De oorzaken van een verstoorde cel-‐cel adhesie in het luchtwegepitheel bij astma
Naam: Karlijn Horsthuis
Studentnummer: s1856502
2 Samenvatting
Astma is een chronische, inflammatoire luchtwegziekte die wereldwijd bij 300 miljoen mensen voorkomt. Oorspronkelijk dacht men dat alleen een inflammatoire component een rol speelde bij het ontstaan van astma, maar tegenwoordig is bekend dat er ook een grote rol is weggelegd voor een structurele component. Wanneer allergenen of andere irriterende stoffen worden geïnhaleerd, komen deze aanraking met de eerste lijn van verdediging: het luchtwegepitheel. Deze epitheellaag vormt normaal gesproken een hoog gereguleerde, fysieke barrière. Het epitheel bestaat uit cellen die aan elkaar vast zitten met behulp van tight en adherens junctions, die normaliter zorgen voor een sterke cel-‐cel adhesie. Astmatici ondervinden problemen met het in stand houden van de cel-‐cel adhesie. Abnormaliteiten in componenten van het epitheel zijn hier de oorzaak van. In het sputum van astmatici worden Creola lichaampjes gevonden, een duidelijke indicatie van epitheelschade in de longen. Het mucociliaire systeem is ook verstoord. Er zijn minder trilharen te vinden in het epitheel waardoor er een grotere slijmlaag ontstaat. Tevens het aantal toegenomen slijmbekercellen draagt hier aan bij. Naast deze epitheel abnormaliteiten zijn er ook defecten te vinden in tight en adherens jucntions eiwitten, die zorgen voor een verstoorde cel-‐cel adhesie. Zowel de expressie van E-‐
cadherine als ZO-‐1 als β-‐catenine is verlaagd. Deze verlaagde expressie draagt bij aan defecten in tight en adherens junctions. Normaal gesproken dragen de componenten van het epitheel en de tight en adherens junctions bij aan een sterke barrière, maar bij astmatici zijn deze aspecten verstoord, waardoor de weerstand van het epitheel verlaagd wordt en deze meer gevoelig wordt voor allergenen. De allergenen kunnen gemakkelijk door het epitheel naar binnen dringen wat bijdraagt aan verstoring van de luchtweg barrière. De gevonden inzichten kunnen bijdragen aan nieuwe therapieën die niet alleen aangrijpen op de ontsteking die ontstaat in de luchtwegen van astmatici, maar ook op structurele componenten die verstoord zijn bij astmatici.
Inhoudsopgave
-‐ Hoofdstuk 1: introductie blz. 4 -‐ 5
-‐ Hoofdstuk 2: Bespreking onderzoeksresultaten blz. 6-‐ 12
o 2.1: Abnormaliteiten in het luchtwegepitheel van astmatici
Remodellering blz. 6
Creolalichaampjes blz. 7
Het muciliaire systeem blz. 7 -‐ 8
o 2.2: Defecten in tight en adherens junctions
Tight junctions blz. 8 -‐ 10
Adherens junctions blz. 11
E-‐cadherine, ZO-‐1 en β-‐catenine blz. 12
-‐ Hoofdstuk 3: Discussie onderzoeksresultaten blz. 13
-‐ Hoofdstuk 4: Referenties blz. 14 -‐ 16
4 1.Introductie:
Astma is een chronische, inflammatoire ziekte van de luchtwegen die bij 300 miljoen mensen wereldwijd voorkomt (Masoli, Fabian et al. 2004). Een chronische ontstekingsreactie en blijvende aantasting van de structuur van de luchtwegen, remodellering genoemd, zijn kenmerken van deze ziekte. De symptomen die ontstaan bij astma zijn het gevolg van deze kenmerken, voorbeelden van hiervan zijn hoesten, een piepende ademhaling en kortademigheid (Spahn, Covar 2008). Ook zijn astmapatiënten vaak overgevoelig voor factoren zoals rook en mist, waardoor de luchtwegen samentrekken en er kortademigheid ontstaat. Deze samentrekking van de luchtwegen en de daaropvolgende benauwdheid wordt bronchiale hyperreactiviteit (BHR) genoemd (Lemanske, Busse 2010).
Verder zijn astmapatiënten vaak allergisch voor allergenen als gras-‐ en boompollen, kattenharen en huisstofmijt. Wanneer deze allergenen worden geïnhaleerd komen ze in aanraking met de luchtwegen.
De binnenkant van de luchtwegen is bedekt met het luchtwegepitheel. Wanneer allergenen hiermee in contact komen kan dit een reeks van gebeurtenissen in gang zetten. Het slijmvlies van de luchtwegen kan verdikken, de slijmproductie kan worden verhoogd en ontstekingsreacties kunnen gestart worden.
Het luchtwegepitheel vormt een constante, hoog gereguleerde fysieke barrière, die de eerste lijn van verdediging vervult wanneer deeltjes worden geïnhaleerd. Het is de scheidingslijn tussen het externe en interne milieu. Het epitheel bestaat uit cellen die aan elkaar vast zitten met behulp van ‘tight junctions’
en ‘adherens junctions’, deze cel-‐cel contacten zorgen dankzij hun eigenschappen voor een sterke cel-‐
cel adhesie. Tight junctions vormen een semi-‐permeabele barrière aan de apicale kant tussen twee cellen en voorkomen zo dat opgeloste deeltjes vrij door de intercellulaire ruimtes kunnen diffunderen.
Gelokaliseerd op tight junctions zijn adhesie moleculen Occludine, de Claudines, Zona-‐Occludine 1, 2 en 3 (Nawijn, Hackett et al. 2011). Adherens junctions zijn meer basaal gelokaliseerd dan tight junctions en initiëren cel-‐cel contacten en mediëren maturatie en het behoud van het contact. Adherens junctions bestaan uit adhesie moleculen E-‐cadherine, β-‐catenine en plakoglobine (Hartsock, Nelson 2008).
