Functional role of lipids in bacterial protein translocation Koch, Sabrina
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2019
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Koch, S. (2019). Functional role of lipids in bacterial protein translocation. University of Groningen.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Zusammenfassung
Escherichia coli (E. coli) gehört zur Familie der Enterobacteriaceae und ist ein gramnegatives, fakultativ anaerobes Bakterium, das im Darmtrakt von Tieren als Bestandteil der kommensalen Mikroflora zu finden ist. Dieses Bakterium gehört zu den am besten charakterisierten Prokaryoten und aufgrund der Möglichkeit genetischer Manipulationen und der Verfügbarkeit von Protokol- len wird es als Modellorganismus in der Biologie und Biochemie verwendet, um eine Vielzahl von zellulären Prozessen zu untersuchen. Im Allgemeinen enthalten gramnegative Bakterien wie E. coli mindestens vier verschiedene Kompartimente: das Zytoplasma, die Cytoplasmamembran, den periplas- matischen Raum und die äußere Membran. Jeder Abschnitt setzt sich aus charakteristischen Proteinen, die spezifische Aktivitäten und Eigenschaften ermöglichen, zusammen. Um die Lebensfähigkeit und das Wachstum der Zellen sicherzustellen, ist die Übertragung von Masse und Energie zwischen diesen Kompartimenten notwendig. Die Cytoplasmamembran ist selektiv durchlässig. Obwohl kleine lipophile Moleküle passieren können, ist die Cytoplasmamembran eine Energie-transduzierende Membran und somit für Ionen, wie Protonen abgedichtet, die in Energie verbrauchenden Prozessen verwendet werden, die an dieser Membran auftreten. Daher muss die un- kontrollierte Freisetzung von Molekülen aus der Zelle verhindert werden. Für Proteine, die im Cytoplasma synthetisiert werden, aber ihre charakteristische Funktion außerhalb des Zytosols ausführen, sind spezifische Transportsyste- me erforderlich, die den Transport solcher Proteine in oder über die Cyto- plasmamembran erlauben.
Obwohl Bakterien mehrere Transportplattformen entwickelt haben, wird der Hauptweg für die Proteintranslokation und die Membranproteininsertion in die Cytoplasmamembran in Prokaryoten durch das Sec-System (von secretory) bereitgestellt. Das Sec-System ist essentiell für das Überleben von Zellen und ist universell konserviert. Die zentrale Komponente bildet der hochkonservierte Transportkanal SecYEG oder das Sec-Translokon. SecYEG vermittelt seine Funktion in der Cytoplasmamembran von Bakterien und Archaea, ist aber auch im endoplasmatischen Retikulum (Sec61-Komplex)
Z
und der Thylakoidmembran von Eukaryoten (1) vorhanden. Bakterien be- sitzen eine zusätzliche Komponente: die ATPase SecA, die die Energie für den Transport liefert. DieLeitung von Proteinen zum Transportkanal erfolgt über zwei Wege in E. coli, die zwischen sekretorischen Precursorproteinen und Membranproteinen unterscheiden. Die meisten Membranproteine werden co-translational zum Sec Translokon geleitet. Sobald die erste hydrophobe α-helikale Sequenz (2, 3) einer naszierenden Polypeptidkette (englisch ribo- some nascent chain RNC) aus dem ribosomalen Ausgangstunnel austritt, wird diese durch das Signalerkennungspartikel (englisch signal recognition particle SRP) (2, 3) gebunden. Im Folgenden bindet der SRP-RNC-Komplex den Membran-assoziierten SRP-Rezeptor FtsY (4, 5) und interagiert daraufhin mit dem SecYEG Transportkanal (6). SecYEG bindet das Ribosom, worauf- hin die naszierende Kette in den Transportkanal eingeführt und anschlie- ßend in die Cytoplasmamembran inseriert wird, in einen Prozess, der von der Translationskraft der Ribosomen und der Interaktion der hydrophoben Transmembransegmente mit den hydrophoben Kohlenwasserstoffschwänzen angetrieben wird (7, 8). Im Gegensatz dazu werden die meisten sekretorischen Precursorproteine in einer post-translationalen Weise zum Sec-Translokon geleitet. Diese Proteine werden zunächst vor Transportbeginn vollständig syn- thetisiert. Sekretorische Proteine weisen eine aminoterminale (N- terminale) Signalsequenz auf, die sich im Allgemeinen aus einem positiv geladenen N-Terminus, einem hydrophoben Kern und einem polaren C-Terminus zusammensetzt (3). Sobald der Großteil des sekretorischen Proteins am Ribosom synthetisiert wurde, wird die Polypeptidkette durch das moleku- lare Chaperon SecB, das die Aggregation des Proteins verhindert und es in einem ungefalteten, sekretionsfähigen Zustand hält, gebunden. SecB leitet das sekretorische Protein zu SecA (9), woraufhin SecA an SecYEG bindet, um den Transport einzuleiten. In den folgenden Schritten wird die Energie der ATP-Bindung und -Hydrolyse von SecA verwendet, um das sekretorische Protein durch den SecYEG Kanal zu transportieren.
