University of Groningen Exploring the Staphylococcus aureus cell wall for invariant immunodominant targets Mora Hernández, Yaremit

Exploring the Staphylococcus aureus cell wall for invariant immunodominant targets

Mora Hernández, Yaremit

DOI:

10.33612/diss.147005930

IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below.

Document Version

Publisher's PDF, also known as Version of record

Publication date: 2020

Link to publication in University of Groningen/UMCG research database

Citation for published version (APA):

Mora Hernández, Y. (2020). Exploring the Staphylococcus aureus cell wall for invariant immunodominant targets. University of Groningen. https://doi.org/10.33612/diss.147005930

Copyright

Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Take-down policy

If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim.

Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.

139

Chapter 6

Nederlandse samenvatting

140

Sinds de mens is begonnen met het domesticeren van dieren voor de productie van voedsel lopen veeboeren en consumenten het risico om van mens op dier overdraagbare ziektes op te lopen, de zogenaamde zoönoses. De overdracht van ziektekiemen op de mens kan zowel plaatsvinden via rechtstreeks contact met besmette dieren als door de consumptie van besmet voedsel. Het risico om bacteriële infecties van vee op te lopen is betrekkelijk gering, doordat veel van dergelijke infecties al in de veestapel met behulp van antibiotica onderdrukt kunnen worden. In de afgelopen jaren zijn antibiotica echter minder effectief geworden door de steeds verdergaande verspreiding van antibioticumresistente micro-organismes ten gevolge van te veel of verkeerd gebruik van antibiotica, of door het lozen van antibioticumresten in het milieu. Om deze zorgwekkende trend te stoppen is het nodig een zogenaamde ‘one health’ benadering toe te passen die rekening houdt met de nauwe samenhang van de gezondheid van mens en dier en de omgeving die we met elkaar delen (https://www.cdc.gov/onehealth/).

Een duidelijk voorbeeld van een besmettelijke veterinaire ziekte die met behulp van een ‘one health’ benadering aangepakt zou moeten worden is de uierontsteking, ofwel mastitis, bij koeien. Hierbij raken de melkklieren in de uier ontstoken, hetgeen voor veehouders en de zuivelindustrie tot aanzienlijke financiële verliezen kan leiden door verminderde melkproductie, melk die niet geschikt is voor consumptie, dierenartskosten en het ruimen van vee. Bovendien heeft mastitis een negatief effect op het welzijn van koeien en kan het leiden tot de verspreiding van ziektekiemen die zoönoses bij de mens kunnen veroorzaken. Met betrekking tot dit laatste punt is het relevant om te benadrukken dat de bacterie Staphylococcus aureus, één van de meest frequente veroorzakers van mastitis bij koeien, ook een beruchte antibioticumresistente verwekker van ziektes van de mens is. De S. aureus bacterie wordt bovendien vaak aangetroffen in de melk van koeien met mastitis 1_.

Veel mensen en dieren dragen S. aureus langdurig met zich mee zonder ziektesymptomen te ontwikkelen. Als deze bacterie echter de gelegenheid krijgt om het lichaam van zijn gastheer binnen te dringen, bijvoorbeeld ten gevolge van trauma, beschadigde huid of slijmvliezen, of door een verzwakt immuunsysteem, dan kan hij een breed scala aan potentieel dodelijke ziektes veroorzaken. Het is moeilijk om de overdracht van S. aureus van mens op

141

6

in ons leefmilieu is aan te treffen en met gemak de huid en slijmvliezen van zoogdieren kan koloniseren. Deze ziekteverwekker heeft bovendien een groot arsenaal aan virulentiefactoren tot zijn beschikking, waarmee hij de gastheer kan koloniseren en binnendringen en waarmee hij het immuunsysteem van de gastheer onschadelijk kan maken 2_{. Daar komt nog bij, dat S. aureus snel} resistentie ontwikkelt tegen antibiotica door fysiologische aanpassingen, mutaties in het genoom, of door het verwerven van resistentiegenen van andere bacteriën via horizontale gen-overdracht. Een berucht voorbeeld van dit laatste mechanisme is de zogenaamde meticilline resistente S. aureus (MRSA) die zich heeft verspreid in de menselijke populatie en de veestapel. Dientengevolge is MRSA een wereldwijde bedreiging geworden voor de gezondheid van mens en dier. Ook in de melkveehouderij veroorzaakt de antibioticumresistente S.

