University of Groningen
Opportunities and Challenges of Epigenetic Editing in Human Diseases
Goubert, Désirée
DOI:
10.33612/diss.173201281
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2021
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Goubert, D. (2021). Opportunities and Challenges of Epigenetic Editing in Human Diseases: Towards the Curable Genome. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.173201281
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
EEnngglliisshh SSuum
mm
maarryy
N
Needdeerrllaannddssee SSaam
meennvvaattttiinngg
AAcckknnoow
wlleeddggeem
meennttss
LLiisstt ooff PPuubblliiccaattiioonnss
English Summary
Nederlandse Samenvatting
List of Publications
Acknowledgements
A
147043 Goubert BNW.indd 219 147043 Goubert BNW.indd 219 27-05-2021 11:0827-05-2021 11:08EEnngglliisshh SSuum
mm
maarryy
Epigenetics is a small, chemical layer on top of the DNA that controls gene expression. Genes can be switched on or off by epigenetic marks, but their expression can also be increased or decreased. This epigenetic layer remains stable during cell division, but is also reversible and influenced by the environment. In many diseases this epigenetic layer is disturbed, which causes some genes to be incorrectly transcribed in high amounts, whilst others are wrongfully repressed. The research presented in this thesis focusses on identifying and reversing epigenetic defects that are associated with disturbed gene expression patterns in human diseases (Chapter 1).
This research made use of Epigenetic Editing, a technique in which enzymes, coupled to DNA-binding platforms, place or remove epigenetic marks at a specific piece of DNA, without changing the original DNA sequence. Artificial transcription factors (ATFs), transcription factor domains combined with DNA-binding platforms, can also be used to modulate gene expression in a targeted way. The two DNA-binding platforms used in this thesis are CRISPR-dCas9 and Zink Finger proteins (ZFs). The use of Epigenetic Editing to unravel the role of epigenetic regulation in the development of endocrine therapy resistance in oestrogen positive breast cancer, is extensively discussed in Chapter 2. This aim was also party of the international consortium, of which this PhD project was part: “EpiPredict”. This “Innovative Training Network (ITN)” received financial support from the European Union (H2020 MSCA-ITN-2014) and was coordinated by the second promotor of this thesis Dr. PJ Verschure, UvA, NL. During my PhD research multiple molecular tools were developed that can be used to further investigate specific resistance genes and eventually towards preventing or reversing therapy resistance.
One of the epigenetic marks that can influence gene expression by applying functional changes in the genome is DNA methylation. DNA methylation in the promoter regions of a gene generally causes a decreased gene expression. DNA methylation changes the recognition site for the binding of a so-called transcription factor and attracts proteins that subsequently cause a tight packaging of the DNA in the nucleus. Because of this, transcription
proteins are not able to transcribe the gene to eventually form a functional protein. Specific placement of removal of DNA methylation by means of Epigenetic Editing in these promotor regions can thus contribute to targeted modulation of specific genes. The available molecular tools that can accomplish this are described in Chapter 3, as well as the advantages and disadvantages of this technique.
One of the genes of which the expression was modulated by using Epigenetic Editing is PLAU (Chapter 4), a gene that is correlated with tumour growth, aggressiveness and metastasis in several types of cancer (including breast cancer). In this study the functional role of PLAU as an oncogene was tested in breast cancer cell lines. The expression of this gene was modulated by using the CRISPR-dCas9 platform coupled to epigenetic enzymes and ATFs. Targeted delivery of these constructs to the PLAU gene resulted in an increased expression that was linked to an increased aggressiveness and invasiveness in breast cancer cells with a low PLAU expression. Modulation in the other direction, repressing PLAU in breast cancer cells with a high PLAU expression, was not possible at this stage, most likely because of a low transfection efficiency. The predicted functional differences after targeted increase of the PLAU gene, including increased invasiveness, confirm the oncogenic activity of PLAU in breast cancer cells and presents opportunities to use these tools to modulate PLAU expression.
