o
ffi
ÏTLAÀMS ÏMPULSPRO
GRAMMA
NÀTUURONT§t/ïKKELrNG
Effect
van
metaakeroÍrtreiniging
op
de
conditie
vaÍr
eeÍr
inheemse
vispopulatie
in
ecologis
ch
wa,ardevolle
watetlopen
AMINAL/NATUUR/VLINA
/
OO/
04
Aanvangsverslag
november
2000
Unive rsiteit Antwe qpen Instituut voor Natuurbehoud
Universiteit Antrxrerpen (RUCA)
Promotor
:
Dr.
Lieven Bervoets Judith Voets (01.11.00 - )Instituut vo or l{atuurb ehoud partner
1:
Johan Coeck1.
Probleemstelling
Gedurende
de
laatstejaren heeft
de
Vlaamse overheid
inspanningengeleverd
om
dewaterkwaliteit
te
verbeteren.Dit
heeft geleid
tot
een
verbetering
van de
visstand
in Vlaanderen. Nochtansblijkt
uit
recente inventarisatiegegevensdat het
verspreidingsgebiedvan de meeste inheemse vissoorten
nog
steeds bijzonderklein
is (1). In
een aantal gevallenzijn
door het
drastisch terugdringenvan de
organischebelasting
(en
verbeteringvan
dezuurstoflruishouding), andere
stressfactorenopvallender geworden.
Zo
is
in
een
aantalwaterlopen
de
visfauna gedeeltelijk hersteld maar
vorÍnen
micropolluenten een
ernstigebedreiging.
Deze
waterlopen
stromen
soms
door
waardevolle
kleinschaligelandbouwgebieden
of
natuurgebieden.Bovendien
maken
ze
dikwijls
deel
uit
van
een(deelstroom)gebied waar nog zeldzame vissoorten voorkomen.
Hierdoor
is
hetmogelijk
datdeze verontreiniging een belemmering
vormt voor
het herstelof
migratie van deze zeldzame soorten.Het
voorkomenvan
metalenin
het
aquatischmilieu kan
eengrote impact
hebbenop
dewerking van het ecosysteem. De effecten van verontreiniging zijn complex en afhankelijk van een hele reeks factoren. Kwaliteitsnormen voor metalen
zijn
uitsluitend opgesteldvoor
totale gehaltenvan
afzonderlijke metalenin
de omgeving.De
effecten hangen echterin
de eersteplaats af van de dosis warÍaan de organismen worden blootgesteld.
Dit
is niet de concentratiesvan de stoffen aanwezie
in
de omgeving maarwel
de weefselconcentratiesin
het organisme.Deze lichaamsconcentratie
is
aftrankelijk van de biologisch beschikbare concentratievan
destof
in
hetmilieu,
de blootstellingstijd en de snelheid waarmee de stoffen worden opgenomenen
uitgescheiden.
Door
effectente
relateren aan lichaamsconcentratiesin
plaatsvan
aanomgevingsconcentraties
zal
eengroot
deelvan de
enormevariatie
in
effect-concentraties kunnen worden verklaardBlootstelling aan
metalen veroorzaakt eenhele
reeksvan
fysiologische
reacties waarvan sommige het gevolg zijn van de werking van de stof en andere een reactie van het organismeom het effect van de stof te verminderen.
De
lichaamsconcentraties van de meeste essentiële metalen worden gereguleerd binnen nauwe grenzenterwijl dit
voor
de meeste niet-essentiëlemetalen
niet het
geval
is. Indien
de
biobeschikbare concentratiein
het milieu
boven
eenkritisch
niveaustrjgt
is
regulatieniet
meermogelijk en
stapelen de metalenzich
op
in
hetorganisme
(accumulatie).
Ieder individu
beschikt
over
een
aantal fysiologische
enbiochemische instrumenten
om zich,
binnen
bepaalde gÍenzen, aannieuwe
situaties zoalsmetaalverontreiniging, aan
te
passen (acclimatisatie). Bovendienblijken
binnen
populaties1
sommige
individuen zich
beterte
kunnen aanpassendan
anderenen
in
betereconditie
teverkeren.
Dit
leidt
tot
selectievan
bepaalde kenmerken zodat de volgende generaties beteraangepast
zijn
aan
de
nieuwe
omstandigheden (genetische adaptatie).Het
is
nochtansmogelijk
dat
dierendie zich
aan deze omstandigheden hebben aangepast anders (beterof
slechter) kunnen omgaan met een additionele stress.