aureus een serieus probleem, met name doordat een antibioticumkuur eigenlijk

de meest effectieve behandeling van mastitis is 3_{. Er zijn daarom dringend} alternatieve methodes voor de preventie en behandeling van mastitis bij koeien nodig. Vaccinatie kan in principe een effectieve bescherming tegen infectieziektes bieden. Het probleem is echter dat het, ondanks meerdere intensieve pogingen, tot dusver niet mogelijk was om een effectief vaccin op de markt te brengen, dat effectieve bescherming biedt tegen S. aureus infecties in het algemeen en mastitis in het bijzonder 4,5_{. De benaderingen die tot dusver} zijn getest voor de ontwikkeling van vaccins behelzen onder meer de immunisatie met geïnactiveerde bacteriën, of met inactieve toxines of geconserveerde virulentiefactoren die door veel S. aureus varianten aangemaakt worden. Dit heeft helaas niet geleid tot een werkzaam vaccin. Een mogelijke procedure die kan leiden naar de ontwikkeling van vaccins ter voorkoming van S. aureus infecties zou de volgende stappen kunnen omvatten: i. opsporing en karakterisering van S. aureus-isolaten die infecties, zoals mastitis, hebben veroorzaakt; ii. moleculaire screening van componenten die de desbetreffende S. aureus-isolaten altijd op hun celoppervlak presenteren en die vrij eenvoudig door het immuunsysteem van de menselijke of dierlijke gastheer herkend kunnen worden; iii. selectie en productie van potentiële antigenen die benut kunnen worden voor vaccinatie; iv. testen of vaccinatie met de geselecteerde antigenen inderdaad bescherming tegen S. aureus infecties biedt in een relevant diermodel; v. analyse van de opgewekte immuunreacties;

142

vi. testen van de veiligheid en toxicologische eigenschappen van de beoogde vaccincomponenten; en vii. het uitvoeren van de noodzakelijke klinische testen. Al deze stappen in het ontwikkelingsproces verdienen de nodige aandacht. Eén van de belangrijkste obstakels in de vroege stadia van het ontwikkelingsproces voor nieuwe vaccins betreft de identificatie van de juiste antigenen. Dit is een serieuze uitdaging in het geval van S. aureus, omdat het genoom van deze bacterie zeer variabel is en omdat er zo mogelijk nog meer variatie bestaat in de antigenen die S. aureus op het celoppervlak presenteert 6,7_{. In de afgelopen} jaren is het bovendien steeds duidelijker geworden dat antistoffen die binden aan eiwitten op het celoppervlak van S. aureus de gastheer niet altijd tegen infectie beschermen. Het is daarom belangrijk om de geëxponeerde eiwitdomeinen te identificeren die het meest waarschijnlijk leiden tot een beschermende immuunrespons bij vaccinatie 8–10_.

Dit proefschrift beschrijft de stappen die gevolgd zijn om in en op het omhulsel van S. aureus te zoeken naar zogenaamde immunodominante eiwitten, die bij alle mastitis-geassocieerde isolaten van de bacterie voorkomen en die mogelijk geschikt zijn als doelwit voor toekomstige vaccins om mastitis en andere S.

aureus infecties te voorkomen. Deze stappen zijn weergegeven in Figuur 1.

Hoofdstuk 2 van dit proefschrift beschrijft 33 S. aureus-isolaten uit melk van koeien met mastitis die verkregen werd van boerderijen in de Comarca Lagunera regio in Mexico. Deze isolaten werden gekarakteriseerd en getypeerd om de verschillende respectievelijke S. aureus varianten die mastitis bij de koeien veroorzaakten te onderscheiden. Hiertoe werd allereerst de zogenaamde MLVF-techniek gebruikt die variaties in de bacteriële genomen zichtbaar maakt. Dit liet zien dat 33 isolaten tot vier verschillende groepen behoorden. Vervolgens werd met behulp van de zogenaamde spa-typering zichtbaar gemaakt, dat twee van de MLVF-groepen tot het spa-type t224 behoorden. De derde MLVF-groep omvatte isolaten met de spa-types t416 en t3196 en de vierde MLVF-groep bestond uit isolaten met het spa-type t114. Het voordeel van MLVF is dat deze typeringsmethode snel en goedkoop is en een hoog onderscheidend vermogen heeft vergeleken met andere typeringsmethodes, zoals de spa-typering. Het belangrijkste nadeel van MLVF is dat het lastig is om resultaten van verschillende laboratoria rechtstreeks te vergelijken. Het onderscheidende vermogen van de spa-typering is minder hoog, doordat slechts naar variaties in één gebied van het genoom gekeken

143

6

gebaseerd zijn op DNA sequentieanalyse, waardoor ze rechtstreeks vergelijkbaar zijn ook als de analyses in verschillende laboratoria werden uitgevoerd.