An important challenge of Epigenetic Editing is the context-dependency of for example sustained modulation of gene expression. This is important to further develop into a “one-and-done” for effective and specific interventions in a clinical setting, in which patients are treated once, after which the modulated epigenetic marks remain present on the gene. In Chapter 5 we investigated whether sustained repression of the cancer- and fibrosis-associated gene PLOD2 could be accomplished using the DNA methyltransferase M.SssI, or by the ATF KRAB. The ZF-M.SssI fusions were able to induce DNA methylation, showed a context-dependent deposition of gene-repressing histone marks and resulted in a 50-70% repression of the PLOD2 gene in fibrotic fibroblasts and MDA-MB-231 breast cancer cells. ZF-KRAB fusions resulted in gene-repressing histone modifications without DNA methylation, and an almost complete repression of PLOD2. Targeted modulation of PLOD2 using transient CRIPSR-dCas9-KRAB constructs also resulted in a sustained PLOD2 repression in “human embryonic kidney cells” (HEK293T) and MCF-7 breast cancer cells, whilst this was not the case (or to a Appendix 1
lesser extend) for CRISPR-dCas9-M.SssI. These results show that repression of PLOD2 using a non-catalytic ATF, delivered in a transient manner, can lead to a sustained gene repression that lasts at least 12 days. This is in contradiction with the current consensus which states that multiple effector domains (EDs) are needed to obtain sustained effects.
To further tackle the challenges and opportunities of Epigenetic Editing in human diseases several technological improvements have been made over the past years. In Chapter 6 we investigated some of these improvements by modulating UCHL1, a gene with relevance in cancer and airway diseases. We made use of multiple DNA-binding platforms: CIRPSR-dCas9 and the MS2 system, several DNA methyltransferase enzymes, and sorting by means of “Fluorescence Activated Cell Sorting” (FACS). This latter approach, in which fluorescent labels are coupled to Epigenetic Editing tools that can be sorted for cells that have actively taken up the constructs, was shown to be the most successful for modulation of UCHL1. In Chapter 7, a detailed protocol is described to make stable cell lines. These cells constantly express the CRISPR-dCas9-Eds which makes delivery of these constructs by means of transient methods unnecessary. By transient delivery of the DNA-binding sgRNAs, or by making the expression of the CRISPR-dCas9-EDs inducible, this method can still be used to investigate sustained effects.
The many improvements as well as the research presented in this thesis are bringing us closer to the eventual goal: “A curable genome in which Epigenetic Editing is used to modulate gene expression, without changing the DNA sequence”.
N
Needdeerrllaannddssee SSaam
meennvvaattttiinngg
Epigenetica is een kleine, chemische laag bovenop het DNA die de genexpressie mede bepaalt. Genen kunnen door epigenetische markeringen aan- en uitgeschakeld worden, maar ook hoger of lager tot expressie komen. Deze epigenetische laag blijft stabiel aanwezig tijdens celdeling, maar is eveneens omkeerbaar en beïnvloedbaar door de omgeving. In vele ziekten is deze epigenetische laag verstoord, waardoor sommige genen onterecht meer worden afgeschreven en anderen onterecht worden geremd. Het onderzoek gepresenteerd in deze thesis focust zich op het identificeren en omkeren van epigenetische defecten die geassocieerd zijn met verstoorde genexpressie-patronen in menselijke ziekten (Hoofdstuk 1). Voor dit onderzoek werd gebruik gemaakt van Epigenetisch Editen, een techniek waarbij enzymen, gekoppeld aan DNA-bindende platformen, epigenetische markeringen op een specifiek stuk DNA plaatsen of hiervan verwijderen, zonder daarbij de originele DNAsequentie te veranderen. Artificiële transcriptie factoren (ATFs), transcriptie-effector domeinen gecombineerd met DNA-bindende platformen, kunnen ook gebruikt worden om de genexpressie op een doelgerichte manier te moduleren. De twee DNA-bindende platformen gebruikt in deze thesis zijn CRISPR-dCas9 en Zink Finger proteïnen (ZFs). Het gebruik van Epigenetisch Editen voor het ontrafelen van de rol van epigenetische regulatie in de ontwikkeling van resistentie tegen endocriene therapie bij oestrogeen positieve borstkanker, wordt uitgebreid besproken in Hoofdstuk 2. Deze doelstelling was ook een onderdeel van het internationale consortium, waarvan dit PhD project deel uitmaakte: “EpiPredict”. Dit “Innovative Training Network (ITN)” verkreeg financiering van de Europese Unie (H2020 MSCA-ITN-2014) en werd gecoördineerd door de tweede promotor van deze thesis Dr. PJ Verschure, UvA, NL. Tijdens mijn promotieonderzoek werden meerdere moleculaire tools ontwikkeld die ingezet kunnen worden om de rol van bijvoorbeeld specifieke resistentiegenen verder te onderzoeken en uiteindelijk toe te werken naar het voorkomen of omkeren van de therapie-resistentie.