2. Doelstellingen
De
centrale doelstellingvan
dit
voorstelis
het efïect
nagaanvan
metaalverontreiniging opvispopulaties
in
ecologisch (potentieel) waardevolle waterlopen.
Hiervoor
zal
in
twee geselecteerde studiegebieden de verdeling van metalenin
verschillende compartimenten vanhet
ecosysteem beschrevenworden; m.n. water,
sediment, macro-invertebratenen
organen van drie vissoorten.Voor
eén vissoort, de grondel (Gobio gobio), zal het relatieve belang van blootstellingsroutesvoor
metaalmengsels (water, voedsel, sediment) nagegaan worden. Bovendienzullen
dosis-effect relaties worden bestudeerd en zal nagegaarr worden wat de kritische dosissenzijn
(dosiswaarbij
een bepaaldeffect
optreedt) onder verschillende omstandigheden.EÍfecten
zullenzowel
in
het veld
beschrevenworden
(ecologisch)
als
gemeten
in
het
laboratorium(ffsiologisch).
Vermits
uit
een
vroegere
studie
blijkt
dat
grondel voorkomt
bij
relatief
hoge metaalconcentraties (2) veronderstellen we dat acclimatisatie of zelfs genetische adaptatie eenrol
zal spelenin
deze dosis-effect relaties. Een andere mogelijke verklaring is dat ondanks dehoge omgevingsgehalten, de kritische lichaamsconcentraties niet bereikt
zijn
door een geringe biobeschikbaarheid. Concreet zal de studie bijdragentot
het opstellen van meer gefundeerdewaterlsraliteitsnormen
voor
metaalmengselsen van
gerichte
beheersmaatregelen voorbescherming van vissen m.b.t. metaalverontreiniging in de gekozen studiegebieden.
3.
Onderzoeksstrategie3.1 Studiesoorten
Door
verschillende internationale regelgevende instantieszoals OECD en USEPA
wordeno.a. de karper en
verschillende
zalmachtigenvoorgesteld
als
standaardtest
vissoorten.Nochtans
zijn
deze
soortenweinig
representatiefvoor
stromendewaters
in
Vlaanderen. Daarom werdvoor
het bestuderen van dosis-effect relaties gekozenvoor
een algemene soortvan laaglandbeken: de
grondel.
Grondelis
een benthische soort, enis
dus nauw verbondenmet
het
sediment.Van
grondel
vinden
we
nog relatief grote
populaties,zowel
in
niet verontreinigde waterlopenals
in
waterlopenmet relatief hoge
metaalgehalten.Deze
soort heeft als belangrijk voordeel dat ze relatiefweinig
mobielis
en dus de lokale verontreinigingintegreert. Bovendien gebeuren in het betrokken studiegebied geen visbepotingen.
Verder
zal voor het
bestuderenvan
metaalaccumulatie doorheende
voedselketenook
inorganen gemeten worden van twee andere vissoorten met een verschillende levenswijze,
voor
zoveÍ deze aanwezig zijn
op
de verschillende monsterpunten:
de baars(Percafluviatilis)
ende blankvoorn (Rutilus
rutilus).
Baars
enblankvoorn
komentalrijk
voor
in
de
Vlaamse waterlopen, en worden zelfs nog in waterlopen met relatief hoge metaalgehalten aangetroffen. Baars (vooral de grotere exemplaren) is eenroofiiis,
terwijl
blankvoorn en grondel zich vooral voedenmet
insekÍen en plantaardigmateriaal.
Baars enblankvoorn
zijn
eerder pelagische soorten die minder aan de bodem gebonden zr1n,terwijl
grondel een bodembewonende soortis.
Door
de keuze van de testsoorten worden dus verschillende trofische niveau's enlevens-wijzen (benthisch tegenover pelagisch) in beschouwing genomen.
