Brain and retinal macro- and microvasculature Li, Youhai
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date: 2018
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Li, Y. (2018). Brain and retinal macro- and microvasculature: Response to ischemic and hyperglycemic stress. University of Groningen.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Appendices
Summary
Nederlandse samenvatting
List of publications
Acknowledgments
Appendices
A
SUMMARY
Stroke is a major cause of death and permanent disability worldwide and it markedly affects cerebrovascular function. Till now, studies have mainly focused on the alterations of smooth muscle cell function while alterations of the endothelial lining have not yet been explored. Therefore, we investigated the effects of focal brain ischemia on bradykinin (BK)-induced relaxation, since BK is a critical mediator of tissue inflammation and affects vascular function in an endothelium-dependent manner. Diabetes mellitus (DM) is a progressive metabolic disease characterized by hyperglycemia due to absolute or relative insulin deficiency. Chronic hyperglycemia in DM is strongly associated with microvascular complications, e.g. diabetic retinopathy, which is the leading cause of visual disability and blindness worldwide. The retina is ontogenetically derived from the brain and its microvascular network shares similar anatomical and physiological properties with the brain microvascular network. However, the microvasculature in the brain appears to be not or significantly less susceptible to diabetic insult. Therefore, we aimed to explore and compare the molecular properties of retinal microvasculature and brain microvasculature in healthy and diabetic conditions.
In chapter 2, acute brain ischemia was induced in male Sprague-Dawley rats using the intraluminal filament approach to elicit transient middle cerebral artery (MCA) occlusion. In this study we showed that following acute ischemic stroke BK administration to the MCA induced a concentration-dependent de novo relaxation. This profound relaxation was mediated by the activation of B2 receptors in endothelial cells of the MCA via the release of nitric oxide and endothelium-dependent hyperpolarization of smooth muscle cells.
In chapter 3, we established a novel mechanical method that allows extraction of a considerable amount of retinal microvessels (RMVs) and brain microvessels (BMVs) from both healthy and diabetic rats. Morphometric analysis showed that the purity and structural integrity of isolated brain and retinal microvessels were well preserved. Gene
Appendices
澳
153
澳 澳
A
expression data, presented in chapters 4 and 5, show a significant accumulation of endothelial cell- and pericyte-specific markers in both RMVs and BMVs. Importantly, this new isolation protocol allows direct and individual gene expression comparisons between retinal and brain microvasculature in both healthy and disease conditions without the interference of neural tissue.
Under physiological conditions, we show that angiopoietin 1 (Ang1), which helps to promote vessel stabilization and maturation, is significantly higher expressed in BMVs than in RMVs. The tightness of RMVs and BMVs is directly related to the expression level of junctional genes, which also determines the susceptibility to endogenous or exogenous insults. In chapter 4, we observed that the expression levels of several critical gap junctions, including connexin 37 (Cx37), connexin 40 (Cx40) and connexin 43 (Cx43), were significantly higher in BMVs as compared to RMVs. Therefore, one may conclude that higher expression of Ang1 and connexin genes in BMVs in turn enable BMVs to be more stable than RMVs.
NAD(P)H dehydrogenase 1 (Nqo1) and Glutathione S-transferase P (Gstp1), are important antioxidant enzymes in response to DNA damage by reactive oxygen species (ROS) injury. Stanniocalcin-1 (Stc-1) and Bhlhe40 can suppress ROS production. In chapter 5, we observed that under diabetic conditions Stc-1 and Bhlhe40 genes were significantly upregulated in BMVs, while Nqo1 and Gstp1 genes were significantly downregulated in RMVs, indicating that the oxidative stress in BMVs in diabetes might be counterbalanced by antioxidants compared to RMVs. Glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 (Gpd1) can prevent the conversion of dihydroxyacetone phosphate (DHAP) into Methylglyoxal (MG), which is directly toxic to tissues. Neuron-derived orphan receptor 1 (Nr4a3) and TSC22 domain family protein 3 (Tsc22d3) have anti-apoptotic effects via prevention of NF-κB pathway activation. In chapter 5, we observed that under diabetic conditions Gpd1, Nr4a3 and Tsc22d3 genes were significantly upregulated in BMVs whereas it was not changed in RMVs. These findings suggest that under diabetic conditions the BMVs appear to be protected by several compensatory mechanisms, such as reduction of ROS overproduction,
anti-A
inflammation and reduction of MG. In contrast, these protective systems were not activated or even suppressed in RMVs following diabetic insult.
In this thesis, we describe the influence of ischemic stroke on BK-related responses in cerebral arteries, including upregulation of B2 receptor in endothelial cells and activation of B2 receptor-related signaling pathways. These findings might provide new insights for pharmacological interventions in ischemic stroke. In addition, we systemically characterize the transcriptional profiles of RMVs and BMVs in both healthy and diabetic conditions. In comparison with the RMVs, the BMVs appear to be more stable in healthy conditions and activate several compensatory pathways to diminish the diabetic insult. These findings help to understand why retinal and brain microvasculature show different susceptibilities to diabetes, which may contribute to new approaches in drug development for the treatment of vascular complications in diabetes.