Obwohl eine große Auswahl von strukturellen und funktionellen Informatio- nen über SecYEG und SecA zur Verfügung steht, sind einige mechanistische Details der Proteintranslokation noch ungeklärt. In den letzten Jahrzehnten
wurden Lipide, insbesondere negativ geladene (anionische) Lipide der Cy- toplasmamembran als eine wesentliche funktionelle Komponente für den Proteintransport identifiziert. Allerdings ist die genaue Wirkung, welche Lipide auf die Translokation ausüben, noch ungeklärt. Eine aktive Rolle von Lipiden wurde erstmals aufgrund der Beobachtung, dass SecA mit geringer Affinität anionische Lipide bindet, suggeriert (10, 11). SecA durchdringt dabei die Membran mit dessen amphipathischen N-Terminus (12). Darüber hin- aus wird die ATPase-Aktivität von SecA durch anionische Lipide stimuliert (10). Außerdem wurde gezeigt, dass die Signalsequenz von sekretorischen Proteinen Membranen, die mit anionischen Lipiden ergänzt sind, bindet, sich daraufhin faltet und in die Membran eindringt (13, 14). In dieser Doktorarbeit haben wir die Rolle von anionischen Lipiden als essentieller Partner für die funktionelle Interaktion zwischen SecA und SecYEG untersucht.
In Kapitel 1 wird die neue Nanodisc-Technologie erläutert, welche als Werk- zeug zur Rekonstitution von Membranproteinen in einer Lipid-basierten Umgebung dient. Nanodiscs sind diskoidale Lipid-Doppelschichten, die von einem Proteingürtel gebildet werden, dem sogenannten Major Scaffold Protein (MSP). Wir haben ferner die Bedeutung von Nanodiscs in neueren Studien zur Aufklärung mechanistischer und struktureller Merkmale des SecYEG Kanals und deren Verwendung für biophysikalische, biochemische und strukturelle Analysen hervorgehoben. Bisher wurden viele Experimente mit Detergens-solubilisierten Sec-Molekülen durchgeführt. Allerdings kann die Verwendung von Detergenzien strukturelle und funktionelle Defekte von Proteinen verursachen. Am bemerkenswertesten ist dies in der SecYEG- Ribosomen-Wechselwirkung, die in Detergenslösung substratunabhängig erscheint, allerdings streng substratabhängig ist, wenn Nanodisc-rekonsti- tuierte SecYEG verwendet werden (15). Daher bieten Nanodiscs viele Mög- lichkeiten, Membranproteine in einer physiologisch relevanten Umgebung zu untersuchen.
In Kapitel 2 untersuchten wir die Rolle von Lipiden für die SecA-Bindungs- und Translokationsaktivität. Wir haben zwei verschiedene Größen von Nano- discs (kleine ~ 12 nm und große ~ 30 nm), die einzelne SecYEG-Kanäle
Z
enthalten und sich somit in der Anzahl der Phospholipide unterscheiden, die sich innerhalb der Nanodiscs befinden, verwendet. Interessanterweise fanden wir heraus, dass SecA mit einer höheren Affinität zu SecYEG bindet, wenn eine Vielzahl von Lipiden vorhanden war, so wie in großen Nanodiscs, verglichen mit den kleineren Nanodiscs. Frühere Studien zeigten, dass die SecA-Bindung nur auftritt, wenn die Membranen mit anionischen Lipiden ergänzt sind (10, 11), aber diese Studien haben nicht ermittelt, ob die Bindung mit höherer Affinität zu Lipiden oder mit hoher Affinität zu SecYEG erfolgte.
