A Drosophila model for Duchenne muscular dystrophy Plas, M.C. van der

A Drosophila model for Duchenne muscular dystrophy

Plas, M.C. van der

Citation

Plas, M. C. van der. (2008, January 24). A Drosophila model for Duchenne muscular

Version: Corrected Publisher’s Version

License:

Downloaded from:

Note: To cite this publication please use the final published version (if applicable).

CHAPTER 8

Summary

Summary

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a severe X-linked disease characterized by progressive muscle wasting. Approximately one third of the patients also present with mild mental retardation. Mutations in the dystrophin gene cause the disease. This gene encodes a number of protein isoforms. DMD is correlated with the absence of the muscle specific long isoform, Dp427. This Dystrophin protein is located along the sarcolemma in skeletal muscle, where it is part of a large protein complex, the Dystrophin Glycoprotein Complex (DGC). The exact functions of the DGC are still largely unclear, however a number of working hypotheses, based on studies from many laboratories, have been raised over the past decades. It is not yet clear, which of the observed defects cause the onset of the disease and which defects are subsequent consequences of the dystrophic process.

The aim of our research is the dissection of the fundamental, and likely evolutionarily conserved, functions of Dystrophin and the DGC in Drosophila with the expectation that our findings will provide insights useful in developing new therapeutic approaches for the treatment of the human disease.

In Chapter 2, it is shown that there are significant similarities in the expression of the different DGC members between invertebrates and vertebrates. Our survey of the mRNA expression patterns of Drosophila Dystrophin and the other DGC members during embryogenesis indicate that they are expressed, as in mammals, predominantly in the muscle and central nervous system. The DGC proteins frequently localize to similar domains.

Therefore, DGC-like complexes likely also exist in Drosophila.

In Chapter 3, electrophysiological analysis shows that the Dystrophin DLP2 isoform plays an important role in the regulation of synaptic vesicle release at the neuromuscular junction.

DLP2 mutants show increased neurotransmitter release upon stimulation of the motoneuron, leading to hyperdepolarization of the muscle cell. This effect can be phenocopied by reducing DLP2 expression levels specifically in the muscle by use of transgenic RNA interference.

Furthermore, this phenotype can be rescued by restoring DLP2 expression in the mutant muscle. These results, which can be summarized as a change in presynaptic function when a postsynaptic protein is lacking, indicate that DLP2 is involved in maintaining synaptic homeostasis via a retrograde signal. Although mammalian Dystrophin and its partially redundant homolog, Utrophin, have long been known to localize postsynaptically at the neuromuscular junction, this is the first description of a role for Dystrophin in maintaining the wild type electrophysiology of the neuromuscular synapse.

In Chapter 4, a role for the Dystrophin Dp186 isoform at central interneuronal synapses is described. We show that Dp186 mutants have similar increases in neurotransmitter release as seen in DLP2 mutants at the neuromuscular junction. This effect can be phenocopied by reducing Dp186 expression levels in the postsynaptic neuron and rescued by restoring Dp186 expression postsynaptically in the mutant background, suggesting that Dp186 is required for appropriate homeostasis at this synapse. Inappropriate increases in central nervous system synapse excitation might underlie the cognitive defects described for both DMD patients and the mdx mouse model.

In Chapter 5, the RNA expression patterns of the recently described Dp117 and Dp205 Dystrophin isoforms are described. We find that decreased expression levels of Dp117, but not DLP2, which is normally expressed in the muscle, result in activity-dependent muscle degeneration in third instar larvae and adult flies. Furthermore, Dp117 expression in the muscle was found to be required for survival of third instar larvae and adults. Reduced Dp117 expression levels cause growth defects during transition from second to third larval instars, possibly due to failure of the animals to continue feeding. In mammals, muscle intergrity is maintained by the Dystrophin Dp427 isoform, which has two actin-binding domains, while in Summary

161

Drosophila, this role is performed by Dp117, which has no apparent actin-binding domain.