3.2 Studiegebied
Als
studiegebiedwordt
het stroomgebied van de Scheppelijkse Nete-Molse Nete gekozen. Hetbetreft
eenpotentieel
zeerwaardevol
stroomgebiedvermits de loop nog
zeerrijk is
aannatuurlijke kenmerken. Deze waterloop heeft een
voor
VlaandeÍen zeeÍ zeldzaam meanderendpatroon
met
een zeeÍgrote diversiteit
aan habitatstot
gevolg.Ook
devallei
heeftnog
eensemi-natuurlijk karakter. Bovendien
is
de organische belasting devoorbije
10jaar
drastischgedaald
met
eenvoor
visleven
gunstige zuurstofhuishouding.Uit
vroegere studies echterblijken hier
zeer hoge metaalconcentraties(vnml. Cd
enZn) voor te komen.
Vermits
deMolse Nete
in
open verbinding staat met het stroomgebied van de Grote Nete, waar nog grote populatiesvan
zeeÍ zeldzame vissoorten zoals beekprik, kopvoorn en serpeling voorkomen,fungeert
deze beek als een barriere maaÍ heeft door haarnatuurlijk
karakter nog een enorÍnpotentieel
r;a;arvisfauna
toe.
In
dit
studiegebiedzullen drie
tot
vier
punten geselecteerd worden. Bovendien zal één referentiepunt in hetzelfcle stroomgebied gekozen worden.Vermits conditie
niet
uistluitend door
metaalverontreinigingbepaald zal worden
maaÍ eveneensdoor
andere factoren beïnvloedkan worden
zal
eenbijkomend
monsterpunt met hoge cadmium- en zinkgehalteuit
een ander stroomgebied geïnventariseerd worden.Een mogelijkheid
is
het
stroomgebiedvan
de Dommel.
Dezewaterloop heeft
een zuiverbovenlopensysteem
met nog
waardevolle visfauna(3).
Ook hier
is
de
organische belasting drastisch gedaald gedurendede
voorbije
l0
jaar.
In
het
stroomafinaartse gedeelteloopt
deDommel
door
éénvan de
waardevolste (grensoverschrijdende)heide
natuurgebieden, het Hageven, van Vlaanderen. Enkele kilometersvoor
het natuurreservaatkomefl
zeer hogezink
en cadmium gehalten
voor
in
de Dommel.Dit
vormt
zowelvoor
de aquatische alsvoor
deterrestrische levensgemeenschappen een bedreiging.
3.3
Verdeling van
metalenin
het studiegebied enaccumulatie
in
de levensgemeenschap.Dit
deel van het onderzoek zal uitgevoerd worden door de aanwager.In
een eerste fase zal deverdeling
van
de
metalen
in
het
aquatische ecosysteembestudeerd
worden
op
eengeselecteerd aantal monsterpunten
(zie
studiegebied). Metalenzullen
gemeten wordenin
hetwater,
het
sediment, invertebratenen
in
vissoorten
van
verschillende
trofische
niveaus (grondel, blankvoorn en baars).Metaalgehalten
in
het water zullen
maandelijks bepaaldworden
gedurendede
eerste achtmaanden
van
het
project.
Het
sediment
zal
eenmalig
bemonsterd
worden.
Van
deinvertebraten
zal de
meest dominantegroep
en/of het
belangrijkste
voedselitem wordenonderzocht; hiervoor zal ook de maaginhoud van enkele vissen worden bekeken.
De
metaalgehalten(Ag, Al,
As,
Cd, Co,Cr,
Cu, Fe,Hg,
Ni, Mn,
Pb enZn)
worden bepaald met ICP-MS. Gefilterde (45pm) en niet gefilterde waterstalen worden aangezuurd met HNO3.De
weefsels
worden
gedroogd
bU
60'C
gedurende24
uur
en
in
een
microgolfovengedigesteerd met
HNOr
enHzOz
Vervolgens worden de stalen verdund metMQ
en gemeten met ICP-MS.3.4 Effecten
van
metalen opconditie van
vissen.Populatie-ecologisch
luik :
Conditiein
de veldsituatieDit luik
zal uitgevoerd worden door de partner(IN)
in
samenwerking met de promotor. Op degeselecteerde plaatsen
in
het
studiegebiedzullen
de
visgemeenschappenvia
elektrische visvangstmethodentwee
maal (herfst-lente) bemonsterd worden. Eenuitvoerige
populatie-ecologische
beschrijving
van de
gevangen
soorten
op
de
monsterpunten
zal
wordenuitgevoerd.
De
populatiestructuur (lengte-frequentiedistributie)
en
-grootte
zal
bepaald wordenvoor
alle aanwezige soorten.Hierbij wordt
gebruik gemaakt van de depletiemethode,waarbij
elk
punt
gedurende éen bemonsteringdrie
maalna
elkaarwordt
afgevist(4).