Een van de epigenetische markeringen die genexpressie kan beïnvloeden door functionele veranderingen aan te brengen in het genoom is DNA methylatie. DNA methylatie in
promotorregio’s van een gen zorgt in het algemeen voor een verminderde genexpressie. DNA methylatie verandert de herkenningsplaats voor binding van een zogenaamde transcriptiefactor en trekt eiwitten aan die vervolgens voor een strakke verpakking van het DNA in de nucleus zorgen. Hierdoor kunnen transcriptie-eiwitten het gen niet afschrijven om uiteindelijk een functioneel eiwit te vormen. Het doelbewust plaatsen of verwijderen van DNA methylatie via Epigenetisch Editen op deze promotor regio’s kan dus bijdragen aan het doelgericht uit- of aanschakelen van specifieke genen. De beschikbare moleculaire tools die dit kunnen verwezenlijken worden besproken in Hoofdstuk 3, alsook de voor- en nadelen van deze techniek.
Een van de genen waarvan de expressie via Epigenetisch Editen gemoduleerd werd is PLAU (Hoofdstuk 4), een gen dat gecorreleerd is met tumorgroei, agressiviteit en uitzaaiing in verschillende types van kanker (inclusief borstkanker). In deze studie werd de functionele rol van PLAU als een oncogen getest in borstkankercellijnen. De expressie van dit gen werd gemoduleerd door gebruik te maken van het CRISPR-dCas9 platform gekoppeld aan epigenetische enzymen en ATFs. Het doelgericht afsturen van deze constructen naar het PLAU gen resulteerde in een verhoogde genexpressie die gekoppeld was aan een verhoogde agressiviteit en invasiviteit in borstkankercellen met een lage PLAU expressie. De omgekeerde modulatie, het onderdrukken van PLAU expressie in borstkanker cellen met een hoge PLAU expressie, was in deze fase niet mogelijk, hoogstwaarschijnlijk door een slechte aflevering van de constructen in deze cellen. De verwachte functionele verschillen na doelgerichte verhoging van PLAU, zoals de verhoogde uitzaaiing, bevestigen de oncogene activiteit van PLAU in borstkankercellen en opent deuren voor het gebruik van deze tools om PLAU expressie te moduleren.
Een belangrijke uitdaging bij Epigenetisch Editen is de context-afhankelijkheid van bijvoorbeeld blijvende modulatie van de genexpressie. Dit is belangrijk om verder te ontwikkelen in een voor de hand liggende “one-and-done” technologie voor effectieve en specifieke interventies in een klinische setting, waarbij patiënten één keer behandeld worden, waarna de epigenetische markeringen aanwezig blijven op het gemoduleerde gen. In Hoofdstuk 5 werd onderzocht of blijvende repressie van het fibrose- en kanker-gerelateerde PLOD2 gen verwezenlijkt kon worden door het DNA methyltransferase enzym M.SssI, of door Appendix 2
de ATF KRAB. De ZF-M.SssI fusies waren in staat om DNA methylatie te induceren, vertoonde een context-afhankelijke afzetting van gen-onderdrukkende histonmarkeringen en resulteerden in een 50%–70% vermindering van PLOD2 genexpressie in fibrotische fibroblasten en in MDA-MB-231 borstkankercellen. ZF-KRAB fusies resulteerden in gen-onderdrukkende histonmodificaties zonder DNA methylatie en in een bijna volledige onderdrukking van PLOD2. Het doelgericht moduleren van PLOD2 met transiënte CRISPR-dCas9-KRAB constructen resulteerde eveneens in een blijvende PLOD2 repressie in “human embryonic kidney cells” (HEK293T) en MCF-7 borstkankercellen, terwijl dit niet (of in mindere maten) het geval was voor CRISPR-dCas9-M.SssI. Deze resultaten duiden erop dat PLOD2 repressie door een niet-katalytische ATF, die op een transiënte manier wordt afgeleverd, kan leiden tot een blijvende genrepressie die minstens 12 dagen aanhoudt. Dit is in tegenspraak met de huidige consensus die aangeeft dat voor blijvende effecten van epigenetisch herprogrammeren meerdere effector domeinen (EDs) noodzakelijk zijn.