Communicatie tussen cellen vindt plaats met behulp van gap junctions, welke zijn opgebouwd uit connexines en faciliteren het transport van moleculen tussen naburige cellen (Wiszniewski, Sanz et al.
2007). De cellen waaruit de epitheel laag bestaat zijn op te delen in grofweg vier categorieën: basale cellen, ongedifferentieerde kolomvormige cellen, secretiecellen en trilhaar cellen (Crystal, Randell et al.
2008). Basale epitheel cellen zijn sterk verbonden met het basale membraan door middel van integrines en hemidesmosomen. Communicatie tussen deze cellen en kolomvormige cellen, trilhaarcellen of andere gedifferentieerde cellen vindt plaats via gap-‐junctions die uit connexines bestaan. Basale cellen communiceren onderling niet met elkaar, maar voorzien gedifferentieerde cellen van een krachtige ondersteuning en kunnen voor herstel zorgen wanneer er schade is opgetreden. Basale celen zijn verbonden aan gedifferentieerde cellen door middel van desmosomen (Montefort, Baker et al. 1993).
Gedifferentieerde cellen communiceren door middel van gap-‐junctions, en zitten sterk aan elkaar vast dankzij adherens junctions en tight junctions (Nawijn, Hackett et al. 2011).
Bij astma treedt, zoals genoemd, luchtweg remodellering op, waarbij het luchtweg epitheel aangetast raakt, dit speelt een belangrijke rol bij de pathogenese van deze ziekte. Normaalgesproken zitten epitheelcellen in kolomvorm aan elkaar vast, wat zorgt voor een sterke cel-‐cel adhesie. Bij astma geraken de cellen los van elkaar of los van het basale epitheel cellaag, waardoor ze met slijm opgehoest worden. Als gevolg van deze doorbroken barrière wordt het epitheel meer permeabel voor allergenen.
Hier wordt allergisch sterker op gereageerd.
Het doel van dit onderzoek is om er achter te komen wat de oorzaken zijn van het verliezen van de cel-‐
cel adhesie bij astmapatiënten. Zoals beschreven ontstaan cel-‐cel contacten door tight en adherens junctions en hun adhesie moleculen. In dit onderzoek zal worden gekeken of de eiwitten die belangrijk zijn voor adherens junctions en tight junctions in expressie zijn verlaagd bij mensen met astma en of dit bijdraagt aan een verhoogde gevoeligheid voor allergenen en andere irriterende stoffen. Er zijn ook
signaal moleculen bekend die een belangrijke rol vervullen bij het tot stand brengen of in stand houden van de cel-‐cel adhesie. Tot slot zal worden bekeken wat de gevolgen zijn van het verliezen van de epitheel integriteit en of er een mogelijke therapie is die hier op aangrijpt en of deze therapie beter helpt dan de huidige therapieën.
6 2. Bespreking onderzoeksresultaten
2.1 Abnormaliteiten in het luchtwegepitheel van astmatici
Tot voor kortwerd gedacht dat alleen ontsteking een oorzaak was van het ontstaan van astma. Recente bevindingen bewijzen echter dat een structurele component een bijna net zo belangrijke rol speelt. (Al-‐
Muhsen, Johnson et al. 2011) De structurele componenten van de long beslaan van buiten naar binnen gezien het gladde spierweefsel, het bindweefsel met veel zenuwen en bloedvaten en het luchtwegepitheel met trilharen en slijmcellen. Het luchtwegepitheel vormt normaalgesproken de eerste lijn van verdediging tegen binnendringende pathogenen, geïnhaleerde allergenen of irriterende stoffen.
Bij astmatici zijn meerdere abnormaliteiten in het luchtweg epitheel geobserveerd die niet werden gevonden bij gezonde personen (Bergeron, Al-‐Ramli et al. 2009, Zanini, Chetta et al. 2010b, Boulet, Laviolette et al. 1997). Wat zijn deze abnormaliteiten en wat zijn de gevolgen hiervan voor astmatici?
Remodellering
Bijna 90 jaar geleden gaven Huber en Koessler een beschrijving van luchtweg remodellering. Zij zagen dat er veranderingen optraden in structurele cellen en weefsels van astmatici (Hubert, Koessler et al, 1992). Maar tot voor kort was het niet duidelijk dat deze symptomen bijdroegen aan de pathogenese van astma. Remodellering omvat de structurele veranderingen in de luchtwegen die optreden bij astmatische mensen.
Door Al-‐Mushen et al wordt remodellering beschreven als ‘modificaties van de normale samenstelling en structurele organisatie van een bepaald weefsel, die optreden als respons op mechanische of fysiologische vormen van stress’ (Al-‐Muhsen, Johnson et al. 2011). Zij bekeken biopten, afkomstig van personen met ernstige astma, en kleurden deze aan. Ze zagen dat morfologische veranderingen van het epitheel een belangrijk aspect zijn van remodellering (figuur 1). In de luchtwegen van astmatici treden structurele veranderingen op, waaronder een toename van de massa van gladde spiercellen (figuur 1A en 1B, grijze pijlen) en het loslaten van epitheel (figuur 1AB, witte pijl). Ook is er een toename van ECM en het basaalmembraan te zien (voor ECM zie figuur 1C, zwarte pijl). Deze structurele veranderingen worden aangedreven door allerlei cytokines, chemokines en groeifactoren, die worden vrijgegeven door zowel inflammatoire als structurele cellen in het luchtweg weefsel. Ze creëren een complexe signaleringsomgeving. Normaal gesproken vormt het luchtwegepitheel de eerste lijn van verdediging tegen binnendringende pathogenen, geïnhaleerde allergenen of irriterende stoffen. Wanneer echter bovenstaande epitheliale veranderingen optreden raakt deze barrière verstoord waardoor er gemakkelijk allergenen en andere irriterende deeltjes het luchtwegweefsel binnen kunnen dringen. De gevolgen van remodellering zijn blijvende luchtstroom beperking en luchtweg hyperresponsiviteit.