Degevangen
vissen worden
per
vangstbeurt
apafi
in
daarvoor voorziene plastic
tanksbijgehouden.
De
snelheid
waarmeede
vangstgroottedan
afneemt
is
dan
rechtstreeksaftrankelijk van de grootte van de gehele populatie (onbekend) en het aantal gevangen vissen
(gekend).
Deze eigenschap laattoe om
schattingente
makenvan de
populatiedensiteiten.Voor
alle gevangen soorten zal tevens de biomassa berekend worden,waaruit
danvoor
elkbemonsterd
punt de
visindex
zal bepaaldworden.
Voor
alle
gevangenindividuen
zal
delengte-gewicht verhouding bepaald worden om de
individuele
conditiete
kunnen berekenen. Deze verhoudingwordt
gegeven door devergelijking
.
W'-
a*VIj,
waarinW
het gewicht enVL
de
vorklengte
van de
vis
is.
Op
basis
van
de
lengÍe-gewicht verhouding
kunnen verschi llende conditiefactoren berekend worden.Conditiefactoren steunen op de hypothese dat
voor
een bepaalde lengte een zwaarderevis
in een betereconditie verkeert dan
eenlichte
(5)
Een
veel
gebruikte conditiefactor
is
deallometrische conditiefactor '.
ft
-'o!)r*
, waarinb
de regressiecoëfficiënt isuit
delengte-VLO
gewicht
relatievoor
depopulatie.
Verder zal
groei bepaald wordenvia
schubanalyse (5),waarbij de leeftijd van de
vis
wordt
afgelezenvia het
aantaljaarringen
op
de
schub.Vervolgens
kan
dan,
met
behulp
van de
'back calculation'
methodevan
Fraser-Lee, degroeisnelheid van de vissen worden berekend. Tenslo tte
zal
nagegaan wordenin welke
matefluctuerende
asymmetrie
een
bruikbare indicator
is
voor
metaalstress. Fluctuerende asymmetriewordt
gedefinieerd als de random afwijkingen tussen delinker-
en de rechterzijdevan
eennormaal
gesprokenbilateraal
symmetrisch organisme,en
kan
te
wijten
zijn
aangenetische en/of omgevingsinvloeden (6). Hiervoor worden een aantal kenmerken van de vis
tussen linkerkant en rechterkant vergeleken. Deze kenmerken zíjn '.
-
het aantal schubben boven dezijlijn,
beginnend vanaf de eerste schubvoor
de basis van derugvin,
en schuin naar beneden tellendtot
aan dezijlijn.
-
Het aantal vinstralen op delinker-
en rechterbuikvin-
De
hoogÍe en de breedte van devierde
schubop
de zijlljn
(tellendvan
dekop
naar destaart
toe);
dezezullen worden
gemetenmet
behulpvan
eenmicroprojector
(Heerbrug projectina type 40AZ)Het laatste kenmerk bleek reeds bruikbaar om grondelpopulaties van elkaar te onderscheiden
(7)
Fysiologische Conditie
Voor het
bepalenvan de
fysiologische conditie van
verschillende populatieszullen
niet-invasieve testengebruikt worden
waarbij de
nadruk gelegd
wordt
op
zwemcapaciteit enzuurstofconsumptie.
Zowel
vissen afkomstig van niet-verontreinigde en sterk verontreinigde plaatsen als vissen blootgesteldin
het
laboratoriumworden
getest. Volgende testen zullen uitgevoerd worden:Zwemcapaciteit
Naar analogie met de sportfusiologie zal de conditie van de vis geëvalueerd worden door hem
te
onderwerpenaan een
inspanningsproef (zwemmen).De
volgende
kenmerken wordengeëvalueerd:
(a)
Sprinten:de
capaciteitom
gedurende eenkorte
tijd
bij
hoge
snelheid tezwemmen;
(b)
Langdurig
zwemmen:de
capaciteitom
enkele urenbij
normale snelheid tezwemmen;
(c)
Kritische
zuurstofconcentratietijdens
zweminspanning:hierbij
wordt
delaagste zuurstofconcentratie bepaald waarbtj de vis nog
in
staat isom zijn
anurstofuerbruik oppeil
te
houden.Hiervoor
zijn
I
respirometers(fïg.
l)
beschikbaar die toelaten om vissenbij
verschillende snelheden te laten zwemmen (8).
ingang electroden pomp
frequentie-regelaar
Figuur
I
:
Schematische voorstelling van eenrespirometer.