These results indicate a conservation of the role of Dystrophin in maintaining muscle integrity, but also suggest that there has been some divergence during evolution as to which isoform plays this role.

In Chapter 6, our preliminary findings on the functions of another Drosophila DGC protein, Dystrobrevin are reported. We describe the embryonic and larval protein expression domains of Dystrobrevin, showing that it is expressed in both the muscle and the CNS, in similar expression domains as Dystrophin. Using transgenic RNAi to reduce Dystrobrevin expression levels, we find that Dystrobrevin, like Dp117, is involved in maintaining muscle integrity. Furthermore, reduced Dystrobrevin expression levels lead to lethality during the pupal stage. We also show, that specifically reducing Dystrobrevin expression levels in the wing results in their increased curvature, which is similar to, but not as severe as, that observed in wings with reduced levels of Dp117. The posterior crossvein, which is partly absent in DLP2 mutants, was not affected when Dystrobrevin levels are reduced in the wing, suggesting that Dystrobrevin does not play a role in crossvein formation.

In conclusion, the work presented in this thesis demonstrates different roles for Drosophila Dystrophin isoforms in the same tissue (eg., DLP2 and Dp117 in the muscle) as well as apparently similar roles for two isoforms in different tissues (DLP2 in the muscle and Dp186 in the postsynaptic neuron). We have uncovered novel roles for two Dystrophin isoforms in regulating synaptic vesicle release via a retrograde signal. These findings may shed some light on the causes of DMD-associated mental retardation. Having established Drosophila models deficit for specific Dystrophin isoforms, we can now further employ the powerful genetics of the fruit fly to uncover novel interacting proteins. These should allow us to further the understanding of the mechanisms leading to muscle degeneration and synaptic dysfunction and may represent potential therapeutic targets useful for the discovery of more effective treatments of Duchenne muscular dystrophy.

Chapter 8

162

Nederlandse samenvatting

Duchenne spierdystrofie is een ernstige genetische aandoening in de mens. Symptomen van deze ziekte zijn progressieve spierafbraak en in één derde van de patiënten een milde mentale retardatie. Mutaties in het dystrofine gen veroorzaken deze ziekte. Dit gen codeert voor meerdere eiwit isoformen. Duchenne Spierdystrofie wordt gekenmerkt door de afwezigheid van een spier specifieke Dystrofine isoform, Dp427. Het Dystrofine eiwit is gelokaliseerd aan het sarcolemma van skeletspieren. Het is onderdeel van een groot eiwit complex, het Dystrofine Glycoproteine Complex (DGC). De exacte functies van dit complex zijn nog grotendeels onduidelijk, hoewel vele verschillende theorieën gedurende de laatste decennia zijn gepostuleerd. Het is niet duidelijk welke defecten ten grondslag liggen aan het ontstaan van de ziekte en welke symptomen het gevolg zijn van het dystrofische proces.

Het doel van ons onderzoek is om de fundamentele, en waarschijnlijk geconserveerde, functies van Dystrofine en het DGC in de fruitvlieg te bestuderen met de verwachting dat onze bevindingen belangrijke inzichten zullen opleveren met betrekking tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische toepassingen voor de behandeling van patiënten met Duchenne Spierdystrofie.

In hoofdstuk 2 wordt aangetoond dat er vele overeenkomsten zijn in de expressie van de verschillende DGC eiwitten tussen invertebraten en vertebraten. Onze bestudering van de mRNA expressie patronen van het Drosophila Dystrofine gen en de anderen DGC leden tijdens de embryogenese, geeft aan dat deze, net als in zoogdieren, voornamelijk tot expressie komen in de spier en het centrale zenuwstelsel. De DGC eiwitten worden vaak gevonden in dezelfde expressie domeinen. Het is daarom aannemelijk dat DGC-achtige complexen ook in Drosophila voorkomen.

In hoofdstuk 3 wordt beschreven, dat de Dystrofine DLP2 isoform een belangrijke rol speelt in de regulatie van de afgifte van synaptische blaasjes bij de neuromusculaire synaps.

