Radiopharmaceuticals for translational imaging studies in the field of cancer immunotherapy
van der Veen, Elly
DOI:
10.33612/diss.128579303
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from
it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2020
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
van der Veen, E. (2020). Radiopharmaceuticals for translational imaging studies in the field of cancer
immunotherapy. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.128579303
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Chapter 8
Summary, general discussion
8
SUMMARY
Immune checkpoint inhibitors allow a relevant new treatment strategy for patients with cancer.1 Several immune checkpoint inhibitors, targeting cytotoxic T-lymphocyte-associated
protein 4 (CTLA-4) and programmed cell death protein (PD-1)/programmed death-ligand 1 (PD-L1) have been approved for treatment of patients with various tumors. Many other immunotherapeutics are in development.
Although these treatments have shown to clearly affect outcome in various settings, major challenges are that not every patient responds to immune checkpoint inhibitor therapy and that this treatment can lead to serious side effects. Moreover, the high number of clinical immunotherapy studies requires a huge number of patients and major financial investments. These trials apply single immunotherapeutic agents or combinational strategies with other immunotherapeutics, chemotherapeutic drugs, targeted agents or radiotherapy.2
Therefore, strategies are required to improve patient selection and predict response to these expensive immunotherapeutics. Currently, clinically approved biomarkers are based on PD-L1 measurement by immunohistochemistry (IHC) or microsatellite instability-high and mismatch repair deficient status measurement by IHC and polymerase-chain-reaction-based assays. However, these biomarkers are based on a singly biopsy and do not capture the highly dynamic, complex and heterogeneous immune response.
Positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) with specific radiopharmaceuticals can provide non-invasive whole body information about the biodistribution of immune checkpoint inhibitors in the body, heterogeneity of target expression, effects of immunotherapy on immune cells, and therapy effects on other cells in the tumor microenvironment. Molecular imaging with radiolabeled molecules targeting players in the tumor immune response, might be a tool for patient selection and response prediction in immunotherapy treatment.
The aim of this thesis is to develop new radiopharmaceuticals for molecular imaging in the field of cancer immunotherapy.
Chapter 1 provides a general introduction of the topic and outlines the thesis. In chapter 2
we summarized research to identify the potential of non-invasive whole body molecular imaging for cancer immunotherapy to produce quantitative outputs as such imaging biomarkers might help to improve patient selection for treatment. We searched for both PET and SPECT imaging and divided three main groups for imaging strategies. Firstly, imaging with radiolabeled immune checkpoint targeting molecules. Secondly, imaging of immune cells with ex vivo or in vivo radiolabeled tracers and thirdly, imaging extracellular matrix
components, including adhesion molecules, growth factors and cytokines. These molecular imaging strategies – used alone, in combination or serially – could potentially contribute to patient selection upfront or early during immunotherapy.
As first imaging strategy we developed different radiopharmaceuticals targeting immune checkpoints. In chapter 3 we aimed to evaluate in vivo pharmacokinetics and whole-body distribution of the 89Zr-labeled anti-PD-1 antibody pembrolizumab with PET in humanized
mice. To enable translation to the clinic, clinical grade 89Zr-pembrolizumab was developed. 89Zr-pembrolizumab was produced with a specific activity of 500 MBq/mg and a radiochemical
purity of >95%. PET imaging and biodistribution studies in humanized NOG (huNOG) mice showed high specific uptake in tissues containing many immune cells, including spleen, lymph nodes and bone marrow. Tumor uptake of 89Zr-pembrolizumab was lower than uptake
in lymphoid tissues, but higher than uptake in other organs. High uptake in lymphoid tissues could be reduced by excess unlabeled pembrolizumab. Tracer activity in blood pool was increased by addition of unlabeled pembrolizumab, but tumor uptake was not affected. Autoradiography supported PET findings and immunohistochemical staining on spleen tissue showed PD-1 positive cells, whereas tumor tissue was PD-1 negative. A GMP-compliant production process for 89Zr-pembrolizumab was developed and validated. In conclusion, 89
Zr-pembrolizumab whole-body biodistribution shows PD-1-mediated uptake in spleen, lymph nodes and bone marrow and tumors. To enable further evaluation of its biodistribution in humans, we developed clinical grade 89Zr-pembrolizumab.
The disadvantage of molecular imaging with full monoclonal antibodies is that, given their half-life, to obtain adequate contrast, PET imaging is performed 4-7 days after tracer injection. Molecular imaging with radiolabeled small molecules, with faster pharmacokinetics and shorter half-lives, allows earlier imaging. In chapter 4 we evaluated the usability of the PD-L1 targeting adnectin-based PET tracer 18F-BMS-986192 to determine different PD-L1 expression
levels, as well as therapy-induced changes in tumor PD-L1 expression. Therefore, in vitro binding assays for 18F-BMS-986192 were performed in human tumor cell lines with different
PD-L1 total protein and membrane protein expression levels. Subsequently, PET imaging was executed in immunodeficient mice xenografted with these cell lines. We found that
18F-BMS-986192 binding reflected PD-L1 membrane levels in tumor cell lines, and tumor tracer
uptake in mice was associated with PD-L1 expression measured immunohistochemically. In
vitro interferon gamma (IFNγ) treatment increased PD-L1 expression in the tumor cell lines
and caused up to 12-fold increase in tracer binding. In vivo IFNγ did neither affect PD-L1 tumor expression measured immunohistochemically nor 18F-BMS-986192 tumor uptake. In
vitro treatment with the mitogen-activated protein kinase kinase inhibitor (MEK1/2 inhibitor)
selumetinib downregulated cellular and membrane levels of PD-L1 of tumor cells by 50% as measured by Western blotting and flow cytometry. In mice, selumetinib lowered cellular,
8
but not membrane PD-L1 levels of tumors and consequently no treatment-induced change in 18F-BMS-986192 tumor uptake was observed. In conclusion, 18F-BMS-986192 PET imaging
allows detection of membrane-expressed PD-L1, as soon as 60 minutes after tracer injection. The tracer can discriminate a range of tumor cell PD-L1 membrane levels.
Also, other molecular imaging strategies can be used to target immune cells specifically. Molecular imaging of immune cells has been investigated for decades for diagnosis and therapy evaluation in inflammatory and infectious diseases. With the recent developments in immunotherapeutics, this field has expanded to oncology. Targeting interleukin-2 (IL2) receptors on T-cells using PET with N-(4-18F-fluorobenzoyl)-interleukin-2 (18F-FB-IL2) could be
such a strategy. In chapter 5 we describe the challenging translation of the partly manual labeling of 18F-FB-IL2 for preclinical studies into an automated procedure following GMP,
resulting in a radiopharmaceutical suitable for clinical use. To overcome several challenges, major adaptations in the production process were executed. The final analytical and production methods were validated and documented. All data with regard to the quality and safety of the final drug product were documented in an investigational medicinal product dossier (IMPD). Restrictions in the 18F-FB-IL2 production were imposed by hardware configuration
of the automated synthesis equipment and by use of disposable cassettes. Critical steps in the 18F-FB-IL2 production comprised the purification method, stability of recombinant human
IL2 and the final formulation. With the GMP compliant production method, 18F-FB-IL2 could
reliably be produced with consistent quality, complying to all specifications. This enabled the first use of 18F-FB-IL2 in clinical studies.