Astmatici ervaren een versnelde afname in longfunctie vergeleken met gezonde subjecten. Dit is proportioneel gerelateerd aan de duur en ernst van de ziekte. (Al-‐Muhsen, Johnson et al. 2011).
Figuur 1 Histopathology of severe asthma. A and B, Bronchial biopsy specimens stained with hematoxylin and eosin at low magnification (Fig 1, A) and higher magnification (Fig 1, B) demonstrate structural alterations of the airway wall in asthma, including epithelial shedding (white arrows) and increased airway smooth muscle mass (gray arrows). C, Severe asthma is also associated with increased subepithelial collagen deposition (red stain; black arrow).
Creola lichaampjes
Ook Yamada et al laten zien dat er indicaties zijn voor beschadigd epitheel bij astmatici. Zij tonen aan dat er Creola lichaampjes te vinden zijn in het sputum van kinderen en dat dit mogelijk een indicatie is voor het ontstaan van astma op latere leeftijd. Creola lichaampjes zijn losgelaten epitheelcellen die alleen te vinden zijn in het sputum van astmapatiënten (Nayada et al). Opgezogen sputum werd onder de microscoop bekeken nadat het was aangekleurd met markers voor Creola lichaampjes of andere celcomponenten. Er werd gekeken naar de associatie tussen sputum Creola lichaampjes (CrBs) en de ontwikkeling van een recidieve piepende ademhaling en astma in post-‐respiratoir syncytieel virus (RSV) bronchiolitis patiënten. De incidentie van een terugkerende piepende ademhaling bij personen tot twee jaar was significant hoger voor de RSV-‐CrB groep dan voor de RSV-‐ non CrB groep. Ook de ontwikkeling van astma op latere leeftijd (tot 5 jaar) was significant hoger bij de RSV-‐CrB groep dan bij de RSV-‐non CrB groep (figuur 2). Uit deze resultaten blijkt dat aan de hand van de aanwezigheid van Creola lichaampjes in het sputum van kinderen een indicatie kan worden gegeven van het risico op het ontstaan van astma (Yamada, Yoshihara 2010). Normaalgesproken zitten epitheelcellen goed vast aan het basale membraan, maar bij astmatici niet. Doordat het epitheel in astma deze eigenschap heeft verloren, worden er bij kinderen met aanleg voor astma wel Creola lichaampjes gevonden in het sputum, maar bij gezonde subjecten niet (Ordonez, Khashayar et al. 2001).
Het muciliaire systeem
Het muciliaire systeem, bestaande uit trilhaarcelen en mucus-‐secreterende slijmbekercellen, zorgt normaal gesproken voor een constant omwentelende laag van beschermend slijm die het luchtwegepitheel bedekt (Boucherat, Boczkowski et al. 2013). Deze voorkomt dat pathogene deeltjes en allergenen de luchtwegwand penetreren. Het epitheel wordt omringd door een luchtweg oppervlakte vloeistof en een slijmlaag. Dankzij deze vloeistof wordt een omgeving gecreëerd waarin de cilia kunnen trillen met een frequentie van 11 tot 14 Hz (Thomas, Rutman et al. 2010). Dankzij dit ritme kan de slijmlaag die boven de oppervlaktevloeistof ligt verwijderd worden, wat van essentieel belang is voor de pulmonaire verdediging. Wanneer er schade optreedt aan het luchtweg epitheel en ciliaire dysfunctie optreedt, heeft dit een verslechterde mucociliare klaring tot gevolg. Dit kan leiden tot een verhoogde
Figuur 2: Prevalentie van terugkerende piepende ademhaling met/zonder Crb in RSV bronchiolitis groep. Open kolom geeft RSV-‐non CrB groep weer;
gesloten kolom geeft RSV-‐CrB groep weer. RSV bronchiolitis met CrB had een significant hogere hoeveelheid dan die zonder CrB. *p < 0.05, **p <
0.01.
8
Figure 3. Microfoto’s van representatieve histologische secties van endobronchiale biopten van een gezond persoon (links) en een persoon met astma (rechts). De biopten werden genomen van de grote centrale luchtwegen, gefixeerd in 4%
paraformaldehyde, ingesloten in glycomethacrylaat, gesneden in 2 mm secties en achtereenvolgens gekleurd met Alciaan blauw, periodisch zuur – Schiff reagent, en hematoxyline.
Mucine opslag in slijmbekercellen worden weergegeven als blauw en paarse kleuring. De secties laten verhoogd Alciaan blauw zien en PAS kleuring in de sectie van de persoon met astma. Originele magnificatie: 3200
gevoeligheid voor infectie en inflammatie. Dat deze schade ook daadwerkelijk optreedt, laten Thomas et al. zien met monsters van cilia die werden bekeken onder een transmissie elektronen microscoop (figuur 2A en 2B). Figuur 2A laat normale cilia van één trilhaarcel zien van een gezonde persoon en figuur 2B cilia van één trilhaarcel van een persoon met ernstige astma. De cilia bij de persoon met ernstige astma zijn gedesoriënteerd. In figuur 2a en 2b zijn duidelijke verschillen in oriëntatie te zien: bij gezonde subjecten lopen de lijnen parallel, maar dit is niet het geval bij astma. De combinatie van gedesoriënteerde cilia en de veranderde verdeling van de cilia kan bijdragen aan verminderde mucociliaire klaring. De combinatie van verslechterde mucociliaire klaring en infectie kan volgens Thomas et al. leiden tot bronchiectasis. Ondanks dat bronchiectasis en astma twee ziekten zijn met verschillende pathofysiologische processen, bestaat er bewijs dat deze twee ziekten tegelijk voor kunnen komen, voornamelijk bij hen met ernstige astma. En er zijn studies die suggereren dat subjecten met astma vatbaarder zijn voor bronchiectasis (Ip, So et al. 1992, Gupta, Siddiqui et al. 2009).