Figuur 1. Schematische weergave van de pijplijn voor de identificatie van antigeendomeinen van celwand eiwitten van Stafylococcen die mogelijk gebruikt kunnen worden als vaccin targets. Identificatie en typering van S. aureus-isolaten uit melkmonsters verkregen van koeien die leden aan klinische mastitis, werd uitgevoerd door middel van MLVF en spa-typering. Identificatie van aan het oppervlak blootgestelde of celwand gelokaliseerde eiwitten (Surfacome) van pathogene S. aureus-isolaten werd verkregen door middel van proteomics met behulp van het scheren van het celoppervlak en extractie van eiwitcelwanden. Celoppervlak antigenen werden geproduceerd en geïsoleerd met behulp van een op Lactococcus lactis gebaseerd expressiesysteem. De gezuiverde recombinante antigenen werden afzonderlijk gebruikt voor immunisatie van muizen en getest op overleving na infectie met S. aureus in een bacteriëme model. Ten slotte werden verschillende antigeendomeinen gebruikt voor het in kaart brengen van epitopen die worden herkend door de IgG's van geïmmuniseerde muizen en koeien die aan mastitis leden. Ten slotte moeten de meest geschikte gezuiverde recombinante antigenen, afzonderlijk of in combinatie, worden getest op hun mogelijke toepasbaarheid bij actieve immunisatie tegen

144

Op grond van de spa-typering werden zes mastitis-isolaten geselecteerd voor verder onderzoek. Dit betrof onder andere drie isolaten met het spa-type t224, omdat de meeste verzamelde isolaten tot dit spa-type behoorden. Allereerst werden de genomen van deze zes isolaten gesequenced, waardoor het zogenaamde sequentietype (ST) bepaald kon worden via de zogenaamde multi-locus sequentietypering (MLST) 11,12_{. Op deze manier werden twee geheel} nieuwe S. aureus ST types geïdentificeerd, namelijk ST4551 en ST4552. Het zogenaamde isolaat G-1 behoort tot het ST4551, terwijl de overige vijf isolaten behoren tot het ST4552. Vervolgstudies met het isolaat G-1, beschreven in Hoofdstuk 3, lieten inderdaad zien dat dit isolaat verschilt van andere isolaten met betrekking tot de aantallen extracytoplasmische eiwitten op verschillende subcellulaire locaties.

Om potentiële vaccin-targets te identificeren zijn proteoomanalyses van grote waarde. In de meeste eerder uitgevoerde proteoomanalyses van mastitis-isolaten, werden de verschillende isolaten in een rijk medium gekweekt om zo veel mogelijk cellulaire en extracellulaire eiwitten te verzamelen. Zo werden in een eerdere studie de celwand-eiwitten van en S. aureus mastitis-isolaat verzameld na kweken op bloedagar platen 13_{. Dezelfde kweekconditie werd} toegepast in een vervolgstudie waarin ook immuunreacties tegen S. aureus-isolaten, die een milde vorm van mastitis hadden veroorzaakt, bestudeerd werden 14_{. In een derde studie werden verschillende S. aureus mastitis-isolates} in een soja-medium 15 _{of onder ijzer-limiterende condities gekweekt} 16_{. Al deze} condities verschillen echter sterk met de condities in de melkklieren van een koeienuier en dit kan de uitkomsten van de proteoomanalyses sterk beïnvloeden. Het is daarom van belang voor dit soort studies om de condities op de plaats van infectie zo veel mogelijk na te bootsen 17_{. Om dit doel te} bereiken werden de mastitis-isolaten in het onderhavige onderzoek gekweekt in een medium van wei-permeaat. Dit medium bestaat voornamelijk uit melkeiwitten en lactose. Hoewel de groei van de mastitis-isolaten langzamer verliep dan in de rijkere standaardmedia kon voldoende eiwitmateriaal verzameld worden voor Western blotting en proteoomanalyses. De resultaten die beschreven staan in Hoofdstuk 3 laten inderdaad aanzienlijke verschillen in eiwitsamenstelling zien tussen mastitis-isolaten die in weipermeaat of in een standaardmedium gekweekt werden.

145

6

aureus-isolaten te onderzoeken werden twee verschillende methodes toegepast, te weten: i. behandeling van het bacteriële celoppervlak met trypsine, en ii. extractie van eiwitten die aan het celoppervlak gebonden zijn met het ‘chaotrope’ kaliumthiocyanaat (KSCN) (Hoofdstuk 3). De eiwitten die verkregen kunnen worden met behulp van KSCN- extractie zijn niet-covalent gebonden aan het celoppervlak. Daarentegen kan de trypsine behandeling ook S. aureus eiwitten losmaken die via een zogenaamd LPXTG-motief covalent aan de celwand gebonden zijn. Een verrassende waarneming was dat, ondanks meerdere was-stappen, na de groei in weipermeaat verschillende melkeiwitten aan het bacteriële celoppervlak gebonden bleken te zijn. Dit betekent dat de bacteriën een zogenaamde ‘corona’ van melkeiwitten hadden gerekruteerd. De aanwezigheid van deze corona is een belangrijk gegeven, omdat de melkeiwitten de bacteriële eigenschappen aanzienlijk kunnen beïnvloeden. De corona kan bijvoorbeeld van invloed zijn op de bacteriële interacties met gastheerweefsels en hij kan S. aureus onzichtbaar maken voor het immuunsysteem van de koe. Bovendien kunnen de melkeiwitten mogelijke vaccin-targets afschermen tegen de binding van immuunglobulines, waardoor de bacterie aan het immuunsysteem van de gastheer kan ontsnappen. De proteoomanalyses lieten zien dat verschillende types van S. aureus-eiwitten aan het bacteriële celoppervlak gebonden kunnen zijn, waaronder ook eiwitten die actief zijn in het cytoplasma. De aanwezigheid van dergelijke ‘moonlighting’ eiwitten op het oppervlak van S. aureus kan op verschillende manieren verklaard worden, waaronder export via tot dusver onbekende routes, lysis van bacteriën of diffusie door pores 18_{. Andere verklaringen voor de detectie van} cytoplasmatische eiwitten op het celoppervlak zouden membraanverzwakking door cytolytische toxines, autolysis of lysis ten gevolge van bacteriofagen kunnen zijn 6,19,20_{. De onderzochte S. aureus-isolaten bleken inderdaad} meerdere celwandhydrolases te produceren en ze bevatten allemaal ook meerdere profagen in hun genoom die mogelijk geïnduceerd kunnen worden onder bepaalde stressvolle condities. Dit zou kunnen verklaren waarom er verschillen werden waargenomen in de cytoplasmische eiwitten die op het celoppervlak van de mastitis-isolaten werden aangetroffen, zoals beschreven in Hoofdstuk 3. Bovendien werden bij de proteoomanalyses verschillende bacteriofaageiwitten aangetroffen in de vijf isolaten met ST4552, terwijl dit niet het geval was voor het G-1 isolaat met ST4551. Bij het G-1 isolaat werden ook