Depijlen
geven derichting
aanvan de waterstroom, de
stippellijntjes
stellen membranenvoor
die ervoor
zorgendat
de vis nietuit
de binnenste buis kan zwemmen.Deze respirometers
zijn
opgebouwduit
twee
plexiglazenbuizen.
De binnenstebuis
isvoor-en achteÍaan begrvoor-ensd door twee membranen, zodat water ongehinderd kan doorstromen. De
vis
bevindt
zichtijdens het
experimentin
de binnenstebuis.
De
buitenstebuis
is
vooÍaanbegrensd
door
een circulatiepomp, en achteraandoor
een plexiglazendeksel.
Bovenop debuitenste
buis
bevinden
zich twee
openingen,waarin
een
zuurstofelektrodekan
wordengeplaatst.
Met
behulp van een frequentieregelaar kan de stroomsnelheid worden geregeld tothet gewenste niveau.
De
zuremcapaciteit (zowel omte
sprinten als om langdurigte blijven
zwemmenbij
normalesnelheid)
zal worden
bepaaldvoor
drie
populaties. Bovendien
zullen
per
populatie
deallometrische relaties worden nagegaan door vissen van verschillende groottes
te
gebruiken.Respiratie zal worden bestudeerd door de vissen gedurende enkele uren tegen een bepaalde snelheid
te
laten zwemmenin
een van de atmosfeer afgesloten systeem,waarbij
met behulpvan
zuurstofelektrodes
verbonden
met
een
computer
voor
automatische
registratie(WINDMILL
4.06 software), de zuurstofconcentraties in het water worden gemeten.Zuurstofbeschikbaarhe-id
voor
de weefselsBlootstelling
aan metalen veroorzaal<t veelal problementer
hoogte van de kieuwen waardoorzowel
respiratie
als ion- en
waterhomeostasevan het
organismein
het
gedrang kunnenfysiologie van het dier met
eenuiteindelijke
weerslagop
zijn
groei
enreproductie.
Het
isdaarom
belangrijk inzicht
te
hebbenin
de
hoeveelheidzuurstof
waarover
de
weefselsuiteindelijk
zullen kunnen beschikken. Het is immersduidelijk
dat niet enkel het opladen vanHemoglobine
(Hb)
met zuurstofin
het gedrangkomt
door verminderde zuurstofcliffusie terhoogte
van het
beschadigdkieuwepitheel maar
dat
daarenbovendiverse
wijzigingen
ter hoogtevan het bloed
en
de
weefselsde afgifte van
zuurstof door
Hb
gaan beinvloeden.Informatie omtrent de zuurstofuoorziening van weefsels zal bekomen worden aan de hand van
in
vivo
nucleaire
magnetische resonantie opnamen(tvG.I). Daarbij zullen
die
weefsels onderzocht worden die meest kwetsbaar zrjnvoor
zuurstofgebrek zoalsbv.
de hersenen. Deaandacht
zal vooral gaan naar wijzigingen
in
het
beeldcontrastveroorzaakÍ
door
deoxygenatie
van het bloed
ter
hoogtevan
de
weefsels(in
situ) (Blood
Oxygenation Level DependentMRI).
Op
dezemanier
is
het mogelijk om zelfs
herhaaldelijk
in
eenzelfcleorganisme,
en op niet
invasieve
wijze
Hb
oxygenatie
in
situ
te
bestuderen
onder(experimenteel)
gewijzigde
milieu-omstandigheden.Voor
dezetest zullen de
vissenuit
devorige proef
gebruikt
worden waardoor de resultaten van de zrvemproefin
verband kunnen gebracht worden met de resultaten van de zuurstofbeschikbaarheid.Vermits
het
om
niet-invasieve methoden
gaat",zullen
alle
geteste
individuen
na
eenrecuperatieperiode opnieuw uitgezet worden.
Metaalbindende eiwitten
Metallothioneïnen
(MT's) zljn niet
enzymatische, cytoplasmatischeeiwitten
met
laagmoleculair
gewicht en
eengrote
warmtestabiliteit.