DLP2 mutanten laten een toename in neurotransmitter afgifte zien na stimulatie van het motoneuron, welke leidt tot hyperdepolarisatie van de spiercel. Dit effect kan ook gerealiseerd worden door DLP2 expressie specifiek in de spier te reduceren en kan worden hersteld door DLP2 expressie terug te brengen in DLP2 mutante spieren. Deze verandering in presynaptische functie door afwezigheid van een postsynaptisch eiwit toont aan dat DLP2 betrokken is bij het behoud van synaptische homeostase via een retrograad signaal. Hoewel het reeds bekend was dat zoogdier Dystrofine en zijn gedeeltelijke homoloog, Utrofine, gelokaliseerd zijn bij de neuromusculaire synaps, is dit de eerste beschrijving van een rol voor Dystrofine in de regulatie van de synaps.

In hoofdstuk 4 wordt de functie van de Dystrofine Dp186 isoform in centrale interneuronale synapsen in het centrale zenuwstelsel beschreven. Wij tonen aan dat Dp186 mutanten een vergelijkbare toename in neurotransmitter afgifte vertonen als DLP2 mutanten bij de neuronmusculaire synaps. Dit effect van toename in neurotransmitter afgifte kan ook worden veroorzaakt door Dp186 expressie te reduceren in de postsynaptische neuron en kan hersteld worden door Dp186 expressie postsynaptisch terug te brengen in de Dp186 mutant.

Dit resultaat suggereert dat Dp186 betrokken is bij synaptische homeostase van deze synaps.

Een bovenmatige prikkeling van synapsen in het centrale zenuwstelsel kunnen mogelijk ten grondslag liggen aan de cognitieve defecten beschreven voor zowel Duchenne Spierdystrofie patiënten en het mdx muis model.

In hoofdstuk 5 wordt de RNA expressie patronen van de nieuw ontdekte Dp117 en Dp205 Dystrofine isoformen beschreven. Reductie van Dp117, maar niet van DLP2 expressie, dat normaal in de spier aanwezig is, heeft activiteitsafhankelijke spierafbraak tot gevolg in derde instar larven en volwassen vliegen. Bovendien blijkt Dp117 expressie in de spier belangrijk te zijn voor de overleving van derde instar larven en adulten. Het verminderen van de Dp117 Nederlandse samenvatting

163

expressie kan ook groeidefecten veroorzaken tijdens de overgang van tweede naar derde larvale instar, waarschijnlijk doordat de larven niet langer voedsel opnemen. Deze resultaten geven aan dat er sprake is van een conservatie van de functie van Dystrophin in het behouden van spierintegriteit, maar dat er ook specificiteit is ontstaan tijdens de evolutie met betrekking tot welke isoform deze rol vervult.

In hoofdstuk 6 wordt bericht over de functies van een ander Drosophila DGC eiwit, Dystrobrevin. De embryonale en larvale expressie domeinen van het Dystrobrevin eiwit worden beschreven en er wordt aangetoond dat Dystrobrevin zowel in de spier als in het CNS tot expressie komt in een vergelijkbaar patroon als dat van Dystrofine. Met behulp van transgene RNAi waarmee Dystrobrevin expressie gereduceerd wordt in de spier, vinden wij dat Dystrobrevin, net als Dp117, betrokken is bij het behouden van de spier integriteit.

Bovendien leidt het reduceren van Dystrobrevin expressie ook tot letaliteit tijdens het pop stadium. Verder laten wij zien, dat het reduceren van Dystrobrevin expressie specifiek in de vleugel licht gebogen vleugels veroorzaakt, vergelijkbaar met, maar in minder sterke mate als, vleugels waarin Dp117 expressie omlaag is gebracht. De achterste kruisader, die in DLP2 mutanten gedeeltelijk afwezig is, was niet aangetast in vleugels met gereduceerde Dystrobrevin expressie, wat suggereert dat Dystrobrevin niet betrokken is bij de vorming van de kruisader.