146

de geringste aantallen cytoplasmatische eiwitten op het celoppervlak aangetroffen. Dit is een duidelijke indicatie dat bacteriofagen betrokken kunnen zijn bij het vrijkomen van de cytoplasmische eiwitten uit de bacteriecellen. De eiwitidentificaties na trypsine behandeling of KSCN-extractie van de mastitis-isolaten vertoonden een overlap van 28,29%, hetgeen de complementariteit van deze procedures mooi laat zien. De LytM- en SceD-eiwitten werden bijvoorbeeld uitsluitend geïdentificeerd door middel van trypsine-behandeling, terwijl het Sle1-eiwit alleen geïdentificeerd werd na KSCN-extractie. Dit suggereert dat LyM en SceD op het celoppervlak binnen het bereik van trypsine liggen, terwijl Sle1 in een diepere laag van de celwand ligt. Het kan echter ook zijn dat Sle1 beschermd is tegen trypsine door de corona van melkeiwitten, of door een vouwing die dit eiwit beschermt tegen proteolyse door trypsine.

Bij de uitgevoerde proteoomanalyses werden meerdere celwandhydrolases gedetecteerd. Dit riep de vraag op of deze eiwitten mogelijk als vaccin-targets inzetbaar zijn. De celwandhydrolases Aly, LytM en Sle1 werden vervolgens geselecteerd voor verder onderzoek. Hiertoe werden deze enzymen in

Lactococcus lactis tot expressie gebracht en vervolgens gezuiverd (Hoofdstuk

4). Dit betrof overigens niet alleen de volledige eiwitten, maar ook specifieke domeinen van deze eiwitten. De kwaliteit van de gezuiverde eiwitten en domeinen werd geverifieerd door middel van activiteitsanalyses.

Immunisatie van muizen met de complete Aly-, LytM- of Sle1-eiwitten gaf aanleiding tot een sterke aanmaak van immuunglobulines met het type G (IgG). De hoge IgG-niveaus bleken de geïmmuniseerde muizen helaas niet te beschermen tegen een S. aureus bacteriëmie, hetgeen in overeenstemming is met eerdere resultaten van een studie waarbij LytM als onderdeel van een eiwitcocktail voor immunisatie werd gebruikt 21_{. Om meer inzicht te krijgen in de}

redenen waarom de immunisatie met Aly, LytM of Sle1 geen bescherming tegen

S. aureus bood, werd de specificiteit van de respectievelijke IgGs onderzocht

met behulp van de gezuiverde Aly-, LytM- of Sle1-domeinen. Hierbij is het van belang te vermelden dat celwandhydrolases zijn opgebouwd uit een celwand-bindend domein, een domein met de actieve site en, in sommige gevallen, een domein dat de activiteit van het eiwit controleert. De binding van de muizen-IgGs aan elk van deze domeinen werd onderzocht met behulp van Western blotting, zoals beschreven in Hoofdstuk 4. Ter vergelijking werd de binding van