Om de huidige uitdagingen en mogelijkheden van Epigenetisch Editen in menselijke ziekten verder aan te pakken werden er de laatste jaren meerdere technologische verbeteringen geïntroduceerd. In Hoofdstuk 6 werden verschillende van deze benaderingen onder de loep genomen en uitgetest door modulatie van UCHL1, een gen met relevantie in kanker en luchtwegziekten. Zo werd er gebruik gemaakt van meerdere DNA-bindende platformen: CRISPR-dCas9 en het MS2 systeem, verschillende DNA methyltransferase enzymen en het sorteren van cellen door middel van “Fluorescence Activated Cell Sorting” (FACS). Deze laatste benadering, waarbij fluorescente labels gekoppeld zijn aan de Epigenetische Editing tools zodat er actief kan worden gesorteerd voor cellen die de constructen effectief hebben opgenomen, bleek de meest succesvolle benadering voor het moduleren van UCHL1. In Hoofdstuk 7, wordt een gedetailleerd protocol beschreven om stabiele cellen te maken. Deze cellen brengen constant de CRISPR-dCas9-EDs tot expressie, waardoor aflevering van deze constructen via transiente methoden niet meer nodig is. Door het transient afleveren van de DNA-bindende sgRNAs, of door de expressie van de CRISPR-dCas9-EDs induceerbaar te maken, kan deze benadering nog steeds gebruikt worden om blijvende effecten te onderzoeken.
Deze vele vooruitgangen en het onderzoek gepresenteerd in deze thesis brengen ons dichter bij het uiteindelijke doel: “Een geneesbaar genoom waarbij Epigenetisch Editen wordt gebruikt om genexpressie te moduleren, zonder daarbij de DNA sequentie te veranderen”. Appendix 2
LLiisstt ooff PPuubblliiccaattiioonnss
Goubert D. Opportunities and challenges of Epigenetic Editing in human diseases - Towards the curable genome. Forthcoming P.hD. thesis 2020
Goubert D, Gjaltema RAF, Huisman C, García Tobilla CDP, Koncz M, Jellema PG, et al. KRAB- Induced Heterochromatin Effectively Silences PLOD2 Gene Expression in Somatic Cells and
Is Resilient to TGFβ1 Activation. International Journal of Molecular Sciences. 2020;21(10). Goubert D, Koncz M, Kiss A, Rots MG. Establishment of Cell Lines Stably Expressing
dCas9-Fusions to Address Kinetics of Epigenetic Editing. Methods Mol Biol. 2018;1767:395-415. Goubert D, Beckman WF, Verschure PJ, Rots MG. Epigenetic editing: towards realization of the
curable genome concept. Convergent Science Physical Oncology. 2017;3(1).(1)
Stolzenburg S, Goubert D, Rots MG. Rewriting DNA Methylation Signatures at Will: The Curable Genome Within Reach? In: Jurkowska R, Jeltsch A, editors. DNA Methyltransferases - Role and Function Springer International Publishing Switzerland; 2016.