Although successfully applied in both preclinical and clinical studies, the production of this
18F-FB-IL2 is complex and time-consuming. Therefore, new strategies for IL2 radiolabeling
have been investigated. In chapter 6 two radiolabeled IL2 variants, namely aluminum
mono-18F-fluoride-(restrained complexing agent)-IL-2 (18F-AlF-RESCA-IL2) and 68
Ga-gallium-(1,4,7-triazacyclononane-4,7-diacetic acid-1-glutaric acid)-IL-2 (68Ga-Ga-NODAGA-IL2) were studied.
Their in vitro and in vivo characteristics were evaluated and compared to 18F-FB-IL2. 68
Ga-Ga-NODAGA-IL2 and 18F-AlF-RESCA-IL2 were produced with a radiochemical purity >95%
and a radiochemical yield of 13.1±4.7% and 2.4±1.6% within 60 and 90 minutes, respectively. Both tracers were stable in serum with >90% remaining intact after 1 h. In vitro, both tracers bound to activated hPBMCs. Ex vivo biodistribution studies in BALB/c mice showed higher uptake of 18F-AlF-RESCA-IL2 than 18F-FB-IL2 in liver, kidney, spleen, bone and bone marrow. 68Ga-Ga-NODAGA-IL2 uptake in liver and kidney was higher than 18F-FB-IL2 uptake. Dynamic
PET imaging revealed uptake in activated hPBMCs in severe-combined immune deficient (SCID) mice. Low uptake was seen after a blocking dose of IL2 or in the Matrigel control group. These observations were confirmed by ex vivo biodistribution. In addition, 18
found that the production of 18F-AlF-RESCA-IL2 and 68Ga-Ga-NODAGA-IL2 was simpler and
faster than 18F-FB-IL2. 18F-AlF-RESCA-IL2 shows good in vitro and in vivo characteristics,
indicating the potential to use it as a PET tracer for imaging of T-cells.
Several clinical imaging studies using immune checkpoint targeting molecules are ongoing. In chapter 7 we describe the results of a first-in-human study to assess the feasibility of imaging with anti-PD-L1 89Zr-atezolizumab, including biodistribution, and test its potential
to predict response to PD-L1 blockade. For this purpose, we developed and produced
89Zr-atezolizumab according to GMP guidelines. 89Zr-atezolizumab was produced with a
specific activity of 37 MBq/mg, a radiochemical yield of >60%, and a radiochemical purity of >95%. Immunoreactivity, as determined with a competitive binding assay with unlabeled atezolizumab was >70%.
We imaged 22 patients across three tumor types before the start of atezolizumab therapy. The PET tracer uptake was high in lymphoid tissues and at sites of inflammation. In tumors, uptake was generally high but heterogeneous, varying within and among lesions, patients, and tumor types. Intriguingly, clinical responses in our patients were better correlated with pretreatment PET tumor uptake than with IHC- or RNA-sequencing-based predictive biomarkers. Autoradiography of two tumor samples showed heterogeneous tracer distribution, and PD-L1 as well as CD8 IHC showed heterogeneous staining, partly corresponding with regions of high tracer uptake. We observed high internalization rates in tumor cell lines, and lower rates in human PBMCs and T-cells. Additionally, 89Zr-atezolizumab
was stable in vivo and remained intact in human serum. This study is encouraging further development of molecular PET imaging for assessment of PD-L1 status and clinical response prediction.
8
GENERAL DISCUSSION
AND FUTURE PERSPECTIVES
Molecular imaging of the tumor immune response
Molecular imaging using specific radiopharmaceuticals is a non-invasive tool which allows to detect different players in the complex tumor immune response. In this thesis (chapter 3 and 7) the potential of radiolabeled anti-PD-L1 and anti-PD-1 monoclonal antibodies for imaging purposes has been described. In a clinical study using 89Zr-labeled atezolizumab a correlation
was found between 89Zr-atezolizumab tumor uptake and tumor response to atezolizumab.
No correlation was seen with PD-L1 tumor measurement immunohistochemically. Several other clinical studies using other immune checkpoint targeting monoclonal antibodies are ongoing, such as 89Zr-pembrolizumab (ClinicalTrials.gov identifier NCT02760225). A small
clinical study using 89Zr-nivolumab (anti-PD-1) showed a correlation between tracer uptake
and tumor response to nivolumab treatment.3 Further studies are now ongoing with this
tracer (EudraCT Number: 2015-004760-11).
Most research has been focused on the PD-L1/PD-1 axis, but new interesting immune checkpoint targets are being investigated, such as OX-40, TIM-3, 4-1BB and LAG-3. With more treatment options, the search for the most optimal combination strategies will be a major challenge in future studies. Not only different immune checkpoint targeting molecules can be combined, but also immune checkpoint inhibiting therapy with other therapies, such as chemotherapy and radiotherapy. By inducing expression of immune checkpoint targets or stimulating immune cell function, some of these combinations have already shown to lead to even better antitumor responses.4-6 However, the exact
mechanisms behind this are still not unraveled and it is not yet clear when to select which therapy. Molecular imaging could be a tool to learn early during treatment about these effects of combination strategies.
Detecting immune cells by molecular imaging is another strategy to learn more about the tumor immune response. This may also be important for prediction of immune-related adverse effects. In this thesis (chapter 3, 5 and 6) the development of radiopharmaceuticals for imaging of T-cells has been described, either by targeting PD-1 or by targeting the IL2 receptor. Strategies to target specific T-cells are being evaluated, such as molecular imaging with anti-CD8 targeting molecules (ClinicalTrials.gov identifiers NCT02478099 and NCT03802123). Recent research indicates important roles for other immune cells such as natural killer cells, dendritic cells and macrophages. Another important new group of drugs in this context is the group of bispecific antibodies. A subgroup of the bispecifics is designed to bind T-cells and a specific target on tumor cells. These drugs are currently evaluated in the clinic for solid tumor and evaluated for biodistribution in clinical molecular imaging studies.
A clinical study using the 89Zr radiolabeled bispecific T-cell engager AMG 211, directed
against carcinoembryonic antigen (CEA) on tumor cells and cluster of differentiation 3 (CD3) on T-cells, showed clear uptake in CD3-rich tissues as well as tumor uptake.7 However,
the difference of the two arms in binding affinity for their targets, is likely affecting in vivo biodistribution.