147

6

blaarziekte epidermolysis bullosa (EB) onderzocht. De reden om IgGs van patiënten met EB te onderzoeken was dat de chronische wonden van deze patiënten in sterke mate gekoloniseerd worden door S. aureus, waardoor hun immuunsysteem regelmatig met de bacterie geconfronteerd wordt. Hierdoor lijken deze patiënten een weerstand tegen S. aureus-infecties te hebben opgebouwd. Tenslotte werd ook de binding van IgGs van koeien met mastitis aan de verschillende gezuiverde eiwitten onderzocht. De resultaten, zoals beschreven in Hoofdstukken 4 en 5 laten zien dat de drie celwandhydrolases Aly, LytM en Sle1 sterke IgG-aanmaak opriepen in muizen, mensen en koeien. De eiwitdomeinen die door deze IgGs werden herkend verschilden echter aanzienlijk. De serum-IgGs van geïmmuniseerde muizen bleken te binden aan het celwand-bindende domein van Sle1 en de katalytische domeinen van Aly en LytM. IgGs in de humane sera bleken vooral te binden aan het katalytische domein van Sle1 en de N-terminale domeinen van Aly en LytM. Dit suggereert dat de laatstgenoemde domeinen wel eens interessant zouden kunnen zijn voor toekomstige immunisatie-studies, met name omdat de IgGs van de patiënten met EB mogelijk bescherming bieden tegen S. aureus-infecties 22_{. In dit opzicht} is het vermeldenswaardig, dat eerder onderzoek heeft laten zien dat een geconserveerd N-terminaal domein van IsaA herkend werd door IgGs van patiënten met EB, maar niet door IgGs van muizen die met het IsaA-eiwit geïmmuniseerd waren. Ook in dit geval boden de muizen-IgGs, die alleen het C-terminale deel van IsaA herkenden, geen bescherming tegen S. aureus infecties. Deze waarnemingen suggereren dat de IgG-respons tegen eiwitten aan het celoppervlak van S. aureus gastheer-specifiek zou kunnen zijn. Er zijn echter ook andere mogelijke verklaringen, zoals de manier waarop de eiwitten in de gastheer gepresenteerd werden. De immunisatie van muizen werd namelijk met gezuiverd eiwit uitgevoerd, terwijl de humane vrijwilligers en patiënten te maken hadden met de eiwitten zoals ze door de S. aureus-bacterie gepresenteerd worden. Op grond van de eerdere studies met IsaA zouden zulke verschillen wel eens cruciaal kunnen zijn, aangezien monoclonale antistoffen tegen het N-terminale domein van IsaA in muizen een zekere mate van bescherming tegen S. aureus-infecties bieden 8,10,23–25_{. Dit suggereert dat} het voor de ontwikkeling van een vaccin van belang is om de aandacht te richten op de eiwitdomeinen die mogelijk beschermende IgG-responses oproepen als gevolg van langdurige kolonisatie van de gastheer.

148

In de context van het onderhavige promotieonderzoek riepen de verschillen in de IgG-response in muizen en mensen de vraag op welke domeinen van S.

aureus celwandhydrolases de sterkste IgG-response in koeien met mastitis

oproepen. In dit opzicht was het van belang dat de proteoomanalyses hadden laten zien dat de zes gekarakteriseerde mastitis-isolaten de onderzochte celwandhydrolases inderdaad aanmaken (Hoofdstuk 3). Derhalve werd in een aantal pilot-experimenten onderzocht of de sera van koeien met mastitis IgGs bevatten die binden aan gezuiverde domeinen van de IsaA-, Sle1- en Aly-eiwitten. Een opmerkelijke waarneming was dat de sera van vrijwel alle onderzochte koeien met mastitis geen IgGs tegen het IsaA-eiwit bevatten, ondanks het feit dat de mastitis-isolaten dit eiwit produceren als ze in weipermeaat gekweekt worden (Hoodstukken 3 en 5). Dit suggereert dat er soortspeifieke verschillen zijn in de IgG-response tegen het IsaA-eiwit, of dat er essentiële verschillen zijn in de presentatie van IsaA in koeien, muizen en de mens. Alle koeiensera bleken daarentegen wel IgGs tegen het LysM-domein van Sle1 te bevatten, terwijl er geen IgGs tegen het active site-domein detecteerbaar waren (Hoofdstuk 5). Deze specifieke IgG-response met een voorkeur voor het LysM-domein is vergelijkbaar met de situatie in muizen die geïmmuniseerd waren met het Sle1-eiwit. Verschillende humane sera bleken daarentegen wel IgGs tegen het actieve site-domein van Sle1 te bevatten. Vergelijkbare verschillen werden waargenomen voor de herkenning van verschillende domeinen van het Aly-eiwit door IgGs van koeien, muizen en mensen. Tezamen suggereren deze waarnemingen dat er soortspecifieke verschillen zijn in de herkenning van domeinen van S. aureus-eiwitten door de immuunsystemen van koeien, muizen en mensen.