Appendices 澳
155
澳 澳A
NEDERLANDSE SAMENVATTING
Een beroerte (herseninfarct of hersenbloeding) is een veelvoorkomende oorzaak van overlijden of permanente invaliditeit. Ook kan na een beroerte het functioneren van de bloedvaten in de hersenen aangetast zijn. Tot nu toe waren studies naar de gevolgen van een beroerte op de bloedvaten in de hersenen vooral gericht op het functioneren van de spiercellen in deze vaten en veel minder op de endotheelcellen die de binnenbekleding van deze vaten vormen. In dit onderzoek hebben wij de rol van endotheelcellen onderzocht op de bloedvatfunctie na een lokale bloedvatafsluiting in de hersenen. We hebben hierbij met name gekeken naar de rol van de stof bradykinine, die op een endotheelcel-afhankelijke wijze de relaxatie van de bloedvaten in de hersenen beïnvloedt.
Diabetes mellitus (‘suikerziekte’) is een aandoening die gekarakteriseerd wordt door hoge bloedsuikerspiegels (glucose) ten gevolge van een absoluut of relatief insuline tekort. De chronisch hoge bloedsuikerspiegels bij diabetes mellitus zijn sterk geassocieerd met het voorkomen van afwijkingen in de bloedcapillairen. Deze afwijkingen leiden in veel gevallen o.a. tot aantasting van het netvlies wat wereldwijd de belangrijkste oorzaak van slechtziendheid en blindheid is. Het netvlies is ontwikkelingsfysiologisch gezien, voortgekomen uit de hersenen en de bloedcapillairen lijken zowel anatomisch als wat betreft fysiologische eigenschappen sterk op de bloedcapillairen in de hersenen. De bloedcapillairen in de hersenen blijken echter veel minder gevoelig voor hoge bloedsuikerspiegels te zijn dan die in het netvlies. Daarom hebben we de moleculaire verschillen in de bloedcapillairen van de hersenen en het netvlies onderzocht in gezonde en diabetische ratten.
In hoofdstuk 2 beschrijven we het effect van bradykinine op de bloedvatfunctie na een tijdelijke afsluiting van de middelste hersenslagader in ratten, dat leidt tot een herseninfarct en een ernstig zuurstoftekort in de hersenen. Toediening van bradykinine in dit model laat een concentratie-afhankelijke relaxatie zien van de middelste hersenslagader. Deze relaxatie wordt veroorzaakt door binding van bradykine aan de
A
B2 receptoren op endotheelcellen. Dit leidt vervolgens tot vorming van de vaatverwijdende stof stikstofoxide. De vrijgekomen stikstofoxide heeft een relaxerende werking op de bloedvatspiercellen. Dit is de eerste studie die een directe rol van endotheelcellen bij bloedvat relaxatie na een herseninfarct aantoont.
Hoofdstuk 3 beschrijft een nieuwe, mechanische, techniek om bloedcapillairen uit het netvlies en de hersenen van gezonde en diabetische ratten te isoleren. Analyse van deze geïsoleerde bloedcapillairen laten een hoge zuiverheid zien en het behoud van hun morfologische integriteit. Analyse van de genexpressie in deze bloedvaatjes laat bovendien een sterke verrijking zien van merkers voor endotheelcellen en pericyten (bloedvat stabiliserende cellen). Deze nieuwe isolatie methode voor bloedcapillairen maakt een directe vergelijking van de genexpressie in deze intacte bloedvaatjes afkomstig uit gezonde of zieke organen mogelijk zonder verstoring door cellen uit het omliggende neurale weefsel.
In eerste instantie hebben we onderzocht wat de verschillen in genexpressie zijn in bloedcapillairen uit het netvlies en uit de hersenen. In fysiologische omstandigheden is de expressie van het gen angiopoietine 1, dat de stabiliteit en de rijping van bloedvaten bevorderd, significant hoger in bloedcapillairen van de hersenen. De mate van binding tussen de cellen in de bloedcapillairen is direct gekoppeld aan de genexpressie van zogenaamde junction (verbindings) eiwitten en bepaalt mede de gevoeligheid van bloedcapillairen voor endogeen of exogeen veroorzaakte schade. In hoofdstuk 4 laten wij zien dat de genexpressie van verschillende verbindingsgenen zoals connexine 37, connexine 40 en connexine 43, verhoogd is in hersen bloedcapillairen ten opzichte van netvlies bloedcapillairen. Hieruit kan geconcludeerd worden dat, door een hogere expressie van angiopoietine- en connexine genen de bloedcapillairen in de hersenen stabieler zijn dan die in het netvlies.