Unsere Studie zeigt somit, dass anionische Lipide erforderlich sind, sodass SecA SecYEG mit hoher Affinität binden kann. Wir zeigten weiterhin, dass die Interaktion von SecA mit den anionischen Lipiden über den positiv geladenen SecA N-Terminus ermöglicht wird (16). Nach der Verkürzung des N-Termi- nus waren sowohl die SecA-SecYEG Interaktion als auch die Translokation betroffen. Um zwischen einer einfachen Membran-Bindungs-Funktion des SecA N-Terminus oder einer allosterischen Funktion der SecA-Lipid-Inter- aktion zu unterscheiden, führten wir eine verlängerte flexible Verknüpfung zwischen dem N-Terminus und der katalytischen ATPase-Domäne von SecA ein. Wir haben die Hypothese aufgestellt, dass die Membraninsertion des N-Terminus von SecA eine Konformationsänderung des SecA-Proteins erzwingen würde, die es ihm erlaubt, mit hoher Affinität an SecYEG zu binden. Der flexible Linker sollte daher mit dieser allosterischen Funktion interferieren, würde jedoch nicht dieMembran-Bindung von SecA verhindern.
In der Tat interferiert der flexible Linker mit der Transportfunktion sowie der SecA-SecYEG Interaktion, die nur durch hohe SecA-Konzentrationen überwunden werden konnte. Daher legen unsere Daten nahe, dass anionische Lipide dazu dienen, SecA für die Interaktion mit SecYEG mit hoher Affini- tät zu aktivieren, eine allosterische Funktion, die impliziert, dass das an die Phospholipidoberfläche gebundene SecA ein Zwischenprodukt im Katalyse- zyklus ist. Wir stellen einen neuen Mechanismus der Proteintranslokation vor, bei dem SecA zuerst negativ geladene Phospholipide in der Membran bindet, woraufhin das lipidgebundene SecA-Zwischenprodukt SecYEG mit hoher Affinität bindet. In einer Einzelmolekülstudie in lebenden E. coli-Zellen wurde festgestellt, dass SecA größtenteils an der Membranoberfläche lokalisiert ist (17). Bemerkenswerterweise diffundierte SecA an der Membranoberfläche
mit unterschiedlichen Diffusionsgeschwindigkeiten, die meist den Raten entsprechen, die typischerweise für Membranproteine (-komplexe) beobach- tet werden. Eine der Raten deutet jedoch auf eine schnelle Bewegung von SecA entlang der Membranoberfläche hin, die dem oben erwähnten SecA- Zwischenprodukt, das an die Lipidoberfläche gebunden ist und SecYEG mit hoher Affinität bindet, entsprechen könnte.
Obwohl die Ergebnisse von Kapitel 2 einen ersten Einblick in die funktionelle Rolle von anionischen Lipiden in der SecA-SecYEG-Wechselwirkung lieferten, untersuchten wir in Kapitel 3 die Rolle von anionischen Phospholipiden für die Proteintranslokation. Hier verglichen wir die anionische Lipidabhängigkeit der SecA-SecYEG-Interaktion mit der anionische Lipidabhängigkeit der Pro- teintranslokation. Interessanterweise nahm, während die Bindung von SecA an SecYEG bereits bei einer Konzentration von DOPG über 10 % gesättigt war, die Translokationsaktivität mit der DOPG-Konzentration deutlich bis über 30 % zu. Dies bedeutet, dass die anionische Lipidabhängigkeit dieser beiden Prozesse stark unterschiedlich ist, was die Existenz von mindestens zwei unterschiedlich anionisch lipidabhängigen Schritten bei der Transloka- tion nahelegt. Mithilfe molekulardynamischer Simulationen identifizierten wir eine Anreicherung anionischer Lipide innerhalb und in der Nähe der lateralen Öffnung des SecYEG Kanals sowie um den SecYEG Komplex und der am- phipathischen N-terminalen Helix von SecA, die in der Nähe von SecG an die Membran bindet. Die laterale Öffnung wurde in einer früheren Studie mit der korrekten Signalpeptidpositionierung eines sekretorischen Proteins innerhalb der Translokationspore in Verbindung gebracht (18). Somit könnte die Anwe- senheit von anionischen Phospholipiden an dieser Stelle möglicherweise die Alphahelix-Bildung der Signalsequenz induzieren oder stabilisieren. Durch die Kombination der Ergebnisse von Kapitel 2 und 3 stellen wir einen neuen Mechanismus der Proteintranslokation in Bakterien vor, bei dem anionische Lipide auf mindestens zwei Ebenen wirken. Zuerst unterstützen anionische Lipide die Leitung von SecA zur Cytoplasmamembran und aktivieren SecA für die Interaktion mit SecYEG mit hoher Affinität. Daraufhin stabilisieren anionische Lipide die teils geöffnete laterale Öffnung des SecYEG-Kanals und fördern die korrekte Positionierung der Signalsequenz eines Präproteins.