Naast een verslechterde muciociliaire klaring kan ook een verhoging van het aantal slijmbekercellen in het astmatisch epitheel, genaamd hyperplasie, leiden tot een verhoogde hoeveelheid mucus in de luchtwegen. Dit is het geval bij milde en ernstige astma, maar bij ernstige astma is de hyperplasie sterker (Ordonez, Khashayar et al. 2001). Er zijn endobronchiale biopten genomen van een gezonde persoon en een persoon met astma die dit aantonen. Hieruit bleek dat de hoeveelheid opgeslagen mucine bij personen met astma drie keer zo hoog is als bij gezonde personen. Deze resultaten waren vergelijkbaar, ongeacht het feit of het volume van epitheel cellen of de oppervlakte van de basale lamina werd gebruikt als referentie (tabel 1). Ook werd geconstateerd dat het volume van het epitheel gelijk is bij gezonde personen en personen met astma, dit geeft aan dat er van epitheelhypertrofie geen sprake was (tabel 1). Aan de hand van deze resultaten werd geconcludeerd dat degranulatie van slijmbekercellen een mogelijk mechanisme kan weergeven voor verergering van astma en dat chronische degranulatie van slijmbekercellen bij kan dragen aan luchtwegvernauwing bij ernstige astma (Ordonez, Khashayar et al. 2001).
Figuur 2: Dwarsdoorsnede afbeelding van cilia van één enkele trilhaar cel van een gezonde controle (A), die normale ciliaire verdeling laat zien en van een patiënt met ernstig astma (B) die ciliaire disoriëntatie laat zien. . a and b:
distributie van lijnen, parallel aan het centrale paar microtubuli getekend, van cilia van één enkele trilhaarcel.
Interene schaal = 100 nm
Aan het begin van dit hoofdstuk werd de vraag gesteld welke abnormaliteiten in het luchtwegepitheel worden geobserveerd bij astmatici. In de eerste plaats geven de Creola lichaampjes, die vrij gemakkelijk gevonden worden in het sputum van astmatici, een eerste indicatie dat er iets mis is met epitheelcellen Ook veranderingen in het mucociliaire systeem dragen bij aan abnormaliteiten in het luchtwegepitheel.
Doordat de cilia in hoeveelheid verminderd zijn kan de opruimfunctie die ze normaal gesproken vervullen niet goed worden uitgevoerd waardoor het slijm in de longen niet wordt afgevoerd. Het aantal toegenomen slijmbekercellen in het epitheel draagt hier ook aan bij. De hoeveelheid opgeslagen en gesecreteerd slijm is groter bij mensen met ernstige astma. Al deze abnormaliteiten zorgen ervoor dat het epitheel niet functioneert zoals het normaal zou doen; er treedt een barrière defect op, wat de integriteit van het epitheel verlaagt.
2.2 Tight junctions en adherens junctions
Epitheelcellen zijn met elkaar verbonden door tight junctions en adherens junctions. Dit zorgt normaalgesproken voor een sterke cel-‐cel adhesie. Defecten in tight junction en adherens junction eiwitten kunnen veranderingen veroorzaken in epitheel morfologie en integriteit, en kunnen mogelijk leiden tot het sneller ontstaan van ontstekingen (de Boer, Sharma et al. 2008). Zijn tight en adherens junctie eiwitten in expressie verlaagd bij mensen met astma en draagt dit bij aan een verhoogde gevoeligheid voor allergenen en andere irriterende stoffen?
Tight junctions
De componenten waaruit de juncties bestaan zijn de transmembraan tight junction eiwitten (Occludine, de Claudines, ZO-‐1 en ZO-‐2) en de adherens junction eiwitten (E-‐cadherine, α-‐catenine, β-‐catenine en plakoglobine). De epitheliale expressie van deze componenten bij non-‐astmatici en astmatici in onderzocht door de Boer et al. met behulp van immuunhistochemie. Uit de resultaten kwam naar voren dat α-‐catenine expressie significant verlaagd was bij subjecten met astma ten opzichte van non-‐
astmatici. Dit was omgekeerd gecorreleerd aan de hoeveelheid eosinofielen in het epitheel. Ook ZO-‐1 en E-‐cadherine expressie waren significant verlaagd bij astmatici. Er werd geen verschil gevonden in β-‐
catenine expressie. Deze resultaten suggereren dat er overall gezien een lagere expressie van α-‐
Healthy Asthma
Volume of mucin per surface area 0.005 ± 0.001 0.015 ± 0.003† of basal lamina (Vsmuc,bl, mm3/mm2)
Volume of mucin per volume of 0.054 ± 0.008 0.16 ± 0.03†
epithelium (Vvmuc,epi)
Volume of goblet cells per surface area 0.005 ± 0.001 0.016 ± 0.003† of basal lamina (Vsgob,bl, mm3/mm2)
Volume of goblet cells per volume of 0.061 ± 0.009 0.167 ± 0.03†
epithelium (Vvgob,epi)
Volume of goblet cell 1.99 ± 0.34 2.18 ± 0.05
(Vgob, ×10−6 mm3)
Number of goblet cells per volume 41,959 ± 9,230 93,043 ± 15,824† of epithelium (Nvgob, epi, no./mm3)
Volume of epithelium per surface area 0.087 ± 0.004 0.094 ± 0.003 of basal lamina (Vsepi,bl, mm3/mm2)
Tabel 1. Morfometrische metingen in het luchtwegeiptheel van gezonde personen en personen met astma. *Data are mean ± SD.†Significantly greater than healthy, p < 0.005.