Song J, Cano Rodriguez D, Winkle M, Gjaltema RA, Goubert D, Jurkowski TP, Heijink IH, Rots MG*, Hylkema MN*. Targeted epigenetic editing of SPDEF reduces mucus production in lung epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2016
Rots MG, Goubert D. Het in- en uitschakelen van genen: ‘de maakbare mens’? Diligentia jaarboek 94, natuurkundige voordrachten. 2016;94(1.11):93-102.(2)
Oral Presentations
(For a General Audience) Writing Blog Appearances Media
Invited Speaker TEDx: http://bit.ly/DésiréeTEDx2017 Keynote Speaker Studium Generale Keynote Speaker SMC050: http://bit.ly/DésiréeSMC050 Keynote Speaker PDL
Invited Speaker Pint of Science
Invited Speaker MarketsAndMarkets Epigenetic
conference
Can you control your
genes? Yes you can. With epigenetics!
http://bit.ly/EpigeneticBlog
Knowledge is power:
Would you share your genome data or keep it private? http://bit.ly/GeneticPrivateData Gene-edited Babies - The point of no return? http://bit.ly/GeneBabiesBlog Research Communication - Why it matters! http://bit.ly/ReCommBlog
UMCG newspaper http://bit.ly/KennisInZichtDG Podcast https://biohackingimpact.nl/des iree-goubert/ University Newspaper http://bit.ly/TheFutureIsHereDG CRISPRcon Interview http://bit.ly/CRISPRInterview Breast Cancer patient
Interview
http://bit.ly/BCPatientInterview
OUTREACH ACTIVITIES
EXTRA-CURRICULAR ACTIVITIES
Industry Collaborations
Early Stage Researcher in the international Marie Curie consortium EpiPredict
Entrepreneurship program OPINNO Boards & Councils
Founder of research communication platform (MindMint)
Member of Ph.D. department council
President of Ph.D. organisation GOPHER Volunteer Experiences
AIESEC Miami, account manager
COST conference organisation
AAcckknnoow
wlleeddggeem
meennttss
Here we are., more than four years and a whole lot of experiences and lessons richer. It feels like yesterday that my dad drove me and my 10 shopping bags filled with personal belongings from Zeeland to Groningen. And there I was, a small town Belgian girl with big dreams, ready to start my PhD in the UMCG. Even though it feels so close, a lot has happened during my years in Groningen. I will forever be grateful for my time here, but am also ready to move on to my next chapter in life! But before I do so, I would like to take the time to acknowledge a few people that have been there for me along the road.
First and foremost I would like to extensively thank my supervisor Prof. Dr. Marianne Rots. Wat een rit hebben wij er samen op zitten! Jij was mijn eerste leidinggevende ooit en hebt gedurende de afgelopen jaren mijn groei enorm gestimuleerd. Ik ben enorm dankbaar voor de onwijs interessante discussies over experimentele set-up, de kansen die je mij gegeven hebt om mijn persoonlijke skills te verbeteren en de steun om zowel als individu alsook als wetenschapper grenzen te overschrijden.
Ik wil dit dankwoord met betrekking tot begeleiding graag doortrekken om ook mijn tweede promotor, Dr. Pernette Verschure te bedanken. Als coördinator van het EpiPredict project slaagde je er steeds weer in het team zowel kennis als motivatie te bieden.
I truly enjoyed the annual EpiPredict meetings with all the other supervisors: Prof. Dr. Antal Kiss, Prof. Dr. Stefan Wiemann, Dr. Luca Magnani, Prof. Dr. Hans Westerhoff, Dr. Antoine van Kampen, Dr. Perry Moerland, Dr. Ed Curry, Prof. Dr. Marco Vanoni and Dr. Sven Olek; and fellows: Mihaly Koncz, Emre Sofyali, Stefania Astrologo, Maryam Soleimani Dodaran, Will Beckman, Giacomo Corleone, Simone Borgoni, Rohit Bharat, Daniel Vilar Jorge and last but not least Anchal Nigam. Thank you all for unforgettable times.
To the reading committee: Prof. Dr. S. Wiemann, Prof. Dr. G.A.P. Hospers and Prof. Dr. G. Molema thank you so much to take the time to assess my thesis and provide me with valuable comments.
