups-and-downs, die ik zeker weten nooit had kunnen behalen zonder de begeleid-ing die ik heb gekregen. Allereerst wil ik Michiel en Peter heel erg bedanken voor jullie kritische blik, eerlijkheid maar ook jullie humor. Ik heb veel van jullie geleerd en ik ben blij dat jullie me ook vrijheid gaven binnen dit project. Daarnaast wil ik ook _{Oscar bedanken voor zijn oneindige positivisme en optimisme. Dat werkt erg} aanstekelijk waardoor ik weer vol goede moed aan de slag ging, zeker als het even tegen zat! Daarnaast wil ik ook de groepen _{HMI (WUR) en MolGen (RUG)} bedank-en voor de gastvrijheid bedank-en support.

Zoals de meeste lezers zullen weten, zat ik niet op een lab bij de Rijksuniversiteit Groningen, maar op het AIO lab bij NIZO in Ede._{Simon, heel erg bedankt voor de} discussies over van alles en nog wat en voor je droge humor! Bedankt dat je mijn paranimf wilde zijn!

En natuurlijk ook een heel speciaal bedankje voor _{Saskia, bedankt dat je mijn} para-nimf wilde zijn en dat je altijd eerlijk en kritisch bent, maar ook dank voor al je hulp bij cruciale momenten en experimenten.

Michiel (Wels), heel erg bedankt voor alle bio-informatica analyses! Voor mij blijft dat toch een soort tovenarij :).

En uiteraard ook heel erg bedankt Sabri, Koen, en Marieke voor al jullie hulp! Ik vond het heel leuk om jullie te kunnen begeleiden in jullie stageproject of afstu-deerproject. Leuk dat we daarna zelfs collega’s werden Sabri! Nog steeds ben je dus nog niet helemaal van mij af ;).

Special thanks to all former PhD students at A233 during my PhD time at NIZO, especially: Avis, Claire, Erwin, Kristian, and Matthew. I enjoyed our funny chats, weird directions of conversation, the beautiful pictures and signs in the lab and our spooky dry ice art shows among other things that are better left unsaid here :). Ook dank aan mijn after-PhD NIZO oud-office maatjes Erik, Fini en Jos! Al is het wel frappant dat sinds ik in het kantoor zit, niemand van jullie nu meer werkt bij NIZO…

(18)

235

DANKWOORD

Therefore I would like to wish my new office buddies Nando and Andrei a lot of luck with me as office buddy in the coming years although the COVID-19 pandemic still disrupts the new office atmosphere unfortunately…

Verder wil ik alle (oud) NIZO’ers enorm bedanken voor alle hulp, koffie pauzes en wetenschappelijke input. Ik ga een poging doen om iedereen te bedanken waar ik mee samen heb gewerkt, mij heeft geholpen of die op een andere manier met mij te maken heeft gehad tijdens mijn onderzoek: Alwine, Andrei, Angelina, Anne-reinou, Anne, Anita, Arjen, Avis, Bart, Dave (bedankt voor de koelkas :)), Els, Elly, Emmie (bedankt voor de mental support!), Erik, Erwin, Esther, Fedde, Guus, Hans, Herwig, I-Chiao, Igor, Ioana, Ingrid (bedankt voor je hulp in het lab!), Iris (cloning wizard!), Ita, Jacqueline, Janneke, José, Joyce S., Maartje, Mariya, Marjo (bedankt voor je hulp bij de transcriptoom experimenten!), _{Marjon, Marke (bedankt voor je} hulp in het lab!), Martijn, Michiel, Nando, Nel, Nico, Patrick (bedankt voor alle hulp bij de FACS!), _{Peter, Petra, Sabina, Sabri, Sacha, Saskia (bedankt voor je hulp in het} lab!), Sylviani, Raymond, Renée, Robyn, Vesela, en Wim.

Trouwens, sorry als ik vergeten ben om je in het NIZO-lijstje te zetten of in een van de andere lijstjes, dit zal waarschijnlijk komen doordat ik na zoveel jaar misschien het typen een beetje zat bent ;). Niets persoonlijks dus!

I would also like to thank all industrial partners within the BE-BASIC consortium flagship 10 with a special thanks to: _{Patrick Derkx, Eric Johansen, Mariela Serrano,} Arno Wegkamp, Wilco Meijer, Arjen Nauta, and Tadhg O’Sullivan. Our meetings were always very productive and interesting! Besides, of course, a special thanks to Barbara and Luiza, it was nice working together within the PhD-team, and also many thanks to _{Jan Kok!}