149

6

Conclusie

Samenvattend kan geconcludeerd worden dat het onderhavige proefschrift de blauwdruk is voor een benadering om mogelijke targets te identificeren en te karakteriseren voor de ontwikkeling van vaccins tegen de belangrijke humane en veterinaire ziekteverwekker S. aureus. De resultaten laten geheel verschillende IgG-responses tegen antigenen van S. aureus zien in geïmmuniseerde muizen, gekoloniseerde mensen en koeien met mastitis. Dit duidt op belangrijke verschillen tussen soorten, waarmee rekening gehouden moet worden bij het testen van potentiële S. aureus-vaccin-targets in diermodellen. De studies beschreven in dit proefschrift suggereren dat celwandhydrolases van S. aureus wellicht goede vaccin-targets kunnen zijn die sterke IgG-responses oproepen, maar het zal een belangrijke uitdaging voor toekomstige studies zijn om uit te zoeken welke IgG-responses inderdaad bescherming bieden tegen S. aureus-infecties. Zoals eerdere studies met het IsaA-eiwit van S. aureus hebben laten zien, is het wellicht zinvol om allereerst monoclonale antistoffen tegen specifieke domeinen van de onderzochte celwandhydrolases op te wekken en deze vervolgens te gebruiken voor passieve immunisatie van muizen. Hiermee kan aangetoond worden of een bepaalde IgG-response tegen het respectievelijke epitoop bescherming geeft. Uiteindelijk zal het echte bewijs voor de effectiviteit van een mogelijk vaccin moeten komen van actieve immunisatiestudies met recombinante domeinen van de meest veelbelovende antigenen in de meest relevante gastheren, namelijk de mens en de koe. Het onderzoek beschreven in dit proefschrift kan een leidraad bieden naar de ontwikkeling van de dringend benodigde vaccins die verzwakte mensen beschermen tegen levensbedreigende S. aureus-infecties en die melkveehouders beschermen tegen de pijnlijke verliezen veroorzaakt door mastitis.

150

Referenties

1. Contreras, G. A. & Rodríguez, J. M. Mastitis: Comparative Etiology and Epidemiology. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia 16, 339–356 (2011). 2. Sibbald, M. J. J. B. et al. Mapping the Pathways to Staphylococcal

Pathogenesis by Comparative Secretomics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70, 755–788 (2006).

3. Pyörälä, S. Treatment of mastitis during lactation. Ir. Vet. J. 62, S40–S44 (2009).

4. Miller, L. S., Fowler, V. G., Shukla, S. K., Rose, W. E. & Proctor, R. A. Development of a vaccine against Staphylococcus aureus invasive infections: Evidence based on human immunity, genetics and bacterial evasion mechanisms. FEMS Microbiol. Rev. 44, 123–153 (2019).

5. Ismail, Z. B. Mastitis vaccines in dairy cows: Recent developments and recommendations of application. Vet. World 10, 1057–1062 (2017). 6. Dreisbach, A. et al. Tryptic Shaving of Staphylococcus aureus Unveils

Immunodominant Epitopes on the Bacterial Cell Surface. J. Proteome Res. 19, 2997–3010 (2020).

7. Dreisbach, A., van Dijl, J. M. & Buist, G. The cell surface proteome of

Staphylococcus aureus. Proteomics 11, 3154–3168 (2011).

8. Koedijk, D. G. A. M. et al. Differential epitope recognition in the immunodominant staphylococcal antigen A of Staphylococcus aureus by mouse versus human IgG antibodies. Sci. Rep. 7, 8141 (2017).

9. Hoekstra, H. et al. A human monoclonal antibody that specifically binds and inhibits the staphylococcal complement inhibitor protein SCIN. Virulence 9, 70–82 (2018).

10. Romero Pastrana, F. et al. Human antibody responses against non-covalently cell wall-bound Staphylococcus aureus proteins. Sci. Rep. 8, 3234 (2018).

11. Maiden, M. C. J. Multilocus sequence typing of bacteria. Annu. Rev.

Microbiol. 60, 561–588 (2006).

12. Sabat, A. J. et al. Overview of molecular typing methods for outbreak detection and epidemiological surveillance. Euro surveill. 18, 20380 (2013). 13. Taverna, F. et al. Characterization of cell wall associated proteins of a

Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis case by a proteomic

approach. Vet. Microbiol. 119, 240–247 (2007).

14. Tedeschi, G. et al. Serological proteome analysis of Staphylococcus aureus isolated from sub-clinical mastitis. Vet. Microbiol. 134, 388–391 (2008).

151

6

15. Wolf, C. et al. Genomic and proteomic characterization of Staphylococcus

aureus mastitis isolates of bovine origin. Proteomics 11, 2491–2502 (2011).

16. Misra, N., Pu, X., Holt, D. N., McGuire, M. A. & Tinker, J. K. Immunoproteomics to identify Staphylococcus aureus antigens expressed in bovine milk during mastitis. J. Dairy Sci. 101, 6296–6309 (2018).

17. Mäder, U. et al. Staphylococcus aureus Transcriptome Architecture: From Laboratory to Infection-Mimicking Conditions. PLOS Genet. 12, e1005962 (2016).

18. Solis, N., Larsen, M. R. & Cordwell, S. J. Improved accuracy of cell surface shaving proteomics in Staphylococcus aureus using a false-positive control.

Proteomics 10, 2037–2049 (2010).

19. Zhao, X. et al. Exoproteome Heterogeneity among Closely Related

Staphylococcus aureus t437 Isolates and Possible Implications for Virulence. J. Proteome Res. 18, 2859–2874 (2019).