To my teachers and supervisors of previous years: Hilde Gielen, Dr. Willem Voncken, Dr. Jeremy Chambers. You guys have made a huge impact on my passion for science or epigenetics and I am forever grateful to have received your guidance in the past!
To my paranymphs: Joana Saldida, thank you so much for our beautiful friendship from the past 4 years. You mean a lot to me and I am sure this isn’t the end of our crazy adventures. Never stop believing, you have an amazingly uplifting spirit and I am sure you are gonna do great things in life!
AND, Anita Niemarkt, mijn maatje, raadje en daadje. Ik zou eerlijk gezegd niet weten hoe ik de laatste jaren overleefd zou hebben zonder jou! We stapten samen eind 2015 in de EGE groep van als "newbies", en in de tussentijd heb ik je echt nauw in mijn hart gesloten. Bedankt voor alles! Dat is veel meer dan al die celletjes en administratie, maar zeker ook de goede gesprekken en knuffels.
Pytrick Jellema, jij was de eerste persoon die me in de labs heeft rondgeleid en in de 4-jaar daaropvolgend kon ik ook steeds bij jou terecht voor praktische tips. Hartstikke bedankt voor al jouw inzichten, analyses, labwerk en raad. De laatste maandjes gezellig zwoegen voor het PLOD2 hoofdstuk zal ik niet snel vergeten!
Jelleke Dokter, met jou klikte het vanaf de start. Van leuke feestje met David en Julio tot samen kweken, vele labdagen en zelfs jouw pensioen, het was altijd dolle pret met Jelleke. Bedankt voor de vele leuke dagen en de leerrijke momenten.
My colleagues from Medical Biology: Marja, Peter, Linda, Anita, Wendy, Mathijs, Henk, Josée, Theo, Geert, Johan, Bart, Marcel. Bij elk van jullie ben ik op een gegeven moment wel komen aankloppen met een of andere vraag en jullie hebben me altijd met een glimlach bijgestaan. Het meest genoot ik nog van de koffiemomenten, lab-praatjes en gekke Belgen moppen die jullie allemaal wel gemaakt hebben! Bedankt voor alles, ik ga jullie erg missen. My colleagues from team EGE: David, Julio and Monique, you guys were my first colleagues, teachers and friends in Groningen. I am forever grateful for the educational moments, awesome parties and especially with Monique the many fun board games! Dandan, Archie, Marloes, Fabian, with you guys I spent the most time during the EGE meetings and in the lab. Thank you for the precious times, great insights to my research and good company. Emilie, Mihaly, Emre, you guys visited our lab to learn new techniques and collaborate on research. My hours at work always seemed shorter when you guys were around and I appreciate the knowledge and fun you guys brought along. I learned a lot from our time together. A special thanks goes out to the supervisors: Prof. Dr. Wim van den Berghe, Prof. Dr. Antal Kiss and Prof. Dr. Stefan Wiemann.
A
Xu, Diana, Ahmed, Els, Morten and Kiran I absolutely loved our Gopher times and learned so much from working together with you guys! Besides that we had so much fun in our board year and it really broad me not just soft skills but a lot of happiness as well!
Sandra, Dorieke, Hataitip, Ioana, Andrea, Marah it was a pleasure to set up Groningen’s first PhD research communication platform. It not only helped me develop even more of a passion for science communication, but it also provided me with insides and friendships that will last a life-time. Thank you guys for all the help and support, I think we can all be very proud of what we accomplished with MindMint!
Tejas, Lucile, Paolo, Niek, Anne-Grete, Annique, Hannah, Adele, Filipo, Brandon: Team Groningen! Thank you for the many parties, boardgame nights, dinners, outings and much more. You guys made Groningen fun and I am grateful to have met each and every one of you.
Vincent and Alberto, my bro’s, my party buddies, my protectors. What we shared over the last years will forever hold a very special place in my heart. It meant so much to me to always be able to count on you guys and for the honest and direct way we were always able to talk to each other. Thank you for everything!