10 catenine, ZO-‐1 en E-‐cadherine in patiënten met astma te vinden is, en dat dit bijdraagt aan een defecte luchtweg epitheliale barrière en een hogere influx van eosinofielen in het epitheel (de Boer, Sharma et al. 2008). Kan een verlaagde expressie van deze eiwitten ook functionele gevolgen hebben op de barrière functie? Holgate et al. tonen aan met behulp van immuunhistochemie dat tight junctions bij astma ernstig zijn verstoord (figuur 7). Vergeleken met epitheelcellen van gezonde controle personen, kunnen die van astmapatiënten in vitro en gedifferentieerd op een lucht-‐vloeistof interface, geen tight junctions meer vormen. De transepitheliale weerstand over de gedifferentieerde epitheelcel culturen is sterk verlaagd, wat wijst op meer lekken en dus een verminderde barrière functie. Apicale blootstelling van astmatische cel culturen aan bepaalde irriterende deeltjes, zoals tabaksrook, toonde een nog verdere daling in transepitheliale weerstand. Dit gebeurde bij nog veel lagere concentraties dan de concentraties die nodig waren om een gelijke respons op te wekken bij gedifferentieerd normaal epitheel (Holgate et al, 2007).
Door Xiao et al. werden deze bevindingen in vivo bevestigd. Zij vinden een verstoring van tight junctions zowel in vitro als in vivo. Lokalisatie van tight junctions werd bekeken in bronchiale biopten rechtstreeks uit de patiënten en gedifferentieerde bronchiale epitheelculturen met behulp immunostaining of elektronen microscopie. Er werd een verlaagde tight junction vorming en transepitheliale elektrische weerstand gevonden bij astmatici ten opzichte van gezonde controles. Verder controleren tight junctions ook de permeabiliteit van ionen en opgeloste stoffen (Cereijido, Gonzalez-‐Mariscal et al.
1988). Vanwege deze eigenschap werd ook de relatie tussen de transepitheliale elektrische weerstand en de passage van 4-‐kDa en 20-‐kDA met fluoresceïne gemerkte dextrans gemeten. Dit gebeurde over de gedifferentieerde epitheellaag in vitro. De permeabiliteit en de transepitheliale elektrische weerstand bleken sterk aan elkaar gerelateerd te zijn. Ook waren de epitheliale celculturen van astmatici als groep meer permeabel voor macromoleculen dan die van non-‐astmatici. Er werd echter wel een lagere permebabiliteit gevonden voor 20kDa dextrans, wat aangeeft dat de allergenen die door de luchtweg barrière heen willen relatief klein moeten zijn (Xiao, Puddicombe et al. 2011). Xiao et al hebben ook gekeken naar een eventuele therapie. Ze vonden dat epidermal growth factor de vorming van basale tight junctions verbetert bij astmatische subjecten, en ook dat deze factor beschermt tegen barrière verstoring die door sigarettenrook geïnduceerd wordt. Uit de resultaten werd geconcludeerd dat er bij astmatici beschadiging van de bronchiale epitheliale barrière ontstaat, die de integriteit van het epitheel aantast. Dit kan ervoor zorgen dat allergenen en andere stoffen het luchtwegweefsel kunnen passeren, wat kan leiden tot immuun activatie (Xiao, Puddicombe et al. 2011, Xiao, Puddicombe et al. 2011).
Figuur7.
Immunofluorescentie confocalle
microscoptie van brionchiale biopted van een normale (links) en een astmatische (rechts) luchtweg. De sectie is gekleurd met een antilichaam dat het TJ eiwit ZO-‐1 aankleurt, de kernen zijn rood.
Let op het missen van TJ organisatie in het astmatische epitheel wanneer er naar de horizontale en verticale vlakken wordt gekeken.
Adherens junctions
Tussen tight en adherens junctions vindt crosstalk plaats. Taddei et al laten zien dit gebeurt via vasculaire E-‐cadherine expressie en clustering, wat nodig is voor claudine-‐1 upregulatie. Claudine-‐1 is een tight junction eiwit, dat zorgt voor cellulaire organisatie en permeabiliteit controle. De upregulatie werd gecontroleerd in VE-‐cadherine-‐nul muizen en wild type muizen die VE-‐cadherine postief waren. Bij de nul muizen werd geen volledige upregulatie van claudine-‐1 gevonden. Normaal gesproken zorgt VE-‐
cadherine voor vasculaire permeabiliteit in vivo en in vitro, maar bij claudine-‐5 knock-‐out muizen werd dit effect teniet gedaan. Deze resultaten tonen aan dat er crosstalk plaats vindt tussen tight en adherens junctions (Taddei, Giampietro et al. 2008). Hierboven staat al beschreven wat er gebeurt met de expressie van tight junction eiwitten in astmatici. Welke defecten treden er op in adherens junctions eiwitten van astmatici en dragen deze bij aan verstoring van de epitheliale barrière?
Het eiwit dat hierbij een belangrijke rol speelt is E-‐cadherine (Hackett, Singhera et al. 2011). Zoals de Boer et al reeds bevonden is de expressie bij astmatici hiervan verlaagd. Dit is bevestigd door Hackett et al. Zij keken naar de directe expressie van E-‐cadherine bij astmatici en gezonde subjecten. Dit werd gedaan met behulp van met air-‐liquid interface culturen in vitro en immunohistochemie luchtweg biopten in vivo. Deze methode is meer accuraat dan de methode die door de Boer et al werd gebruikt.
Uit de resultaten kwam naar voren dat er zowel in vitro al in vivo een verlaagde expressie van E-‐
cadherine bij astmatici te vinden is. E-‐cadherine is essentieel voor epitheel integriteit en morfogenese door middel van de initiatie en vorming van adherens junctions (Hackett, Singhera et al. 2011). Dragen ook defecten van adherens junctions bij aan verstoring van de epitheliale barrière?