NAD(P)H dehydrogenase en glutathion S-transferase zijn enzymen met een belangrijke anti-oxidatieve werking, die een rol spelen bij het voorkomen van beschadiging van het DNA door reactieve oxiderende stoffen. Daarnaast zijn er stoffen, met name
Appendices
澳
157
澳 澳
A
stanniocalcin-1 en Bhlhe40, die de cellulaire productie van reactieve oxiderende stoffen remmen. Zoals beschreven in hoofdstuk 5, hebben wij aangetoond dat in de hersen bloedcapillairen van diabetische ratten, de genen voor stanniocalcin-1 en Bhlhe40 significant hoger tot expressie kwamen dan in de hersen bloedcapillairen van gezonde ratten. In de bloedcapillairen van het netvlies daarentegen, komen de anti-oxiderende enzymen NAD(P)H dehydrogenase en glutathion S-transferase juist significant lager tot expressie bij diabetes dan in gezonde ratten. Deze resultaten duiden erop dat in de bloedcapillairen van de hersenen de schadelijke gevolgen van door hoge bloedsuikerspiegels veroorzaakte oxidatie, gecompenseerd wordt door remming van de productie van reactieve oxiderende stoffen. Dit is niet het geval is in de bloedcapillairen van het netvlies. Ook voor verschillende andere genen die een beschermende werking hebben op het functioneren van bloedcapillairen zien we dat de expressie in de hersenen van diabetische ratten verhoogd is in vergelijking tot hun expressie in de bloedcapillairen van het netvlies. Deze bevindingen wijzen erop dat bij diabetes, de bloedcapillairen in de hersenen door verschillende cellulaire mechanismen beter beschermd zijn dan die in het netvlies. In het netvlies worden deze beschermende cellulaire systemen niet verhoogd of zelfs lager tot expressie gebracht als gevolg van diabetes.
In dit proefschrift beschrijven we de gevolgen van de afsluiting van een hersen slagader op bradykinine gemedieerde effecten op het functioneren van de slagaders in de hersenen. De B2 receptor op endotheelcellen speelt een belangrijke rol in dit proces. Deze nieuwe kennis kan ons verder helpen om nieuwe farmacologische behandelingen te ontwikkelen bij een herseninfarct. Ook hebben we systematisch het gen profiel van bloedcapillairen in de hersenen en in het netvlies in kaart gebracht, zowel van gezonde als van diabetische ratten. In vergelijking met de bloedcapillairen in het netvlies lijken de bloedcapillairen in de hersenen stabieler, terwijl bij diabetes de hersen bloedcapillairen compensatie mechanismen kunnen aanzetten die de schadelijke gevolgen van hoge bloedsuikerspiegels helpen te voorkomen. De resultaten uit deze studies helpen ons een beter begrip te verkrijgen voor het verschil in gevoeligheid voor
A
hoge bloedsuikerspiegels van bloedcapillairen in verschillende organen en zal daarmee bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe medicijnen voor de behandeling bloedvat problemen als gevolg van diabetes.
Appendices 澳
159
澳 澳A
PUBLICATIONS
Youhai Li, Natalia Lapina, Nina Weinzierl, Lothar Schilling. Enhancement of bradykinin-induced relaxation by focal brain ischemia in the rat middle cerebral artery: Receptor expression upregulation and activation of multiple pathways. PLoS One. 2018 Jun 18;13(6): e0198553. N. Lapina,
Youhai Li, Natalia Lapina, Nina Weinzierl, Lisbeth Bonde, Ebbe Boedtkjer, Rudolf Schubert, Han Moshage, Paulus Wohlfart, Lothar Schilling. A novel method to isolate retinal and brain microvessels from individual rats: Microscopic and molecular biological characterization and application in hyperglycemic animals. Vascular Pharmacology. 2018 Jul 9. pii: S1537-1891(18)30086-7.
Youhai Li, Faiz A, H. Moshage, De La Torre C, Weinzierl N, Wang J, Schubert R, Schilling L, Kamps JA. Comparative transcriptome analysis of inner blood-retinal barrier and blood-brain barrier in rats. submitted.
Youhai Li, Faiz A, H. Moshage, Schilling L, Kamps JA. Responses of retinal and brain microvasculature to diabetes revealed by global expression profiling. submitted. Youhai Li, Kamps JA, Weinzierl N, H. Moshage, R. Schubert, P. Wohlfart, L. Schilling. Expression of ion channel genes in cerebral macro- and microvasculature and alterations by type 1 diabetes mellitus in rats. In preparation.
A
ACKNOWLEDGEMENTS
Printing of this thesis was financially supported by:
1. Graduate School of Medical Science, University Medical Center Groningen 2. International Research Training School (IRTG) 1874 (“DiaMiCom”)
Studies presented in this thesis were financially supported by:
澳 澳 澳 澳