Z
Obwohl Nanodiscs ein sehr nützliches Werkzeug zur Untersuchung einzelner Komplexe in einer nativen Lipidumgebung darstellen, wurden die in Kapitel 2 und 3 vorgestellten Studien als bulk Experimente durchgeführt Daher prä- sentieren wir in Kapitel 4 eine neue Methode zur Rekonstitution von SecY- EG-Kanälen in Biomembranen, um nicht nur deren Diffusion, sondern auch Echtzeitbindungsvorgänge auf Einzelmolekülebene zu untersuchen. SLBs (von supported lipid bilayer) sind Modellmembranen und werden durch Fusion von Lipidvesikeln an eine Festkörperoberfläche wie Silikat- oder Glasoberflä- chen gebildet. Hier haben wir SLBs mit SecYEG in Durchflusszellen gebildet, um ungebundenes Material zu eliminieren sowie Pufferaustausch und die Zugabe von Bindungspartnern zu ermöglichen. Wir verfolgten die Diffusion von SecYEG in diesen SLBs mittels Interner Totalreflexionsfluoreszenz- mikroskopie (englisch Total internal reflection fuorescence microscopy TIRFM) und untersuchten die Dynamik des Kanals mit Hilfe der kumulativen Wahr- scheinlichkeitsverteilung (englisch cumulative probability distribution CPD).
Die Analyse ergab zwei Populationen von SecYEG, die unterschiedliche Diffusionskoeffizienten aufwiesen. In Gegenwart von SecA oder RNCs blieb die Anzahl der Diffusionspopulationen unverändert. Es zeigte sich jedoch, dass sich der Diffusionskoeffizient einzelner SecYEG-Komplexe während der Interaktion mit SecA leicht änderte und in Gegenwart von RNCs, die ein Membranprotein synthetisierten signifikant abnahm. Diese Verlangsamung der Diffusion ist bemerkenswert, da die Diffusionseigenschaften von SecYEG höchstwahrscheinlich durch die Viskosität der umgebenden Lipidmembran bestimmt werden und kaum von den physikochemischen Eigenschaften der wässrigen Umgebung beeinflusst werden. In der Tat hatte die Induktion von crowding Ereignissen durch die Aufnahme hoher Konzentrationen von Ficoll PM70 in das Medium wenig Einfluss auf die Diffusion von SecYEG. Da das Ribosom bekanntermaßen mit Phospholipiden wechselwirkt (8), stellen wir die Hypothese auf, dass diese zusätzliche Lipidwechselwirkung die Ursache für eine verringerte Diffusion von SecYEG aufgrund der Interaktion mit Ribosomen ist. Darüber hinaus liefern die Diffusionskoeffizienten, die auf aufgereinigten und definierten Komponenten in der Cytoplasmamembran basieren, einen Hinweis auf weitere Interpretationen des komplexen Diffu- sionsverhaltens von SecYEG in der Cytoplasmamembran lebender Zellen
(19). Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass SLBs eine exzellente Mo- dellmembran zur Untersuchung von Diffusions- und Echtzeit-Bindungs- ereignissen auf Einzelmolekülebene bieten.
Zusammenfassend präsentiert diese Arbeit neue mechanistische Einblicke in die Translokation von Proteinen in Bakterien und definiert insbesondere die Rolle von anionischen Lipiden während dieses Prozesses. Die hier präsen- tierten Forschungsergebnisse liefern eine lang gesuchte Erklärung, warum negativ geladene Phospholipide essentiell für die Translokation sind und integriert die verschiedenen experimentellen Beobachtungen des Einflusses von anionischen Phospholipiden auf Komponenten des Sec-Systems in einem vereinheitlichten Modell. In dieser Arbeit wurden auch neue Werkzeuge, z. B.