20. Mekonnen, S. A. et al. Signatures of cytoplasmic proteins in the exoproteome distinguish community- and hospital-associated methicillin-resistant

Staphylococcus aureus USA300 lineages. Virulence 8, 891–907 (2017).

21. van den Berg, S. et al. Active Immunization with an Octa-Valent

Staphylococcus aureus Antigen Mixture in Models of S. aureus Bacteremia

and Skin Infection in Mice. PLoS One 10, e0116847 (2015).

22. van der Kooi-Pol, M. M. et al. High Anti-Staphylococcal Antibody Titers in Patients with Epidermolysis Bullosa Relate to Long-Term Colonization with Alternating Types of Staphylococcus aureus. J. Invest. Dermatol. 133, 847– 850 (2013).

23. van den Berg, S. et al. A human monoclonal antibody targeting the conserved staphylococcal antigen IsaA protects mice against

Staphylococcus aureus bacteremia. Int. J. Med. Microbiol. 305, 55–64

(2015).

24. Oesterreich, B. et al. Characterization of the biological anti-staphylococcal functionality of hUK-66 IgG1, ahumanized monoclonal antibody as substantial component for an immunotherapeutic approach. Hum. Vaccines

Immunother. 10, 926–937 (2014).

25. Lorenz, U. et al. Functional antibodies targeting IsaA of Staphylococcus

aureus augment host immune response and open new perspectives for

152

Acknowledgement

I always imagine doing a PhD. but I didn’t know that during this path of my life I would learn a lot of things besides academic learning. I´m very glad that I had the opportunity to perform a PhD. project in a different country from my home country. Now that I finish, I can say that I wouldn’t change a thing from this time of my life. Of course, it wasn´t easy at all, but I really grew like a person and scientist (I hope).

First, of all, I want to thank Jan Maarten, for giving me the opportunity of being in his research group, without him it wouldn’t be possible this achievement. I remembered the Skype meeting when I met you, and you welcomed me in your lab. I really learn a lot of things from you, thanks to your optimistic attitude and serenity during stressful times.

Another person that I really glad to know is Girbe, my co-supervisor, thank you for all the time that you employ to give me feedback and review my writing. Of course, I want to acknowledge too all the useful and constructive ideas that you provide me, that are now part of this thesis. You are a very enthusiastic, positive, and proactive person, that helps me a lot to complete this project and to learn a lot of things about life. It is obvious that you really enjoy to teach and supervise students.

I would like to express my gratitude to the members of my thesis assessment committee Prof. S. Hammerschmidt, Prof. H.C. van der Mei and Prof. P. Heeringa. Thank you for taking the time and effort to read and approve this thesis.

I am very grateful to Prof. Dörte Becher and Dr. Sandra Maaß for the productive and charming collaboration.

Quiero agradecer al Dr. Pablo Hernández, por haber confiado en mí, y darme su apoyo para escribir la propuesta del proyecto que culmina con esta tesis, además de enviarme las muestras desde México. También muchas gracias por estar al pendiente, yo considero que usted fue como otro asesor para mí. I´m really glad that I have a lot of people to thank about this journey. Francisco tu fuiste el primero que conocí acá en Groningen, te agradezco mucho que me hayas introducido al Laboratorio de Jan Maarten sin siquiera conocerme, fuiste

153

6

este tiempo. Además, muchas gracias por hacerme sentir como de tu familia invitándome a conocer a tu esposa Alicia, a Emilia y Elías. Siempre me sentí bienvenida en tu casa. Alicia y tu familia siempre fueron un encanto. Rocío, tu fuiste mi madrina cuando llegue al laboratorio, muchas gracias por enseñarme como estaba la “movida” en Groningen y en el laboratorio, eso me ayudó mucho. Muchas gracias por todas las tardes de café, cenas y eventos sociales a los que me invitaste. Siempre disfruto mucho platicar contigo, ha sido un placer conocerte. Espero que te vaya muy bien en tu defensa.

I would like to thank to my amazing paranymphs Gaby, Elías y Marina, you are my friends. Gaby, casi desde el principio de los tiempos aquí en Groningen hicimos “click” y no nos hemos separado. Eres una de mis mejores amigas y te considero de mi familia, siempre me has apoyado en las buenas y en las malas, y tú puedes esperar lo mismo de mí. En verdad disfruto todo el tiempo que paso contigo y tu familia (Oliver y Romancito), gracias por todos los sábados familiares que me brindaron. Los voy a extrañar, pero los voy a venir a visitar. Elías, es increíble lo chiquito que es el mundo, hicimos la maestría en el mismo lugar de México y nunca nos conocimos, y mira donde nos venimos a encontrar. Has sido un gran amigo para mí, eres mi segundo hermano, me has enseñado muchas cosas y a pensar con originalidad. Disfrute mucho los viajes que hemos hecho juntos, espero que el futuro sigamos viajando juntos. Estoy muy agradecida por haberte conocido. Marina, aunque te conocí después que, a Gaby y Elías, también te has convertido en una gran amiga para mí, tu hiperactividad y mi pasividad se complementan. Gracias por todos los viernes de película y cenas que tuvimos, las pláticas y buenos momentos. Además, muchas gracias por escucharme y estar al pendiente de mí. Cuando quieras puedes venir a México, acá tienes tu casa.