Steven, the past three years we shared our lives together and I can honestly say I wouldn’t have gotten here without you! Your support and kindness were indispensable, and I will forever be grateful for these times. I have no doubt that you are going to be extremely successful and lead a life filled with happiness. Wishing you all the best in the future! Sina, Rashana, Roeland, Leonie, Annie en Sven jullie leerden ik vlak voor mijn PhD kennen. Ik genoot echt heel hard van de zeldzame keren dat we elkaar erna nog zagen en voelde me altijd erg gesteund bij jullie, ook door de jaarlijkse kerstkaartjes en slaapplekken zelfs last-minute in Zwitserland!
Isabel Rocker, my person, my little puzzle piece…. het uitvoeren van mijn PhD heeft er helaas ook voor gezorgd dat wij heel erg weinig van elkaar gezien hebben de laatste jaren. Desalniettemin was jouw steun altijd enorm voelbaar en is het fantastisch om de draad weer te kunnen oppikken alsof het gisteren was. Bedankt voor alles wat je doet, de onvoorwaardelijke liefde en raad, de vele late-night calls en je enorme schouders waar ik heel vaak gebruik van mag maken. To the moon and back, to infinity and beyond!
Falke Bogaerts, ook jij speelde de laatste jaren een enorm belangrijke rol in mijn leven, Van de vele telefoontjes tot de aangename bezoekjes en lange zalige wandelingen. Als kers op de
Appendix 5
taart creëerde je mijn prachtige thesis cover die voor altijd op mijn boekje zal pronken. Bedankt voor al jou steun en raad, ontspannende momenten en het vele begrip.
Létitia Poesen, my golden oldie, wat is het fijn om een vriendin te hebben die je zo goed kent en waarbij ik altijd terecht kan voor steun en toeverlaat. Onze gesprekken hebben mij meer dan eens moed ingesproken en een grote glimlach op mijn gezicht gebracht. Jij bent zeker het bewijs dat kwaliteit gaat boven kwantiteit, een dikke (Bilzerse) merci voor alles! Moeke en Vokke, jullie waren vaak veel te ver weg om even een theetje te komen drinken of taart te eten. Gelukkig stonden jullie wel altijd klaar met gouden raad en veel liefde. Ik heb altijd op jullie steun kunnen rekenen, en ik weet dat ik dat ook altijd zal kunnen doen. Dank jullie wel.
Oma en Opa, een dikke merci voor alle steun en begrip die ook jullie de laatste jaren hebben opgebracht. Elkaar weer zien gebeurde niet vaak maar was wel altijd een feest. Ik ben super dankbaar dat ik deze belangrijke tijd in mijn leven met jullie heb kunnen delen.
Mamma, over jou en alles wat je de laatste jaren voor me gedaan hebt zou ik wel een boek kunnen schrijven! Maar alsnog zijn er geen woorden die kunnen beschrijven hoeveel jij en je steun voor me betekenen. Ik ben je enorm dankbaar voor alles wat je voor me doet en door de vingers ziet. Ik ben blij dat ik toevallig de beste Mamma van de hele wereld heb! Pappa, bij jou kon ik altijd terecht voor een veilige en relaxte thuishaven. En dat heeft heel weinig te maken met de locatie! Bedankt voor alle wijsheid die je met me deelt en dat je me altijd met open armen ontvangt, no matter what. De laatste jaren zouden niet dezelfde geweest zijn zonder de vele biertjes, wandelingen met Lucy en late night conversations. Maxime, Milan en Dominique, mijn kleintjes! Jullie brachten me de laatste jaren alleen maar plezier en vreugde. Jullie komen bezoeken en tijd samen doorbrengen was altijd een feest. Ik hou ervan dat jullie me zus noemen, en ik ben enorm trots op mijn broertjes en zusje, my superheroes!! Doe zo verder, jullie zijn goed bezig!
Now for the final words of my thesis I would like to state: I am forever grateful for the people in my life and those I met along the way, and for all the adventures I got to experience over the past 5 years. Never stop believing, and as Walt Disney famously states:
“All of our dreams can come true, as long