Het werk gepresenteerd in dit proefschrift laat een verschillende rol zien voor Drosophila Dystrofine isoformen in hetzelfde weefsel (DLP2 en Dp117 in de spier), als ook schijnbaar dezelfde rol voor twee isoformen in verschillende weefsels (DLP2 in de spier en Dp186 in de postsynaptische neuron). Nieuwe functies zijn gevonden voor twee Dystrofine isoformen in de regulatie van synaptische blaasjes afgifte via een retrograad signaal. Deze bevindingen kunnen mogelijkerwijs aanwijzingen geven over de oorzaken van mentale retardatie geassocieerd met Duchenne Spierdystrofie. Met behulp van Drosophila modellen voor deficiënties van verschillende Dystrofine isoformen, kunnen de genetische technieken beschikbaar voor werk met de fruitvlieg gebruikt worden om nieuwe eiwitten te identificeren die met Dystrofine een interactie aangaan. Dit zou kunnen leiden tot een beter begrip van de mechanismen die leiden tot spierdegeneratie en synaptische dysfunctie en zullen hopelijk bij kunnen dragen aan de ontdekking van effectievere behandelingen van Duchenne Spierdystrofie.

Chapter 8

164

List of publications

Dekkers, L. C., van der Plas, M. C., van Loenen, P. B., den Dunnen, J. T., van Ommen, G. B., Fradkin, L. G., and Noordermeer, J. N. (2004). Embryonic expression patterns of the Drosophila dystrophin-associated glycoprotein complex orthologs. Gene expression patterns 4; 153-159.

van der Plas, M. C.*, Pilgram, G. S. K.*, Plomp, J. J., de Jong, A., Fradkin, L. G., and Noordermeer, J. N. (2006). Dystrophin is required for appropriate retrograde control of neurotransmitter release at the Drosophila neuromuscular junction.

Journal of Neuroscience 26, 333-344.

van der Plas, M. C. (2006). Book review of: Wessen, K. (2005). Simulating human origins and evolution. (Cambridge, Cambridge University Press). PalArch, book reviews. (Date of publishing: 1 July 2006).

van der Plas, M. C. (2007). A new model for the evolution of Homo sapiens from the Wallacean islands. PalArch’s Journal of Vertebrate Palaeontology 1, 1.

van der Plas, M. C.*, Pilgram, G. S. K.*, de Jong, A., Bansraj, M. R. K. S., Fradkin, L. G., and Noordermeer, J. N. (2007). Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature. Mechanisms of Development 124, 617-630.

Fradkin, L. G.*, Baines, R. A.*, van der Plas, M. C., and Noordermeer, J. N. The Dp186 Dystrophin isoform mediates regulation of neurotransmitter release at central synapses in Drosophila. Journal of Neuroscience, in revision.

* Equal contribution

List of publications

165

Curriculum vitae

Mariska van der Plas werd op 11 januari 1980 geboren in Gouda. Na het behalen van het eindexamen VWO aan het Coornhert Gymnasium te Gouda in 1998, begon zij met de studie Biologie aan de Universiteit van Leiden. In de doctoraal fase heeft zij 7 maanden stage gelopen in Naturalis waar zij onder begeleiding van Dr. J. de Vos onderzoek deed aan mesolithische en neolithische resten van Homo sapiens gevonden op het Indonesische eiland Flores. Hierna heeft zij 9 maanden stage gelopen in het laboratorium voor neurale ontwikkelingsbiologie van de afdeling Moleculaire Celbiologie van het LUMC waar zij werkte aan een fruitvlieg model voor Duchenne Spierdystrofie. Na het afstuderen in april 2003 begon zij met haar promotieonderzoek in dezelfde onderzoeksgroep. Het in het proefschrift beschreven onderzoek werd uitgevoerd onder begeleiding van prof. Dr. J.N. Noordermeer en Dr. L.G. Fradkin. De auteur van dit proefschrift zal haar carrière vervolgen als Medical Writer for Kendle International B.V. te Utrecht.

Curriculum vitae

167