Een antwoord hier op wordt gegeven door een zeer recent onderzoek van Hackett et al (Hackett, de Bruin et al. 2013). Zij tonen dit aan aan de hand van caveoline-‐1, een component waarvan bekend is dat het adherens junctions stabiliseert (Lajoie, Nabi 2010, Miotti, Tomassetti et al. 2005). Bij astmatici, ten opzichte van non-‐astmatici, wordt een significante verlaging van caveoline-‐1 membraan expressie gevonden. Een verlaagde caveoline-‐1 expressie ging samen met het verlies van junctioneel E-‐cadherine en β-‐catenine expressie en een verstoorde barrière functie. Dit suggereert dat een verlaging van caveoline-‐1 expressie van grote bijdrage kan zijn voor barrière dysfunctie.
E-‐cadherine, ZO-‐1 en β-‐catenine
E-‐cadherine en ZO-‐1 zijn dus belangrijke componenten van adherens junctions en tight junctions, en bij subjecten met astma is de expressie hiervan van verlaagd. E-‐cadherine is een type 1 cadherine transmembraan glyco-‐eiwit. Met behulp van E-‐cadherine zorgen adherens junctions ervoor dat aangrenzende cellen met elkaar verbonden worden en initiëren de vorming en maturatie van cel-‐cel contacten. E-‐cadherine bestaat uit een extracellulair domein dat homotypische, calcium-‐afhankelijke adhesies tussen epitheelcellen vormt en uit een hoog geconserveerde cytoplasmische staart. Verlies van junctionele E-‐cadherine expressie blijkt een cruciale stap te zijn bij epitheliale mesenchymale transitie (EMT) (Nawijn, Hackett et al. 2011). Over het proces van EMT is bekend dat het een rol spelt in cellulaire differentiatie tijdens ontwikkeling en tumor invasie (Thiery 2002). Nog niet eerder was onderzocht of er ook EMT plaatsvindt in het luchtwegepitheel. Dit is gedaan door Hackett et al, met behulp van primaire luchtweg cellen (AECs). AEC culturen van astmatici en non-‐astmatici werden behandeld met TGF-‐β1 om EMT te induceren. Dit is gelukt bij AECs van zowel astmatici als non-‐astmatici, maar de hoeveelheid cellen die EMT ondergingen bij astmatici was groter. EMT werd gekarakteriseerd door veranderingen in de morfologie van de cel, waaronder verlies van E-‐cadherine en ZO-‐1. Deze resultaten ondersteunen het feit dat het luchtwegepitheel een veranderd epitheliaal reparatie fenotype laat zien. Dit zou kunnen resulteren uit voortdurende schade aan het epitheel of een ongereguleerd differentiatie profiel. Maar hoe deze veranderingen in het epitheliaal fenotype de progressie van de ziekte kunnen beïnvloeden, is nog onbekend (Hackett, Warner et al. 2009).
12 Dat de expressie van E-‐cadherine bij astmatici verlaagd is, is duidelijk. Maar welk signaleringsproces ondergaat dit molecuul en welke functie wordt oefent het uit? In epitheelcellen vindt ubiquitinatie plaats van E-‐cadherine, dat zorgt voor clathrine-‐gemedieerde endocytose en degradatie door de endocytotische machine. Hierdoor kunnen epitheel cellen adherens junctions remodelleren en recyclen om zo de weefselstructuur te controleren. Associatie van de cytoplasmische staart van E-‐cadherine met β -‐catenine is essentieel voor effectieve junctionele lokalisatie. Bij intacte adherens junctions wordt de cellulaire beschikbaarheid van β-‐catenine beperkt door E-‐cadherine. Dit is opvallend, omdat in het onderzoek van de Boer et al wel een verminderde E-‐cadherine expressie werd gevonden, maar niet van β-‐catenine. Vrij β-‐ catenine kan naar de kern transloceren en associeren met de transcriptie factor TCF/LEF-‐1 om transcriptie te activeren van genen waarvan bekend is dat ze een rol spelen bij astma. Dit zijn bijvoorbeeld genen die betrokken zijn bij weefsel reparatie (bijv. EGFR en CD44), luchtweg remodellering (VEGF, MMP-‐2, MMP-‐7 en MMP-‐9) en inflammatoire responsen (bijv. cyclooxygenase-‐2, IL-‐6, IL-‐8 en periostine). Ook is bekend dat β-‐catenine cellen in een ongedifferentieerd fenotype houdt en slijmbekercel hyperplasie promoot.
Het is dus duidelijk dat E-‐cadherine en β-‐catenine een centrale rol in epitheelschade. Nawijn et al.
stellen dat onderzoek in conditionele Chd1 (E-‐cadherine) knock out muizen verder inzicht zal geven in het verbeteren van de ernst van de ziekte of progressie bij mensen, gebaseerd op de rol die het speelt in epitheliale adhesie, integriteit, reparatie en immunomodulatie (Nawijn, Hackett et al. 2011).
Aan de hand van bovenstaande aspecten is de vraag te beantwoorden die aan het begin van dit hoofdstuk gesteld werd: Zijn tight en adherens junctie eiwitten in expressie verlaagd bij mensen met astma en draagt dit bij aan een verhoogde gevoeligheid voor allergenen en andere irriterende stoffen? E-‐
cadherine, ZO-‐1 en β-‐catenine zijn in mindere hoeveelheid aanwezig bij astmatici en door meerdere onderzoeken is bewezen dat tight en adherens junctie eiwitten inderdaad in expressie verlaagd zijn. De weerstand van het epitheel raakt hierdoor verlaagd waardoor het meer gevoelig wordt voor allergenen die gemakkelijker binnen kunnen dringen. Dit draagt bij aan verstoringen van de luchtweg barrière. Het is duidelijk geworden wat de rol is van E-‐cadherine en β-‐catenine is, en van welk belang dit is voor het in stand houden van de cel-‐cel adhesie Normaal gesproken wordt met behulp van junctions en de componenten er van gezorgd voor een sterke barrière. Deze komen echter allemaal verlaagd tot expressie, waardoor de barrière sterkte afneemt en er zwakkere cel-‐cel adhesie in het epitheel te vinden is.