Not only the different immune cells, but also components in the tumor microenvironment can be evaluated using molecular imaging. Molecular imaging strategies to target these different components might lead to a better understanding of the complex and highly dynamic immune response, further supporting immunotherapy development. In the future multiple imaging strategies will be combined. For instance, imaging of immune cells with proteins radiolabeled with short-lived isotopes, such as the IL2 tracers targeting T-cells can be combined with imaging of both tumor and immune cells with radiolabeled immune checkpoint targeting monoclonal antibodies, such as PD-L1 targeting monoclonal antibodies.
Development of new radiopharmaceuticals
Finding suitable radiopharmaceuticals is challenging in the field of molecular imaging of immunotherapy. As described in chapter 2, the most optimal imaging strategy depends on multiple factors: what cells to target, the properties of these targets and the tumor type and location. A wide choice of different molecules and targets are available, combined with a variety of radioisotopes. The radiolabeling of these different molecules requires extensive knowledge on radiochemistry as well as the biological characteristics and in vivo behavior of the imaging agents. For instance, the residualizing properties of the radioisotope or internalization properties of the target can influence the PET signal. For immune checkpoint targets and targets on immune cells, it is not yet completely known to what extent these targets internalize and reappear on the cell surface. Combining future imaging studies with extensive analysis of the target properties is needed to fully understand and interpret PET imaging data.
Another challenge in the development of radiopharmaceuticals for immunotherapy comprises the preclinical evaluation. For radiotracers targeting components in the tumor immune response, an intact immune system is preferred to better predict distribution and kinetics in humans. As described in chapter 3, mice with a fully humanized immune system are suitable for these preclinical studies. However, also humanized mouse models have some important disadvantages, such as high Fc-gamma receptor-mediated spleen uptake. For designing future imaging studies, it is therefore necessary to select carefully what animal model is most suitable, as well as which radiopharmaceutical, radiotracer doses and imaging time-points can best be applied.
8
The most suitable radiopharmaceutical depends on the research question and information needed. From previous studies much experience is gained with the radiolabeling of monoclonal antibodies. Imaging with monoclonal antibodies gives precise information on biodistribution of the drug. This requires, given the long biological half-life of monoclonal antibodies, to image several days after tracer injection. When the only interest is the expression of the target such as described in chapter 4, imaging can be performed earlier using radiolabeled smaller molecules. With shorter biological half-lives, these imaging agents are suitable to be radiolabeled with short-lived isotopes, such as fluor-18 or gallium-68. Head-to-head comparison in the clinic of the two different types of tracers would provide a better insight of the performance of such tracers in humans. Molecular imaging with full monoclonal antibodies could potentially give a better insight in drug biodistribution and pharmacokinetics, whereas small molecule-based tracers can be used to detect target expression levels fast. The latter provides the possibility for a multiple imaging strategy, with a combination of injection of multiple radiotracers on different days.
Molecular imaging for patient selection and response prediction
The search for biomarkers in the field of immunotherapy is still ongoing. Molecular imaging of immune checkpoint proteins, such as PD-L1, may be a potential method to detect biomarkers for response prediction in immunotherapy. To learn more about the utility of molecular imaging in relation to patient selection and response prediction, future clinical imaging studies on new targets should compare imaging results with the current single biopsy-based methods, such as IHC and DNA/RNA sequencing methods, as described in chapter 7. Thus, the potential new biomarker could be compared with other potential biomarkers such as IHC and analysis of mutational tumor load. Additionally, PET imaging should be compared with other molecular techniques that are able to detect whole body target status, such as circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Other imaging modalities such as optical imaging using fluorescent-labeled immune checkpoint targeting or immune cell targeting molecules could be beneficial. Although optical imaging methods have a much smaller field of view, fluorescent tracers have the advantage of not being radioactive. This makes consecutive imaging with another fluorescent tracer possible. This approach can provide more information on target expression and heterogeneity at a microscopic level. Additionally, fluorescent imaging can be followed by PET imaging with a radiopharmaceutical, on the same day.
In conclusion, in this thesis we describe the development of new radiopharmaceuticals for molecular imaging in the field of cancer immunotherapy. We show the challenging development and preclinical evaluation of radiolabeled immune checkpoint protein antibodies and small molecules. Furthermore, we describe their potential for immune cell imaging in preclinical studies. Additionally, we showed the feasibility of molecular imaging with a PD-L1 antibody in a small size clinical imaging trial. In the future, this approach might lead to better patient selection to improve therapy outcomes for cancer immunotherapy.
8
REFERENCES
1. Couzin-Frankel J. Breakthrough of the year 2013. Cancer immunotherapy. Science. 2013;342:1432-1433.
2. Tang J, Shalabi A, Hubbard-Lucey V. Comprehensive analysis of the clinical immuno-oncology landscape. Ann Oncol. 2018;29:84-91.
3. Niemeijer A, Leung D, Huisman M, Bahce I, Hoekstra O, van Dongen G, et al. Whole body PD-1 and PD-L1 positron emission tomography in patients with non-small-cell lung cancer. Nat Commun. 2018;9:4664.
4. Langer CJ, Gadgeel SM, Borghaei H, Papadimitrakopoulou VA, Patnaik A, Powell SF, et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. Lancet
Oncol. 2016;17:1497-1508.
5. Gandhi L, Rodríguez-Abreu D, Gadgeel S, Esteban E, Felip E, De Angelis F, et al. Pembrolizumab plus chemotherapy in metastatic non–small-cell lung cancer. N Engl J Med. 2018;378:2078-2092. 6. Paz-Ares L, Luft A, Vicente D, Tafreshi A, Gümüş M, Mazières J, et al. Pembrolizumab plus
chemotherapy for squamous non–small-cell lung cancer. N Engl J Med. 2018;379:2040-2051. 7. Moek KL, Waaijer SJH, Kok IC, Suurs FV, Brouwers AH, Menke-van der Houven van Oordt CW, et
al. 89Zr-labeled bispecific T-cell Engager AMG 211 PET shows AMG 211 accumulation in CD3-rich
Chapter 9
Nederlandse samenvatting
9
NEDERLANDSE SAMENVATTING
(DUTCH SUMMARY)
Immuuntherapie is een belangrijke nieuwe behandelstrategie voor patiënten met kanker. Met name de immuun checkpoint remmers zijn een belangrijke groep binnen de immuuntherapeutische middelen. Tumorcellen kunnen het immuunsysteem remmen door middel van het uitzetten van belangrijke schakelpunten (checkpoints), waardoor zij niet worden aangevallen door cellen van het immuunsysteem. Behandeling met immuun checkpoint remmers leidt ertoe dat immuuncellen weer worden geactiveerd en de tumorcellen kunnen aanvallen en opruimen. Een aantal van deze immuun checkpoint remmers, gericht tegen de eiwitten cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4) en programmed cell death protein (PD-1)/programmed death-ligand 1 (PD-L1), zijn goedgekeurd voor behandeling van patiënten met verschillende tumortypen. Tevens zijn vele andere vormen van immuuntherapie in ontwikkeling.