Veel mensen kunnen beamen dat het afleveren van een thesis gepaard gaat met de juiste afleiding. Wat ik kan aanraden is, vooral als je naar een nieuwe stad en zelfs nieuwe provincie verhuist, om lid te worden van een sportclub. Daarom wil ik alle leden (en sommige oud-leden) van Hellas Triathlon bedanken, ook voor de leuke uitjes naar de Ardennen (hopelijk kan dat gauw weer), en in het bijzonder: Marije, Nynke (+ familie), Youri, Inge, Karin, Sjoerd, Sarah, Karen, Jamie, Maaike, Rui-Peng, Nick, Tamara, Nienke, Frank, Oscar, Evelien, Janneke, Laura, Stephan, baan 6 (het doet nog steeds een beetje pijn doet dat ik jullie verlaten heb), Anne voor de zwemmoves en alle andere trainers! Vooral de trainers die nog hebben

(19)

ge-560424-L-bw-Mulder 560424-L-bw-Mulder 560424-L-bw-Mulder 560424-L-bw-Mulder Processed on: 19-5-2021 Processed on: 19-5-2021 Processed on: 19-5-2021

236

DANKWOORD

probeerd om iets te maken van mijn looponderdeel ;) Het was altijd super gezellig met de training, wedstrijden of weekendjes weg. Ik dacht altijd triathlon is voor gekkies (misschien is dat nog steeds we een beetje zo, maar ben ik er nu zelf ook een), maar jullie zijn ook vooral hele relaxte leuke mensen. De leuke wedstrijden die ik met jullie heb gedaan en nieuwe ervaringen die ik heb opgedaan hebben me enorm veel gebracht en waren een super afleiding. Daarom ook een mega speciaal bedankje naar _{Jacomina, mijn coach die ervoor heeft gezorgd dat zelfs tijdens de} COVID-19 pandemie, ik mijn droom, een hele triathlon voltooien, nog kon waar-maken en dat al mijn training efforts niet voor niets waren geweest! De aanloop naar en de ervaring zelf was een hele mooie afleiding tijdens de afronding van mijn proefschrift. En verder: bedankt alle leden van mijn nieuwe clubs Aquapoldro (TriA) en TTvW en ‘’ m’n oude zwemclubgenootjes’’ WS-Twente maatjes Janneke + Jelte en_{Evelien voor de afleiding!}

Verder ook dank aan alle vrienden in de oud-BML groep/Hosselchat ;) + aanhang voor de steun en gezellige uitjes maar ook voor het aanhoren van mijn proefschrift verhalen ;), en dan in het bijzonder: _{Sjoerd, Tonja, Eliene, Kathelijn, Helma,} Her-man, QW, Annemiek, Renske, Berdine en Marijn.

Dankjewel Elma voor je flexibiliteit, de mooie omslag en formatting van het proef-schrift!

Bedankt aan de Wissinks: _{Rob, Miriam, Dion, Karst en aanhang! Jullie kennen me} ondertussen al zo’n 10 jaar en ik waardeer jullie gezelligheid en nuchterheid enorm! Ook wil ik mijn familie bedanken. Oom Toon, Jane en Jessica; bedankt voor alle steun en interesse. _{Tante Jet, oom Menno en Thijn bedankt voor alle gezellige} fa-milie momentjes! In gedachten natuurlijk ook lieve Merlin, misschien ben jij wel de reden geweest dat ik überhaupt dit pad ingeslagen ben. Ik mis je.

Oma, van jouw eeuwig optimisme en doorzettingsvermogen heb ik een hoop ge-leerd! Helaas heb je de verdediging niet meer kunnen meemaken, maar je steun tijdens het proces is enorm waardevol geweest! _{Opa, ‘’ den Oaldn’’, het is altijd} lachen samen met jou, wat een fantastische humor heb je toch, en wat een leuke gesprekken hebben we de afgelopen jaren gevoerd. Bedankt voor alles en je inte-resse in mijn onderzoek!

(20)

237

DANKWOORD

Mama, jouw vrolijkheid en betrokkenheid bij mij en Lincy is van onschatbare waar-de geweest, zeker bij het schrijven van waar-deze thesis. Dankzij jou is het altijd gezellig thuis, maar ook natuurlijk dankzij papa! _{Papa, jouw opbeurende peptalks en} ge-zellige wandelingetjes en mountainbike tochtjes zijn ook van onschatbare waarde geweest. Wat ik ook enorm waardeer is dat jullie me altijd stimuleerden om te doen wat ik leuk vond, zonder daarbij te pushen. Pap, mam, zonder jullie had ik dit nooit gekund. _{Lincy en Wies, ook heel er bedankt voor al jullie steun! Lincy, ik ben blij} dat er iemand is die om precies dezelfde dingen lacht ;) en met me mee wil kijken naar Friends :) en ondertussen ook naar Modern Family. Het was altijd gezellig om weer af te spreken in het oosten, westen, of midden ;). Afstand kan ons niet schei-den. Ook al woonde ik ‘ver weg’, dit voelde niet meer zo na een simpel telefoontje doordeweeks en leken jullie allemaal weer heel dichtbij. En terugkomen naar het mooie Twente bleef altijd aanvoelen als vanouds.