Also, I would like to thank my Office mates, Marina, Usma and Bimal. I think we were the “best office” in the MolBac Lab, not to mention the Tuesday Fries. Usma, I really enjoy your company in the office, you are a funny person. Thanks to you I improve a bit my English. You cook amazing and I would have like to spend more time with you. Bimal, thank you for your help, it was nice to meet you. Thank you too for the amazing dinners that we have in your house, made by you and Pragyi, those potatoes are amazing!

I really felt a great connection with my Chinese friends. I don’t know why, but I always talk with my Mexican friends about this, we think that could be about the delicious food or the friendliness of the people. Thank you to Xin for your friendship, it was always nice to talk to you inside and outside of the lab. I´m

154

really glad that you introduce to the world of Hotpot and thank you for all the delicious dinners. Min, it was super nice to meet you, you are a good friend. Thank you for your help and great collaboration in the lab. I really enjoy the time that we spent together and the exquisite dinners that you made. Lu, you are a very cool girl, I´m glad that I met you. Thank you for the talks and amazing dinners.

I want to thank to my colleagues of the MolBac group; Nana ama, thank you for supporting me in the lab when I just arrived, that really help me to start. And I would like to thank you for the great advice that you gave me as a senior. Elisa, thank you for your company during the late-night stays in the lab. I really enjoy our conversations. Marines, muchas gracias por tu ayuda con la portada de esta tesis, siempre has sido muy servicial. Me dio mucho gusto conocerte, sigue siendo tan linda como eres. Margarita, agradezco haberte conocido, muchas gracias por las pláticas, las invitaciones a cenar y las idas al cine. Siempre platicábamos cosas muy interesantes. Te deseo lo mejor hoy y siempre. Thank you to introduce me to Eric, I really enjoy to talk to him. Stefano, thank you for the nice collaboration with the pipeline that predict the subcellular localization of the proteins of S. aureus. I wish you all the best in you PhD. defense and life. Hermi, thank you for the interesting questions and feedback during the MolBac meetings. I really enjoy your sense of humor. Thanks to Jolanda, Sjouke, Dennis, Rense, Yanyan, Tim, Suruchi, Andrea, Lisanne, Mafalda, Rita, Paola, Solomon, Jolien, Laura, Giorgio, Marco, Francis, Toby, Aysegul, Marjolien and Eleni you made my stay in the lab very pleasant. I wish you all the best.

No puedo dejar de lado a toda la gente que me ha estado apoyando todo este tiempo desde México, mis familiares y amigos. Primero que nada, quiero agradecerle a mis papás, Nicolás y Rocío, sin ellos no hubiera llegado a donde estoy ahora; porque siempre me han apoyado en todo lo que he querido hacer y siempre me están animando en todo. Muchas gracias por dar todo por Ariam y por mí. A mi papá por enseñarme a hacer las cosas bien y terminarlas; así como a trabajar duro. A mi mamá por siempre escucharme y darme los mejores consejos del mundo, con mucho cariño. Ariam, muchas gracias por escucharme, darme consejos y regañarme, aunque sea tu hermana mayor. Te admiro por ser tan trabajador y perseverante. A mami Mela, muchas gracias por siempre estar al pendiente de mí, apoyarme y quererme tanto. A mamá Doris, Juve, Helen, Isis, Matías e Iranny, por siempre animarme, apoyarme y ponerse contentos cuando nos vemos. Siempre me divierto mucho en su compañía. Los extraño mucho y cada año espero regresar a México, para celebrar y estar junto a ustedes.

155

6

apoyándome y sintiéndose orgullosas de mí. Mis amigas de casi toda la vida, mas de 15 años conociéndonos Karen, Minerva, Yumiko e Isneyda muchas gracias por su apoyo, estar preguntando como estoy y por compartir tantas cosas importantes de su vida conmigo. Muchas gracias por venir a visitarme a Groningen, me encanto que vinieran, espero que hagamos otro viaje parecido muy pronto.

También a mis amigas de la Universidad Anghie y Zay, también ya llevamos como 10 años conociéndonos; siempre estamos al tanto una de otra. Muchas gracias por su apoyo y cariño, cada vez que voy a Veracruz, espero verlas y pasar tiempo con ustedes.

Y, por último, pero no menos importante quiero agradecer a Emmanuel, muchas gracias por todo el apoyo que me has brindado, así como el cariño, amor y respeto. En verdad que me ha ayudado mucho que estés a mi lado, aunque sea a la distancia. Además, muchas gracias por el hermoso cuadro que pintaste exclusivamente para la portada de mi tesis. Te amo.

Thank you everyone one more time, Groningen, the Netherlands, 2020 Yaremit Mora-Hernández