Hoewel behandeling met immuun checkpoint remmers bij een deel van de patiënten een betere overleving geeft, blijkt niet elke patiënt op deze therapie te reageren. Bovendien kan behandeling met deze middelen leiden tot ernstige bijwerkingen. Het groeiend aantal klinische immuuntherapiestudies vereist een groot aantal patiënten om ze uit te kunnen voeren en brengt hoge kosten met zich mee. Deze klinische studies onderzoeken niet alleen de toepassing van immuun checkpoint remmers als monotherapie, maar ook in combinatie met andere vormen van immuuntherapie, chemotherapie, doelgerichte middelen en radiotherapie. Daarom zou het helpen als het mogelijk zou zijn om beter te voorspellen welke patiënten baat zullen hebben bij immuuntherapie. Voor deze voorspellingen wordt op dit moment gebruik gemaakt van technieken die gebaseerd zijn op analyse van doeleiwitexpressie op tumorweefsel (immuunhistochemische kleuring), microsatelliet instabiliteitsanalyse (MSI-analyse) en het vaststellen van DNA mismatch repair (MMR) deficiëntie. Het nadeel hiervan is dat de uitkomst gebaseerd is op één tumorbiopt en de dynamische, complexe en heterogene immuunreactie tegen tumoren niet wordt meegenomen.
Hierbij kan moleculaire beeldvorming, zoals positron emission tomography (PET) en single-photon emission computed tomography (SPECT) met specifiek radioactief gelabelde moleculen (radiofarmaca) helpen. Het kan niet-invasief informatie geven over distributie van immuun checkpoint remmers in het gehele lichaam, de heterogeniteit van doeleiwitexpressie, de effecten van immuuntherapie op immuuncellen en de effecten van immuuntherapie op andere dan tumorcellen in de tumor. Moleculaire beeldvorming met deze radiofarmaca, ook wel tracers genoemd, gericht tegen belangrijke componenten van de tumor immuunrespons is een mogelijke strategie om patiënten te selecteren voor behandeling met immuuntherapie en de individuele respons op immuuntherapie te kunnen voorspellen.
Het doel van dit proefschrift is het ontwikkelen van nieuwe radiofarmaca voor moleculaire beeldvorming voor toepassing bij kanker immuuntherapie.
In hoofdstuk 1 wordt een korte inleiding gegeven en worden de verschillende hoofdstukken geïntroduceerd. Hoofdstuk 2 omvat een literatuuronderzoek, waarbij een overzicht wordt gegeven van hoe non-invasieve moleculaire beeldvorming kan worden toegepast bij kanker immuuntherapie om beter patiënten te kunnen selecteren. We deelden de huidige literatuur op het gebied van PET en SPECT beeldvorming op in drie groepen van mogelijke strategieën voor toepassing bij immuuntherapie. De eerste strategie is beeldvorming met behulp van radioactief gelabelde moleculen gericht tegen de immuun checkpoint eiwitten. De tweede strategie is beeldvorming van immuuncellen zelf. Immuuncellen kunnen buiten het lichaam (ex vivo) radioactief worden gelabeld en vervolgens weer worden geïnjecteerd in de patiënt. Daarnaast kunnen ook direct radioactief gelabelde moleculen worden geïnjecteerd die zich in het lichaam (in vivo) binden aan immuuncellen. Als derde strategie beschrijven we hoe met moleculaire beeldvorming componenten in de omgeving rondom de tumor, de extracellulaire matrix, kunnen worden afgebeeld, zoals celadhesie moleculen, groeifactoren en cytokinen. Deze drie moleculaire beeldvormingsstrategieën zouden - als afzonderlijke strategie of gecombineerd met andere strategie(ën) - een bijdrage kunnen leveren aan patiëntselectie vooraf en vroegtijdig tijdens de behandeling met immuuntherapie.
Als eerste strategie voor moleculaire beeldvorming ontwikkelden wij verschillende radiofarmaca gericht tegen immuun checkpoint eiwitten. Het doel van hoofdstuk 3 was het evalueren van de verdeling en distributie (in vivo farmacokinetiek) in het lichaam van het met zirconium-89 (89Zr) gelabelde monoklonale antilichaam gericht tegen PD-1
pembrolizumab met behulp van PET beeldvorming in gehumaniseerde muizen. Om toepassing van 89Zr-pembrolizumab in klinische studies mogelijk te maken, ontwikkelden
we 89Zr-pembrolizumab wat voldoet aan de gestelde eisen voor klinisch gebruik, namelijk
Good Manufacturing Practices (GMP) richtlijnen. 89Zr-pembrolizumab kon worden
geproduceerd met een specifieke activiteit van 500 MBq/mg en een radiochemische zuiverheid van >95%. In vivo PET beeldvorming en ex vivo biodistributie studies in gehumaniseerde muizen lieten een hoge specifieke opname zien in weefsels met veel immuuncellen, zoals de milt, lymfeklieren en beenmerg. 89Zr-pembrolizumab tumor
opname was lager dan in de lymfoïde weefsels, maar hoger dan in andere weefsels. De hoge opname in lymfoïde weefsels kon worden geblokkeerd door het toedienen van een overmaat niet-gelabeld pembrolizumab. De hoeveelheid tracer in het bloed nam toe door het toedienen van een overmaat niet-gelabeld pembrolizumab, maar de tumor opname bleef gelijk. Autoradiografie bevestigde PET resultaten en immuunhistochemische analyse liet PD-1 positieve cellen in de milt zien, terwijl het tumor weefsel PD-1 negatief
9
was. 89Zr-pembrolizumab kon worden geproduceerd en gevalideerd volgens de
GMP-richtlijnen. Concluderend, 89Zr-pembrolizumab biodistributie wordt beïnvloed door
PD-1-gemedieerde opname in de milt, lymfeklieren en beenmerg. GMP-productie van deze tracer maakt toepassing in klinische studies mogelijk.