3. Discussie
Het oorspronkelijke beeld van astma bestond er uit dat voornamelijk een inflammatoire component de pathogenese van astma veroorzaakt, maar recentelijk is naar voren gekomen dat er een structurele component is die een net zo belangrijke rol speelt. Dat is in dit onderzoek bevestigd. De oorzaken van een verstoorde cel-‐cel adhesie in het luchtwegepitheel bij astma zijn onderzocht, waarbij werd gekeken naar de abnormaliteiten in het luchtwegepitheel en de verlaagde expressie van tight en adherens junctions.
De abnormaliteiten die in het luchtwegepitheel werden geobserveerd bij astmatici zijn omvangrijk. Er bestaat veel data over en er wordt nog steeds volop onderzoek verricht. Echter, niet voor alle aspecten die in dit onderzoek behandeld zijn geldt dit. Zo is er bijvoorbeeld niet veel te vinden over de relatie tussen Creola lichaampjes en astma. Er bestaat niet veel vergelijkingsmateriaal en in het onderzoek wordt vaak gerefereerd naar eigen onderzoeken die eerder zijn verricht. Hierdoor is het lastig om de resultaten te bevestigen. Maar het constateren van Creola lichaampjes in het sputum is niet moeilijk.
Onder de microscoop zijn ze gemakkelijk te zien en ze geven een duidelijke indicatie van dat er problemen zijn met het luchtwegepitheel. Wat echter nog wel door Yamada et al. wordt toegegeven is dat deze epitheliale veranderingen niet karakteristiek zijn voor astma, en dat ze ook kunnen gevonden worden bij patiënten met andere pathologische condities van de long (Yamada, Yoshihara 2010). Ook staat het loskomen van de epitheelcellen ter discussie. Dit zou namelijk het gevolg kunnen zijn van een artefact van de bronchoscopie (Ordonez, Ferrando et al. 2000), maar dit zou nog steeds een zwakkere hechting van epitheelcellen aan basale cellen of het basale membraan bij astmatici weergeven (Ordonez, Khashayar et al. 2001). Wanneer er daadwerkelijk in de longen naar het epitheel wordt gekeken komt er nog meer aan het licht, namelijk dat het mucociliaire systeem duidelijke abnormaliteiten laat zien (Thomas, Rutman et al. 2010). De hoeveelheden cilia zijn verlaagd, waardoor de mucussecretie verhoogd is. Een verhoogde expressie van slijmbekercellen draagt hier ook aan bij.
Uit de onderzoeken van Xiao en Hackett (2011) is naar voren gekomen in hoeverre tight junctions en adherens junctions aangedaan zijn bij astmapatiënten. Zowel de expressie van tight als adherens junction eiwitten is verlaagd. De belangrijkste componenten van de junctions, E-‐cadherine, β-‐catenine en caveoline-‐1 bevestigen dit en staan in verband met elkaar. Zoals Hackett et al. met hun onderzoek uit 2013 lieten zien ging een verlaging van caveoline-‐1 membraan expressie samen met een verlaging van E-‐
cadherine en β-‐catenine expressie. Caveoline speelt een cruciale rol bij de instandhouding van de cel-‐cel adhesie in het luchtwegepitheel (Hackett, de Bruin et al. 2013). Bij een verlaging van deze componenten gaat de barrière functies dus deels verloren.
Aan de hand van bovenstaande aspecten valt te concluderen dat er vele oorzaken zijn die bijdragen aan een verstoorde cel-‐cel adhesie bij astmapatiënten, waarbij vooral gefocust is op de abnormaliteiten in het epitheel en een verlaagde expressie van tight en adherens junctions. Maar welke implicaties heeft dit voor astmapatiënten? Er moet een therapie bedacht worden die zich meer richt op het voorkomen van astma in plaats van op het onderdrukken van symptomen. Huidige therapieën onderdrukken ontstekingen en zorgen voor relaxatie van gladde spieren. Maar de abnormaliteiten in de structuur en functie van het epitheel kunnen een nieuwe kijk geven op de pathogene van de ziekte. Er zijn ook een aantal genen geïdentificeerd die verder bewijs geven dat de oorzaken van astma in het epitheel liggen en niet per se in immuun of inflammatoire trajecten (Holloway, Koppelman 2007). Deze aspecten kunnen bijdragen aan een nieuwe aanpak van het voorkomen en behandeling van de ziekte. Maar omdat tot nog niet heel lang geleden werd gedacht dat alleen een inflammatoire component de ziekte astma veroorzaakt, zal het nog een tijd duren voordat er een therapie ontwikkeld wordt die juist aangrijpt op de structurele component.
14 4. Referenties
AL-‐MUHSEN, S., JOHNSON, J.R. and HAMID, Q., 2011. Remodeling in asthma. The Journal of allergy and clinical immunology, 128(3), pp. 451-‐62; quiz 463-‐4.
BERGERON, C., AL-‐RAMLI, W. and HAMID, Q., 2009. Remodeling in asthma. Proceedings of the American Thoracic Society, 6(3), pp. 301-‐305.
BOUCHERAT, O., BOCZKOWSKI, J., JEANNOTTE, L. and DELACOURT, C., 2013. Cellular and molecular mechanisms of goblet cell metaplasia in the respiratory airways. Experimental lung research, 39(4-‐5), pp.
207-‐216.
BOULET, L.P., LAVIOLETTE, M., TURCOTTE, H., CARTIER, A., DUGAS, M., MALO, J.L. and BOUTET, M., 1997. Bronchial subepithelial fibrosis correlates with airway responsiveness to methacholine. Chest, 112(1), pp. 45-‐52.
CEREIJIDO, M., GONZALEZ-‐MARISCAL, L. and CONTRERAS, R.G., 1988. Epithelial tight junctions. The American Review of Respiratory Disease, 138(6 Pt 2), pp. S17-‐21.
CRYSTAL, R.G., RANDELL, S.H., ENGELHARDT, J.F., VOYNOW, J. and SUNDAY, M.E., 2008. Airway
epithelial cells: current concepts and challenges. Proceedings of the American Thoracic Society, 5(7), pp.