Camiel, ik weet niet of het me was gelukt zonder jouw relativeringsvermogen, dro-ge humor en steun in alles wat ik doe. Ik denk dat jij meer vertrouwen in mij had dan ik zelf. Ik kan denk ik niet op papier zetten hoeveel je voor me betekent, dus dat ga ik maar niet proberen. Wel weet ik zeker dat ik het je soms lastig hebt gemaakt, sorry nog daarvoor, maar dat hoort er vast een beetje bij ;). De afgelopen jaren waren de mooiste jaren uit mijn leven vooral dankzij jou en ik ben benieuwd naar wat het leven ons nog meer gaat brengen :).

(21)

238

ABOUT THE AUTHOR

About the author

Joyce Mulder was born on November 19th 1990 in Hengelo (Ov), The Netherlands. After primary school at Basisschool de Drienermarke, educa-tion was continued at Twickel College Hengelo (Ov) where she obtained her HAVO diploma. Af-terwards, her laboratory skills were developed at Saxion University (Enschede) during the program: Biologie en medisch laboratorium onderzoek. In this program, she did her internship at the Rijk-suniversiteit Groningen under supervision of Prof. dr. Oscar Kuipers, Prof. dr. Matthias Heinemann and Prof. dr. Jan Willem Veening. She was a member of the iGEM team 2011 that worked on creating a bistable switch and dynamic memory

counting device with an output on request in Escherichia coli. The team passed the preliminary round for the EU, received a Gold Medal, and advanced to the World Jamboree in Boston (USA). Afterwards, her final internship for the BASc degree was done at the Hubrecht Institute in the group of Prof. dr. Hans Clevers under super-vision of dr. Sylvia Boj where she worked on a 3D culture of pancreatic organoids that can be expanded and differentiated towards the endocrine lineage and is a co-author on the publication. After finishing her BAsc. degree, she advanced to-wards a master’s program at the Vrije Universiteit Amsterdam to follow the program Biomolecular sciences. During this 2-year program, many courses were attended and two internships were completed. The first internship was completed in the group of Prof. dr. René Medema/ dr. Benjamin Rowland under supervision of dr. Judith Haarhuis at the Netherlands Cancer Institute in which it was discovered that mutations in the ATPase domain of Smc1 result in Wapl- resistant cohesin complex-es at human chromosomcomplex-es. The second and final internship was done in the group of Prof. dr. Clemens van Blitterswijk at the University of Twente under supervision of dr. Hugo Fernandes and dr. João Crispim in which functionalized surfaces that stimulate tendon/ligament healing by inducing TGF-β signalling were studied. In September 2014, she started on the PhD project within the BE-Basic consortium resulting in this thesis. Although she was a PhD candidate at the Rijksuniversiteit Groningen, the project was executed at NIZO food research in Ede. Since 2020,

(22)

239

ABOUT THE AUTHOR

she works as a project manager in the health division at NIZO in the field of in vitro assays and fermentation. Besides her interest in biology, health and food, she is also a very passionate triathlete and you can find her in her spare time somewhere in the forests of the Veluwe, lake or in a swimming pool.

(23)

240

LIST OF PUBLICA

TIONS

List of publications

Bron PA, Marcelli B, Mulder J, van der Els S, Morawska LP, Kuipers OP, Kok J, Kleer-ebezem M. Renaissance of traditional DNA transfer strategies for improve-ment of industrial lactic acid bacteria. Curr Opin Biotechnol. 2019 Apr;56:61-68. doi: 10.1016/j.copbio.2018.09.004. Epub 2018 Oct 11. PMID: 30317145. Mulder, J., Wels, M., Kuipers, O. P., Kleerebezem, M. and Bron, P. A. (2018). In-duction of Natural Competence in Genetically-modified Lactococcus lactis. Bio-protocol. 2018 July 5;8(13): e2922. doi: 10.21769/BioProtoc.2922. Mulder J, Wels M, Kuipers OP, Kleerebezem M, Bron PA. Unleashing Natural

Com-petence in Lactococcus lactis by Induction of the ComCom-petence Regulator ComX. Appl Environ Microbiol. 2017 Sep 29;83(20):e01320-17. doi: 10.1128/ AEM.01320-17. PMID: 28778888; PMCID: PMC5626998.

Huch M, Bonfanti P, Boj SF, Sato T, Loomans CJ, van de Wetering M, Sojoodi M, Li VS, Schuijers J, Gracanin A, Ringnalda F, Begthel H, Hamer K, Mulder J, van Es JH, de Koning E, Vries RG, Heimberg H, Clevers H. Unlimited in vitro ex-pansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO J. 2013 Oct 16;32(20):2708-21. doi: 10.1038/emboj.2013.204. Epub 2013 Sep 17. PMID: 24045232; PMCID: PMC3801438.