Het nadeel van beeldvormingsstudies met monoklonale antilichamen is dat door hun lange halfwaardetijd, adequaat contrast voor beeldvorming pas 4-7 dagen na tracer injectie kan worden verkregen. Moleculaire beeldvorming met radioactief gelabelde kleine moleculen kan, door snellere farmacokinetiek en kortere halfwaardetijden, eerder worden uitgevoerd. In hoofdstuk 4 onderzochten we of het tegen PD-L1 gerichte molecuul
18F-BMS-986192 gebruikt kan worden om verschillende expressieniveaus van het doeleiwit
PD-L1 te kunnen onderscheiden. Tevens onderzochten we of therapie-geïnduceerde veranderingen in eiwitexpressie van PD-L1 in de tumor konden worden gedetecteerd met behulp van 18F-BMS-986192. Daarom werden in vitro bindingsexperimenten uitgevoerd
met 18F-BMS-986192 in humane tumorcellijnen met verschillende expressieniveaus van
het totaal intacte en membraangebonden PD-L1 eiwit. Vervolgens werden PET scans uitgevoerd in immuundeficiëntie muizen. Bij deze muizen werden tumorcellen subcutaan onder de schouder geïnjecteerd (tumor xenograft). Wij vonden dat in vitro 18F-BMS-986192
binding overeenkwam met de mate van PD-L1 expressie in de tumorcellijnen en dat de traceropname in de tumor in muizen correleerde met PD-L1 expressie immuunhistochemisch gemeten. Behandeling met interferon-gamma (IFNγ) leidde in vitro tot een 12 keer hogere binding van de tracer, overeenkomend met de PD-L1 expressie in deze tumorcellijnen. In
vivo behandeling met IFNγ daarentegen, beïnvloedde zowel de PD-L1 tumorexpressie,
immuunhistochemisch gemeten, als de 18F-BMS-986192 tumoropname niet. Behandeling
met de mitogen-activated protein kinase kinase (MEK1/2) remmer selumetinib verlaagde PD-L1 eiwitexpressieniveaus zowel binnen de cel als op de membraan met 50%. In muizen verlaagde selumetinib de cellulaire PD-L1 expressie, maar niet de membraanexpressie. Hiermee overeenkomend werden geen verschillen in opname van 18F-BMS-986192 in
de tumor gevonden. Concluderend, 18F-BMS-986192 tracer kan worden gebruikt om
membraanexpressie van PD-L1 te detecteren, al 60 minuten na tracer injectie. De tracer kan verschillende expressieniveaus van PD-L1 onderscheiden.
Ook andere moleculaire beeldvormingstechnieken kunnen worden gebruikt om immuuncellen specifiek te detecteren. Moleculaire beeldvorming van immuuncellen wordt al tientallen jaren onderzocht voor diagnose en therapie evaluatie bij inflammatoire- en infectieziekten. Met de recente ontwikkelingen op het gebied van kanker immuuntherapie heeft dit zich uitgebreid tot de oncologie. Immuuncellen kunnen onder andere gedetecteerd worden met PET beeldvorming en de N-(4-18F-fluorobenzoyl)-interleukin-2 (18F-FB-IL2) tracer,
uitdagende conversie van de deels handmatige synthese van 18F-FB-IL2 voor preklinische
studies naar een volledig geautomatiseerde procedure, welke voldoet aan GMP-richtlijnen voor klinische toepassing. Belangrijke aanpassingen in het productieproces zijn doorgevoerd. De uiteindelijke analyse- en productiemethoden zijn gevalideerd en gedocumenteerd. Alle data met betrekking tot de kwaliteit en veiligheid van het uiteindelijke radiofarmacon werden gedocumenteerd in een productdossier, het investigational medicinal product dossier (IMPD). Beperkingen in de 18F-FB-IL2 productie werden opgelegd door hardware configuratie van de
geautomatiseerde syntheseapparatuur en door het gebruik van wegwerpcassettes. Kritieke stappen in de 18F-FB-IL2 productie omvatten onder andere de zuiveringsmethode, stabiliteit
van het recombinante humane IL2 en de eindformulering. Met de productiemethode die voldoet aan de GMP-richtlijnen, kon 18F-FB-IL2 betrouwbaar worden geproduceerd met
consistente kwaliteit en werd voldaan aan alle gestelde specificaties. Dit maakte het mogelijk om voor het eerst 18F-FB-IL2 toe te passen in klinische studies.
Hoewel 18F-FB-IL2 succesvol wordt toegepast in zowel preklinische als klinische studies, is de
productie complex en tijdrovend. Om die reden werden andere strategieën om het eiwit IL2 radioactief te labelen onderzocht. In hoofdstuk 6 ontwikkelden we twee nieuwe radioactief gelabelde IL2 varianten, namelijk aluminum mono-18F-fluoride-(restrained complexing
agent)-IL2 (18F-AlF-RESCA-IL2) en 68Ga-gallium-(1,4,7-triazacyclononane-4,7-diacetic acid-1-glutaric
acid)-IL2 (68Ga-Ga-NODAGA-IL2). De in vitro en in vivo eigenschappen van deze tracers werden
geëvalueerd en vergeleken met 18F-FB-IL2. 68Ga-Ga-NODAGA-IL2 en 18F-AlF-RESCA-IL2
werden geproduceerd met een radiochemische zuiverhuid van >95% en een radiochemische opbrengst van respectievelijk 13.1±4.7% en 2.4±1.6% binnen 60 en 90 minuten. Beide tracers waren stabiel in serum, waarbij >90% intact bleef na 1 uur. In vitro lieten beide tracer specifieke binding aan geactiveerde humane perifere bloed mononucleaire cellen (hPBMCs) zien. Ex
vivo biodistributie studies in immuuncompetente muizen lieten een hogere opname zien van
18F-AlF-RESCA-IL2 in lever, nieren, milt, botten en beenmerg vergeleken met 18F-FB-IL2. 68
Ga-Ga-NODOGA-IL2 opname in lever en nieren was hoger dan 18F-FB-IL2. PET beeldvorming werd
uitgevoerd in immuundeficiënte muizen, met een xenograft van hPBMCs in Matrigel. Met alle tracers was het mogelijk de hPBMCs te visualiseren. Dit werd niet gezien na toevoegen van een overmaat niet-radioactief IL2 of in de controlegroep muizen, met een xenograft van alleen Matrigel, zonder hPBMCs. Ex vivo biodistributie bevestigde hogere opname van alle radioactief gelabelde IL2 varianten in de geactiveerde hPBMCs dan in de Matrigel van de controle muizen. Door toevoegen van een overmaat niet-radioactief IL2 nam de opname in de hPBMCs af. Tevens leverde PET beeldvorming met 18F-AlF-RESCA-IL2 beelden van de lymfeklieren met
hoog contrast. Concluderend, de productie van 18F-AlF-RESCA-IL2 en 68Ga-Ga-NODAGA-IL2
is simpeler en gemakkelijker dan de productie van 18F-FB-IL2. 18F-AlF-RESCA-IL2 laat goede in
vitro en in vivo eigenschappen zien en is een geschikte kandidaat voor beeldvormingsstudies
9
Verscheidene klinische beeldvormingsstudies met moleculen gericht tegen de immuun checkpoint eiwitten zijn gaande. In hoofdstuk 7 beschrijven wij de resultaten die zijn verkregen met het tegen PD-L1 gerichte 89Zr-atezolizumab, een tracer die voor het eerst
in mensen werd gebruikt. We onderzochten de toepassing van beeldvorming met 89
Zr-atezolizumab, onder andere door de distributie in het lichaam te evalueren. Tevens onderzochten we de mogelijkheid van deze techniek om respons op anti-PD-L1 therapie te kunnen voorspellen. Voor deze studie ontwikkelden en produceerden wij 89Zr-atezolizumab
volgens GMP-richtlijnen. 89Zr-atezolizumab werd geproduceerd met een specifieke activiteit
van 37 MBq/mg, een radiochemische opbrengst van >60% en een radiochemische zuiverheid van >95%. Immunoreactiviteit, bepaald met een competitieve bindingsassay met niet-gelabeld atezolizumab, was hoger dan >70%.