772-‐777.
DE BOER, W.I., SHARMA, H.S., BAELEMANS, S.M., HOOGSTEDEN, H.C., LAMBRECHT, B.N. and
BRAUNSTAHL, G.J., 2008. Altered expression of epithelial junctional proteins in atopic asthma: possible role in inflammation. Canadian journal of physiology and pharmacology, 86(3), pp. 105-‐112.
GUPTA, S., SIDDIQUI, S., HALDAR, P., RAJ, J.V., ENTWISLE, J.J., WARDLAW, A.J., BRADDING, P., PAVORD, I.D., GREEN, R.H. and BRIGHTLING, C.E., 2009. Qualitative analysis of high-‐resolution CT scans in severe asthma. Chest, 136(6), pp. 1521-‐1528.
HACKETT, T.L., DE BRUIN, H.G., SHAHEEN, F., VAN DEN BERGE, M., VAN OOSTERHOUT, A.J., POSTMA, D.S. and HEIJINK, I.H., 2013. Caveolin-‐1 Controls Airway Epithelial Barrier Function: Implications for Asthma. American journal of respiratory cell and molecular biology, .
HACKETT, T.L., SINGHERA, G.K., SHAHEEN, F., HAYDEN, P., JACKSON, G.R., HEGELE, R.G., VAN EEDEN, S., BAI, T.R., DORSCHEID, D.R. and KNIGHT, D.A., 2011. Intrinsic phenotypic differences of asthmatic epithelium and its inflammatory responses to respiratory syncytial virus and air pollution. American journal of respiratory cell and molecular biology, 45(5), pp. 1090-‐1100.
HACKETT, T.L., WARNER, S.M., STEFANOWICZ, D., SHAHEEN, F., PECHKOVSKY, D.V., MURRAY, L.A., ARGENTIERI, R., KICIC, A., STICK, S.M., BAI, T.R. and KNIGHT, D.A., 2009. Induction of epithelial-‐
mesenchymal transition in primary airway epithelial cells from patients with asthma by transforming growth factor-‐beta1. American journal of respiratory and critical care medicine, 180(2), pp. 122-‐133.
HARTSOCK, A. and NELSON, W.J., 2008. Adherens and tight junctions: structure, function and connections to the actin cytoskeleton. Biochimica et biophysica acta, 1778(3), pp. 660-‐669.
HOLGATE, S.T.., 2008. The airway epithelium is central to the pathogenesis of asthma. Allergol. Int, 57(1), pp. 1-‐10.
HOLLOWAY, J.W. and KOPPELMAN, G.H., 2007. Identifying novel genes contributing to asthma pathogenesis. Current opinion in allergy and clinical immunology, 7(1), pp. 69-‐74.
IP, M.S., SO, S.Y., LAM, W.K., YAM, L. and LIONG, E., 1992. High prevalence of asthma in patients with bronchiectasis in Hong Kong. The European respiratory journal, 5(4), pp. 418-‐423.
LAJOIE, P. and NABI, I.R., 2010. Lipid rafts, caveolae, and their endocytosis. International review of cell and molecular biology, 282, pp. 135-‐163.
LEMANSKE, R.F.,JR and BUSSE, W.W., 2010. Asthma: clinical expression and molecular mechanisms. The Journal of allergy and clinical immunology, 125(2 Suppl 2), pp. S95-‐102.
MASOLI, M., FABIAN, D., HOLT, S., BEASLEY, R. and GLOBAL INITIATIVE FOR ASTHMA (GINA) PROGRAM, 2004. The global burden of asthma: executive summary of the GINA Dissemination Committee report.
Allergy, 59(5), pp. 469-‐478.
MIOTTI, S., TOMASSETTI, A., FACETTI, I., SANNA, E., BERNO, V. and CANEVARI, S., 2005. Simultaneous expression of caveolin-‐1 and E-‐cadherin in ovarian carcinoma cells stabilizes adherens junctions through inhibition of src-‐related kinases. The American journal of pathology, 167(5), pp. 1411-‐1427.
MONTEFORT, S., BAKER, J., ROCHE, W.R. and HOLGATE, S.T., 1993. The distribution of adhesive
mechanisms in the normal bronchial epithelium. The European respiratory journal, 6(9), pp. 1257-‐1263.
NAWIJN, M.C., HACKETT, T.L., POSTMA, D.S., VAN OOSTERHOUT, A.J. and HEIJINK, I.H., 2011. E-‐cadherin:
gatekeeper of airway mucosa and allergic sensitization. Trends in immunology, 32(6), pp. 248-‐255.
ORDONEZ, C., FERRANDO, R., HYDE, D.M., WONG, H.H. and FAHY, J.V., 2000. Epithelial desquamation in asthma: artifact or pathology? American journal of respiratory and critical care medicine, 162(6), pp.
2324-‐2329.
ORDONEZ, C.L., KHASHAYAR, R., WONG, H.H., FERRANDO, R., WU, R., HYDE, D.M., HOTCHKISS, J.A., ZHANG, Y., NOVIKOV, A., DOLGANOV, G. and FAHY, J.V., 2001. Mild and moderate asthma is associated with airway goblet cell hyperplasia and abnormalities in mucin gene expression. American journal of respiratory and critical care medicine, 163(2), pp. 517-‐523.
SIMOES, D.C., VASSILAKOPOULOS, T., TOUMPANAKIS, D., PETROCHILOU, K., ROUSSOS, C. and
PAPAPETROPOULOS, A., 2008. Angiopoietin-‐1 protects against airway inflammation and hyperreactivity in asthma. American journal of respiratory and critical care medicine, 177(12), pp. 1314-‐1321.
SPAHN, J.D. and COVAR, R., 2008. Clinical assessment of asthma progression in children and adults. The Journal of allergy and clinical immunology, 121(3), pp. 548-‐57; quiz 558-‐9.