Nanodiscs und SLBs, für die funktionelle Untersuchung von Membran- transportern wie SecYEG in einer nativen Lipidumgebung für Bulk- und Einzelmolekülstudien untersucht.
Literatur
1. Hartmann, E., Sommer, T., Prehn, S., Gorlich, D., Jentsch, S., and Rapoport, T.
A. (1994) Evolutionary conservation of components of the protein translocation complex. Nature. 367, 654–657
2. Gierasch, L. M. (1989) Signal Sequences.
Biochemistry. 28, 923–930
3. von Heijne, G. (1985) Signal sequences. The limits of variation. J. Mol. Biol. 184, 99–105 4. Egea, P. F., Shan, S. O., Napetschnig, J.,
Savage, D. F., Walter, P., and Stroud, R. M.
(2004) Substrate twinning activates the signal recognition particle and its receptor.
Nature. 427, 215–221
5. Focia, P. J., Shepotinovskaya, I. V., Seidler, J.
A., and Freymann, D. M. (2004) Heterod- imeric GTPase Core of the SRP Targeting Complex. Science 303, 373–377
6. Zhang, X., Schaffitzel, C., Ban, N., and Shan, S. (2009) Multiple conformation- al switches in a GTPase complex control
co-translational protein targeting. Proc. Natl.
Acad. Sci. 106, 1754–1759
7. du Plessis, D. J. F., Nouwen, N., and Dries- sen, A. J. M. (2011) The Sec translocase.
Biochim. Biophys. Acta. 1808, 851–865 8. Frauenfeld, J., Gumbart, J., van der Sluis,
E. O., Funes, S., Gartmann, M., Beatrix, B., Mielke, T., Berninghausen, O., Becker, T., Schulten, K., and Beckmann, R. (2011) Cryo-EM structure of the ribosome–SecYE complex in the membrane environment.
Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 614–621 9. Zhou, J., and Xu, Z. (2003) Structural de-
terminants of SecB recognition by SecA in bacterial protein translocation. Nat. Struct.
Biol. 10, 942–947
10. Lill, R., Dowhan, W., and Wickner, W.
(1990) The ATPase activity of SecA is reg- ulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60, 271–280
Z
11. Hendrick, J. P., and Wickner, W. (1991) SecA protein needs both acidic phospholipids and SecY/E protein for functional high-af- finity binding to the Escherichia coli plasma membrane. J. Biol. Chem. 266, 24596–24600 12. Breukink, E., Demel, R. A., de Korte-Kool,
G., and de Kruijff, B. (1992) SecA inser- tion into phospholipids is stimulated by negatively charged lipids and inhibited by ATP: A monolayer study. Biochemistry. 31, 1119–1124
13. Keller, R. C. A., Killian, J. A., and de Kruijff, B. (1992) Anionic Phospholipids are Es- sential for α-Helix Formation of the Sig- nal Peptide of Prephoe upon Interaction with Phospholipid Vesicles. Biochemistry. 31, 1672–1677
14. Keller, R. C. A., ten Berge, D., Nouwen, N., Snel, M. M. E., Tommassen, J., Marsh, D., and de Kruijff, B. (1996) Mode of in- sertion of the signal sequence of a bacterial precursor protein into phospholipid bilayers as revealed by cysteine-based site-directed spectroscopy. Biochemistry. 35, 3063–3071 15. Wu, Z. C., de Keyzer, J., Kedrov, A., and
Driessen, A. J. M. (2012) Competitive bind- ing of the SecA ATPase and ribosomes to the SecYEG translocon. J. Biol. Chem. 287, 7885–7895
16. Bauer, B., Shemesh, T., Chen, Y., and Rapoport, T. A. (2014) A push and slide mechanism allows sequence-insensitive translocation. Cell. 157, 1416–1429 17. Seinen, A.-B., Spakman, D., van Oijen, A.
M., and Driessen, A. J. M. Dynamics of membrane localization of the SecA ATPase in E. coli cel. Unpubl. Work
18. Li, L., Park, E., Ling, J. J., Ingram, J., Ploegh, H., and Rapoport, T. A. (2016) Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531, 395–399
19. Seinen, A.-B., Spakman, D., Zhang, W., Prabudiansyah, I., van Oijen, A. M., and Driessen, A. J. M. Dynamical organization of the Sec holotranslocon in Escherichia coli cells. Unpubl. Work