In deze studie werden PET scans uitgevoerd bij 22 patiënten met drie verschillende tumortypes (blaaskanker, longkanker en borstkanker) voor start van de behandeling met atezolizumab. Hierbij werd de tumoropname van 89Zr-atezolizumab gerelateerd aan analyses op tumorweefsel
(immuunhistochemische kleuringen), analyses van de ribonucleïnezuur (RNA) van de tumor en aan de behandeluitkomsten. Allereerst vonden we een hoge opname van 89Zr-atezolizumab in
lymfoïde weefsels en op plaatsen met lokale ontstekingen. Over het algemeen was de opname in de tumoren hoog, maar ook heterogeen, variërend binnen tumoren zelf, maar ook tussen verschillende tumoren, patiënten en tumortypes. Interessant is dat de klinische respons op de behandeling in deze patiëntengroep beter correleerde met de tumor opname van 89
Zr-atezolizumab dan met de huidige standaard PD-L1 expressie bepaling met immuunhistochemie en met het tumor RNA. Autoradiografie van twee tumorbiopten liet een heterogene tracer distributie zien. Zowel PD-L1 als CD8 immuunhistochemie lieten een heterogene kleuring zien, deels overeenkomend met plekken van hoge 89Zr-atezolizumab opname. We vonden
een hoge mate van internalisatie van 89Zr-atezolizumab in tumorcellijnen en in lagere mate
in hPBMCs en humane T-cellen. Daarnaast was 89Zr-atezolizumab in vivo stabiel en bleef
het intact in humaan serum. Deze studie bemoedigt verdere ontwikkeling van moleculaire beeldvorming voor beoordeling van PD-L1 status en klinische respons voorspellingen. Samenvattend, in dit proefschrift beschrijven we de ontwikkeling van nieuwe radiofarmaca voor moleculaire beeldvorming voor de toepassing bij kankerimmuuntherapie. We laten de uitdagende ontwikkeling en preklinische evaluatie zien van radioactief gelabelde monoklonale antilichamen en kleine moleculen gericht tegen immuun checkpoints. Ook beschrijven we de potentie van beeldvorming van immuuncellen in preklinische studies. Daarnaast laten we zien hoe moleculaire beeldvorming met een tegen PD-L1-gericht antilichaam kan wordt toegepast in een kleine beeldvormingsstudie. In de toekomst zou deze benadering mogelijk kunnen leiden tot een betere patiëntselectie om therapie uitkomsten van kankerimmuuntherapie te verbeteren.
Appendices
About the author
List of publications
Dankwoord
ABOUT THE AUTHOR
Elly Lieke van der Veen was born on January 27th, 1989 in Heerenveen, the Netherlands. She completed her high school (gymnasium) at the Bornego College Heerenveen in 2007. That same year she moved to Groningen to start studying Pharmacy at the University of Groningen. Elly received her bachelor’s degree in 2010.
As part of her master’s research project, Elly moved in the spring of 2012 to New York City for 3 months. She participated in a research project on molecular imaging in cardiovascular diseases at the Cardiovascular Institute, Icahn School of Medicine, Mount Sinai Medical Center, located in Manhattan. She was involved in the development of a tracer for myocardial fibrosis imaging. This project was supervised by dr. H.H. Boersma, dr. H.J. de Haas, prof. dr. R.H.J.A. Slart, prof. dr. D.R.A. Uges and prof. dr. J.G.W. Kosterink. Elly earned her master’s degree in Pharmacy (PharmD) in July 2013.
During her studies, Elly gained interest in the field of hospital pharmacy. With a wish to combine radiopharmacy with oncology, she started in August 2013 her PhD project on ‘molecular imaging in immunotherapy’. She was supervised by prof. dr. E.G.E. de Vries and dr. M.N. Lub-de Hooge at the Department of Medical Oncology, University Medical Center Groningen. During her PhD project Elly was involved in multiple translational research projects. She participated in the development of several radiopharmaceuticals and gained experience in radiolabeling with different radioisotopes. Elly participated also in the clinical studies and in the writing of several investigational medicinal product dossiers. Furthermore, she supervised pharmacy students and presented her research at (inter)national meetings. In May 2018, Elly combined her research with working as a pharmacist at the Department of Clinical Pharmacy and Pharmacology, University Medical Center Groningen. In August 2019, she started the training to become a hospital pharmacist at this department.
Elly enjoys playing music and plays cornet for more than 23 years. Furthermore, she likes visiting concerts and theatre, traveling, sports, reading and spending time with friends and family.
P
LIST OF PUBLICATIONS
This thesis
• van der Veen EL, Bensch F, Glaudemans AWJM, Lub-de Hooge MN, de Vries EGE. Molecular imaging to enlighten cancer immunotherapies and underlying involved processes. Cancer Treat Rev. 2018;70:232-244.
• Bensch F, van der Veen EL, Lub-de Hooge MN, Jorritsma-Smit A, Boellaard R, Kok IC, et al. 89Zr-atezolizumab imaging as a non-invasive approach to assess clinical response
to PD-L1 blockade in cancer. Nat Med. 2018;24:1852-1858.
• van der Veen EL, Antunes IF, Maarsingh P, Hessels-Scheper J, Zijlma R, Boersma HH, et al. Clinical-grade N-(4-[18F]fluorobenzoyl)-interleukin-2 for PET imaging of activated
T-cells in humans. EJNMMI Radiopharm Chem. 2019;4:15.
• van der Veen EL, Suurs FV, Cleeren F, Bormans G, Elsinga PH, Hospers GAP, et al. Development and evaluation of interleukin-2 derived radiotracers for PET imaging of T-cells in mice. J Nucl Med. 2020; Epub ahead of print.
• Stutvoet TS, van der Veen EL, Kol KJD, Antunes IF, de Vries EFJ, Hospers GAP, et al. Molecular imaging of PD-L1 expression and dynamics with the adnectin-based PET tracer 18F-BMS-986192. J Nucl Med. 2020; Epub ahead of print.
