Application of microarray-based gene expression
technology to neuromuscular disorders
Sterrenburg, P.J.E.
Citation
Sterrenburg, P. J. E. (2007, January 18). Application of microarray-based gene expression technology to neuromuscular disorders. Retrieved from https://hdl.handle.net/1887/8914
Version: Corrected Publisher’s Version
License: Licence agreement concerning inclusion of doctoral thesis in the Institutional Repository of the University of Leiden
Summary
The work presented in this thesis describes the use of large scale gene expression profi ling to study muscle cell differentiation in health and in two muscular dystrophies. DNA microarray technology has been used successfully in the past ten years in many different applications, including diagnostics, pharmacogenomics and toxicogenomics. Here, the development of a common reference is described which aids in the analysis of two-color microarray hybridizations (Chapter 2). This reference is based on the amplifi cation of the same probes which are spotted on the array and their subsequent RNA synthesis and labeling. In this way a ratio can be calculated and data analysis is simplifi ed.
The developed common reference was used in a study exploring gene expression changes during muscle cell differentiation using human primary myoblast cell cultures (Chapter 3).
Changes in expression levels immediately upon differentiation and up to day 4 were observed while the actual fusion of the cells only starts at the latter timepoint. Apart from known genes involved in myogenesis, also genes with a formerly unknown function were shown to be regulated during myogenesis. Future experiments should specify the function of these genes in the differentiation process. Primary human myoblast cell cultures of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) patients were also shown to represent a good model system to study the impaired regeneration in this disease. Changes were found early in DMD myogenesis even before Dystrophin, the defective protein in DMD, is expressed (Chapter 4). Bone morphogenetic protein 4 (BMP4), which stimulates proliferation via the Notch signaling pathway and at the same time inhibits differentiation, is upregulated in the DMD cells. A disturbed balance between these two processes possibly contributes to the ineffi cient regeneration documented in DMD patients. Future therapy studies can benefi t from this knowledge and stimulate regeneration by interfering in the BMP4 pathway.
To study another muscular dystrophy, oculopharyngeal muscular dystrophy (OPMD), we investigated gene expression changes in a cellular model overexpressing the mutant gene (PABPN1) (Chapter 5). In this cell model inclusions occur in 20-80% of the nuclei. Gene expression results revealed the involvement of collagen synthesis and extracellular matrix genes proportional to the percentage of inclusions present in the cell. The entrapment of Procollagen C-endopeptidase enhancer (PCOLCE) in the intranuclear inclusions, which has putative RNA binding domains by which it was proposed to be involved in stabilization of mRNA strands in noncollagenous protein synthesis as well as collagen synthesis, forms probably the basis for a general downregulation of these components. The protein was also found to be trapped in the inclusions in OPMD patient quadriceps muscle. Future gene expression studies on (pre-symptomatic) OPMD muscle are necessary to determine to what extent this deregulation contributes to the phenotype of the disease and if other pathways are involved.
The results described in this thesis show that the application of large-scale gene expression profi ling in the fi eld of neuromuscular disorders yields new insights and theories. Although the technique is still developing and maturing, follow-up studies will always be necessary to confi rm the results and to investigate the observed changes in more detail.
Summary
117
Samenvatting
In dit proefschrift wordt een techniek beschreven waarmee voor duizenden genen (bouwstenen van de cel) tegelijk bepaald kan worden of ze ‘aan’ of ‘uit’ staan in een cel in verschillende situaties (bijv. gezond vs. ziek). Door het bepalen van verschillen in deze zogenaamde gen expressie kan meer inzicht verkregen worden in bepaalde processen in de cel, in een ziekte of tijdens/na de behandeling van een ziekte. Om de techniek te optimalizeren, hebben we een referentie-panel van de te testen genen gemaakt en deze constante waarde gebruikt om de statistische analyze van de experimenten te vereenvoudigen (Hoofdstuk 2). Vervolgens hebben we de techniek toegepast in het spieronderzoek.
In een studie naar genen die betrokken zijn bij de specialisatie van een spiercel, hebben we 146 genen gevonden die in de tijd veranderen van activiteit (Hoofdstuk 3). Een groot deel hiervan (86) was nog niet eerder gevonden, mogelijk omdat eerdere studies gedaan zijn met behulp van diermodellen en wij de eerste waren om menselijke cellen te gebruiken. Deze nieuwe informatie geeft meer inzicht in het specialisatie proces van de spiercel en vormt aanleiding tot het nader onderzoeken van de specifi eke functie van de onbekende genen.
Bovendien kan het model systeem wat we hier gebruikt hebben ook toegepast worden om bij de mens het herstel van spieren bij schade (blessure of spierdystrofi e) te bestuderen.
Dit proces van spierherstel (regeneratie) is in Hoofdstuk 4 bekeken in patiënten met Duchenne spierdystrofi e (DMD) en er zijn belangrijke verschillen tussen de gezonde en de zieke cellen.
De cellen van DMD patiënten specialiseren zich langzamer onder invloed van een bepaald eiwit (BMP4) wat in hogere mate aanwezig is in de spieren van deze patiënten. Dit verschil kan mogelijk verklaren waarom de spieren van Duchenne patiënten zich niet effi ciënt kunnen herstellen zoals bij gezonde mensen gebeurt na bijvoorbeeld een spierblessure. Deze kennis kan helpen in de toekomstige ontwikkeling van medicijnen en behandeling van deze patiënten.
Een andere spierdystrofi e die met deze techniek is bestudeerd is oculopharyngeale spierdystrofi e (OPMD). We hebben een celmodel gemaakt voor deze ziekte en als het ware de echte situatie uitvergroot (Hoofdstuk 5). Aggregaten, specifi ek voor OPMD, die normaal gesproken in 2-5% van de spiercellen voorkomen, komen in dit model tot wel 80% voor.
Hierdoor is het makkelijker om naar de gevolgen van deze aggregaatvorming te kijken. Uit dit onderzoek blijkt dat een hele specifi eke groep genen, die van de extracellulaire matrix, bijna wordt uitgezet door de aanwezigheid van de grote hoeveelheid aggregaten. Deze brengen in bepaalde situaties extra stabiliteit aan de spier wanneer deze wordt beschadigd. Het is mogelijk dat dit mechanisme in OPMD is aangetast. Verder onderzoek in spieren van OPMD patiënten is nodig om te bepalen in hoeverre de resultaten van het celmodel van toepassing zijn op de processen in de OPMD spier.
De techniek beschreven in dit proefschrift kan toegepast worden in veel verschillende soorten onderzoek en geeft een algemene eerste indruk van veranderingen in bepaalde situaties. Het is dus gebleken een krachtige methode te zijn voor de ontdekkingsfase. Hierna zijn er echter nog meer specifi eke experimenten nodig om de resultaten te bevestigen en dieper in te gaan op de betrokken mechanismen.
Samenvatting