Other manuscripts
• van der Veen EL, de Haas HJ, Petrov AD, Reutelingsperger CPM, Kosterink JGW, Zeebregts CJ, et al. The story of myocardial infarction: before, when it strikes, and afterwards: a tale in images. In: SPECT: Technology, Procedures and Applications. Nova
Scientific Publishers. 2013;59-187.
• ter Horst PG, Larmené-Beld KH, Bosman J, van der Veen EL, Wieringa A, Smit JP. Concentrations of venlafaxine and its main metabolite O-desmethylvenlafaxine during pregnancy. J Clin Pharm Ther. 2014;39:541-544.
• Larmené-Beld KHM, ter Horst PGJ, Bosman J, van der Veen EL, Smit JP, Dijkstra J, et al. Concentraties van venlafaxine en O-desmethylvenlafaxine gedurende de zwangerschap. PW Wetenschappelijk Platform. Mei 16, 2014.
DANKWOORD (ACKNOWLEDGMENTS)
Het is klaar, mijn proefschrift! Nu rest mij nog het laatste deel te schrijven. De epiloog van dit proefschrift, het dankwoord. Mijn promotietraject is een leerzame periode geweest. Zoals een muziekstuk ging het soms in majeur, met mooie successen, maar soms ook in mineur, met hier en daar een tegenslag. Zonder de bijdrage, hulp en steun van een heleboel mensen was dit proefschrift dan ook niet tot stand gekomen. Graag wil ik deze mensen persoonlijk bedanken. Allereerst wil ik mijn promotores prof. dr. E.G.E. de Vries en dr. M.N. Lub-de Hooge bedanken. Liesbeth, via Marjolijn kwam ik bij jou terecht voor een kennismakingsgesprek. Het onderzoek in jouw groep sprak mij direct aan. Door de jaren heen heb ik veel kunnen leren. Tijdens onze overleggen zorgde je ervoor dat ik nét een stapje verder nadacht over gevonden resultaten. Jouw commentaar op stukken was altijd razendsnel, treffend en kritisch. Dit maakte de stukken gauw mooier en beter. Veel respect heb ik voor jouw toewijding en enthousiasme voor het onderzoek. Dit is zeer inspirerend geweest en ik ben dankbaar voor de kansen die ik heb gekregen.
Marjolijn, door mijn masteronderzoek was ik enthousiast geworden voor de radiofarmacie en ik wilde dit graag combineren met de oncologie. Jouw onderzoekslijn sloot daar goed bij aan. Onze overleggen op vrijdagochtend waren altijd prettig. Wij hadden het dan niet alleen over de onderzoeksprojecten, ook vertelde jij regelmatig wat er speelde in de ziekenhuisfarmacie. Ik ben dankbaar voor de kansen die ik heb gekregen om me in de ziekenhuisfarmacie verder te ontwikkelen. Jij bent een goed voorbeeld van een ziekenhuisapotheker die onderzoek en kliniek met elkaar verbindt. Ik ben dan ook blij dat ik jou de komende jaren mijn opleider mag noemen.
Graag wil ik de leden van de beoordelingscommissie prof. dr. N.H. Hendrikse, prof dr. E. Vellenga en prof. dr. R.A.J.O. Dierckx bedanken voor de beoordeling van mijn proefschrift. Ook hebben een aantal andere mensen een belangrijke rol gespeeld bij het tot stand komen van dit proefschrift.
Dr. E.F.J. de Vries, Erik, in mijn tweede jaar van mijn promotietraject maakte ik kennis met jou, nadat ik instapte in het IL2 project. De wereld van de kortlevende isotopen was nieuw voor mij. Ik heb dan ook veel kunnen leren van jou op het gebied van (radio)chemie. We hadden regelmatig overleg over de verschillende projecten en daar had je altijd waardevolle tips. Feedback op stukken was kritisch en dat tilde de manuscripten naar een hoger niveau. Veel dank daarvoor.
D
Dr. I.F. Antunes, Inês, we started working together on the IL2 project, and from that moment on, things started to work. Thank you for all your help. Although we had many struggles, I am proud that we managed to finish our studies so well. I learned a lot from your expertise in radiochemistry, and I enjoyed discussing our data. Moreover, I will never forget our trip to Berlin for the TRISTAN meeting.
Dr. F. Bensch, Frederike, bedankt voor al jouw harde werk aan de atezolizumab studie. Jij was vanaf moment één nauw betrokken bij de tracer ontwikkelingen en altijd geïnteresseerd in hoe dat verliep. Door deze studie hebben we heel mooi kunnen laten zien hoe een goede samenwerking tussen prekliniek en kliniek zijn vruchten afwerpt.
Prof. dr. S. de Jong, Steven, bedankt voor het meedenken bij de opzet van de experimenten van hoofdstuk 4 en het kritisch nakijken van onze stukken.
Dr. A. Jorritsma-Smit, Annelies, jij hebt een belangrijke rol gespeeld in de GMP validaties en het schrijven van de IMPD’s van de diverse studies. Dank daarvoor.
Dr. A.G.T. Terwisscha-van Scheltinga, bij het begin van mijn promotietraject was jij altijd aanwezig bij de overleggen op vrijdagochtend. Bedankt voor de waardevolle en leerzame input tijdens deze overleggen.
Daarnaast wil ik ook de vele coauteurs bedanken voor hun bijdragen aan dit proefschrift. I would like to thank the many co-authors, who contributed to this thesis.
Bedankt alle collega’s van het Multidisciplinair Oncologisch Lab (MOL) en de afdeling medische oncologie. Jullie zijn met te veel om allemaal bij naam te noemen, maar wat heb ik een leuke en leerzame tijd gehad. In het bijzonder wil ik bedanken de TGIF harde kern. Naast werk hebben we namelijk ook zoveel leuke andere dingen samen beleefd, zoals Lowlands, Eurosonic, wintersport, vrijmibo’s in de Uurwerker, volleyballen op het UMCG toernooi, de 4 Mijl rennen en een heerlijk weekend Terschelling!
Dr. H. Timmer-Bosscha en dr. J. Meijer, Hetty en Coby, de drijvende krachten achter lab MOL. Veel dank voor al jullie hulp en waardevolle input tijdens de vele imaging meetings. Het secretariaat van Medische Oncologie, dank voor alle ondersteuning de afgelopen jaren. Ook projectmanager dr. A. Funke, Anouk, bedankt voor jouw hulp.
Mijn collega’s van de tracer development imaging groep: Eva, Frank-Jan, Martin, Stijn, Frans, Danique, Arjan, Linda P, Linda B en Claudia. Bedankt voor alle hulp bij de experimenten en natuurlijk de gezelligheid. Daarnaast wil ik alle andere deelnemers van de imaging meetings bedanken voor de discussies en besprekingen.
Linda Pot-De Jong, jij bent van grote waarde voor onze imaging groep. Ik heb ontzettend gelachen tijdens de vele validaties die we samen gedaan hebben. Nooit verliep dit soepel en vlekkeloos. Maar mede geholpen door jouw nuchterheid, humor en goed hitjes op het B-lab kwam het altijd wel weer goed. Bedankt daarvoor.
Frans, jij hebt veel geholpen bij de IL2 studie. Dank daarvoor! Helaas is het me nooit gelukt jou te verslaan met pinball. Veel succes met het afronden van jouw proefschrift.
Thijs, samen werkten wij aan hoofdstuk 4. Ondanks soms tegenvallende resultaten, is het ons gelukt er een mooi stuk van te maken. Ik wil jou bedanken voor de prettige samenwerking en wens jou heel veel succes in jouw toekomst als arts.
Danique, jouw kritische blik en goede schrijf-skills hebben ervoor gezorgd dat het pembrolizumab stuk steeds mooier werd. Maar naast imaging collega en coauteur was jij er ook als luisterend oor, sportbuddy, wintersportmaatje, medefestivalganger etc. Bij jou kon ik altijd terecht en dat waardeer ik zeer. Ik ben blij dat wij beide nog even in Groningen blijven. Joany en Froucke, als masterstudenten farmacie mocht ik jullie begeleiden. Ik heb dit als leuk en leerzaam ervaren. Bedankt voor al jullie werk.
One of the requirements for having a good work day is having good office mates. Therefore, thanks to all my roommates, from both the Green room and the Chuck Norris room: Annechien, Justin, Kirill, Roland, Francien, Inês, Elles, Harm, Colin, Nathalie, Jie, Win Seng, Martin, Linda, Ximena, and Ilse. Thank you for all the coffee breaks and nice talks!
Inês, together we discussed many things in our office. You were always there for me and I really appreciate that. Thank you for everything.
Stephanie, wij begonnen ongeveer tegelijk aan ons promotietraject. Ik kon altijd bij het buurkantoor aankloppen om te praten over onderzoek of andere dingen. Ik vond het heel erg bijzonder dat ik vorig jaar jouw paranimf mocht zijn. Ik wens jou alle geluk in Zwitserland.
D
Nicolette, zoals jij in jouw dankwoord al schreef, beiden hadden wij last van FOMO (fear of missing out). Samen bezochten we dan ook allerlei concerten, festivals en toneelstukken. Ik hoop op nog veel meer leuke uitjes in de toekomst.
Francien, als kamergenootje heb jij veel van mijn projecten en onderzoek meegekregen. Ook was jij bijna altijd bij elke sociale activiteit aanwezig en hebben we veel leuke dingen samen beleefd. Ik vind het dan ook erg mooi dat jij mijn paranimf wilt zijn.
Vele uren heb ik doorgebracht op de laboratoria van de afdeling Nucleaire Geneeskunde. Ik wil daarom iedereen van deze afdeling bedanken voor de hulp op het lab en de gezelligheid! Een speciaal bedankje voor Rolf, Janet en Petra, voor hun bijdragen aan hoofdstuk 4, 5 en 6. Ook dank aan alle medewerkers van de Centrale Dienst Proefdieren (CDP), voor de ondersteuning bij mijn in vivo experimenten.
Dank aan alle collega’s van de afdeling Klinische Farmacie en Farmacologie (KFF). Ook jullie zijn met te veel om allemaal bij naam te noemen, maar ik dank jullie voor alle belangstelling. In het bijzonder de mede AIOS en (ziekenhuis)apotheker collega’s, die het afronden van mijn proefschrift van dichtbij hebben meegekregen. Ik kijk uit naar de komende jaren! Prof. dr. J.G.W. Kosterink, Jos, bedankt voor de kans dat ik mijn opleiding tot ziekenhuisapotheker bij de KFF kan doen.
Veel dank aan het secretariaat van de afdeling Klinische Farmacie en Farmacologie: Annemiek, Jessica en Wianda. Bedankt dat ik altijd bij jullie terecht kan met mijn vragen. Ook buiten het werk om zijn er een heel aantal mensen die altijd achter me hebben gestaan en mij hebben gesteund. Ik ben zeer dankbaar dat ik zulke lieve familie en vrienden om mij heen heb.
Mijn muziekvrienden van de Martini Brassband, wat heerlijk, repetities op maandagavond en dan even niet denken aan al die experimenten en deadlines. Gewoon samen muziek maken. Ik ben blij dat ik in zo’n mooie brassband mag spelen!
Lieve Lia, dushi, ik mis je al heel lang als toetermaatje, maar ik kom je graag nog vaker opzoeken op Curaçao! Masha danki voor alles!
Lieve Lara en Suzanne, vanaf dag 1 van farmacie zij wij al vriendinnen. Ik denk met veel plezier terug aan onze dinertjes en de karaoke-sessies met foute muziek. Ik vind het mooi dat wij elkaar nog altijd zien en hoop op nog veel meer gezelligheid samen. Bedankt voor alle steun! Lieve Lara, wat leuk dat wij de komende jaren nog heel veel cursussen samen mogen doen. Lieve Suzanne, ik vind het het heel bijzonder dat jij mijn paranimf wilt zijn! Lieve Alie, Astrid en Esther, vanaf de middelbare school zijn wij al vriendinnen. Ik kan altijd bij jullie terecht en ben erg dankbaar dat wij al zo lang (inmiddels meer dan 15 jaar) vriendinnen zijn! Ik kijk uit naar alle escaperooms die we nog samen moeten oplossen!
En dan mijn familie en schoonfamilie! Lieve mem en Anne, bedankt voor jullie onvoorwaardelijke steun en hulp. Ik kan altijd bij jullie terecht voor een luisterend oor of advies. Dat waardeer ik enorm. Lieve Geeske en Bart, samen hebben jullie een prachtig gezin. Ik ben trots dat ik tante ben van Leffert, Doutzen en Hessel. Bedankt voor alles! Lieve Tjibbe en Jana, samen hebben jullie een mooi plekje in Den Haag. Bedankt voor jullie steun, lieve broer en schoonzus! Leave beppe, ik ben erg trots op mijn escornet spelende beppe! Lieve heit en Tineke, ook jullie bedankt voor alle belangstelling. Lieve Ohana: Bert, Cherelien, Wilco, Nelson, Leonie, Kimberley, Ben, Monique, Kylian, Wendy en Cameron, een betere schoonfamilie had ik me niet kunnen wensen!
Tot slot, lieve Daniëlle, bedankt voor alle steun en begrip de afgelopen jaren. Wat heb jij veel geduld met mij gehad, als ik weer eens mopperend of gestrest thuis rondliep. Maar jij weet me altijd weer rustig te maken en laat me zien dat je moet genieten van het leven. Ik hou van jou en ik kijk uit naar onze toekomst samen!