Ze
bevatten eenhoog
cysteïnegehalte(30%), waarbij
echter
geen
disulfide
bindingen gevormd
worden.
Wegens
hun induceerbaarheiddoor
zware metalen en door hun groot bindingsvermogenvoor
deze metalenworden de
MT's
tot
de stressproteïnen gerekend. Deze eiwitten reguleren de beschikbaarheidvan
essentiele metalen(vb.
Zn, Cu) in
het
organismeen
beschermenhet
organisme tegen schadelijke invloeden van niet-essentële metalen(vb.
Cd, Pb). Metallothionëinen spelen dus een belangrijkrol in
de metaalhomeostase. Naast inductiedoor
zvvaÍe metalen kunnenMT's
ook geïnduceerd worden door
tal
van andere factoren zoals oxidatieve stress en inflammatie. Het werkingsmechanismeis
complex en nogniet volledig
begrepen.Wel
staat vast dat doorblootstelling
aan subletale concentratiesvafl
z\ tare metalende
organismenzich
aan dezeI
metalen gaan acclimatiseren.
Dit
kan
zich vertalenin
een verhoogdetolerantie
voor
dezemetalen
(9,
l0).
MT's
worden teruggevondenin
alle phyla.
Door
hun bindingscapaciteitvoor
essentiële enniet-essentiële metalen
kunnen
MT's
in
biologisch weefsel een indicatie geven
over
defeitelijke blootstelling
aan zware metalen.In
dezestudie zal
nagegaanworden
of
MT-gehaltenin
de visweefselsin
verband kunnenworden gebracht met metaalgehalten. Bovendien zal nagegaan worden
of
acclimatisatieen/of
adaptatie aan metalen een belangrijke
rol
speeltbij
de inductie van MT's.De
MT-concentratiesin
het weefsel worden bepaald met de Thiomolybdaat essay(11,
12)Deze Cd
(Cu)
saturatie methode is een accurate en specif,reke methodevoor
het bepalen van de MT-concentraties ongeacht de redox-status enbijgevolg
de metaalbindingscapaciteit van heteiwit.
Deze methode detecteertMT's
doorhet
vervangen van de metalen die er reeds aangebonden
zijn
door een metaal met hogere bindingscapaciteit(Hg>Ag>Cu>Cd>Zn).De
MT-concentratie
wordt
dan geschat door het vervangend metaal datin
de oplossingoverblijft
tekwantificeren.
4.
Literatuur
(l)Vandelannoote e.a. (1998).
Atlas
van
de
Vlaamse
Beek-
en
Riviervissen.
WEL-Antwerpen, 303.
(2) Lodts (1999). Effect van metalen op conditie van grondel. Licentiaatsthesis UA.
(3) Breine e.a. (1999) Visbestandsopnames op de Dommel (1998). Instituut voor Bosbouw en
Wildbeheer.
(4)
Weatherly(1972).
Growth
and ecologyoffish populations.
Academic Press, London. 293.(5)
Bagenal
(1978)
Methods
for
assessmentof
fish
production
in
freshwaters. IPB Handbook 3 -Blackwell
Scient. Publ. Oxford.(6)
Palmer
(1994)
Fluctuating
asymmetry
analysis
: A
primer.
In :
Markov
(Ed.),Developmental
instability : its origin
and evolutionaryimplications.
Kluwer,
Dordrecht, Netherlands.(7)
Dillen
(2000). Effect
van
isolatie
op
de
conditie
van
grondel (Gobio
gobio
L.)
Licentiaatsthesis
UA.
I
Effect van metaalverontreiniging op de conditie van inheemse vispopulaties
I
(8)
Keen&
Farrell
(1994).
Maximum
prolongedswimming
speed andmaximum
cardiasperformance
of
rainbowtrout,
Oncorhynchus mykiss, acclimatedto two
different
watertemperatures.
Comp.
Biochem.
108'.287 -295.(9)
Bradley
R.W.
&,
SpragueJ.B.
(1985).
Accumulation
of
zinc
by
rainbow-trout
asinfluenced by pH, water hardness and fish size. Environ.
Toxicol.
Chem. a(5): 685-694.(10) Alsop
D.H.
&
Wood
C.
(2000).Kinetic
analysisof
zinc
accumulationin
the
gills
of
juvenile
rainbow
trout:
effectsof
zinc
acclimationand implications
for biotic
ligandmodeling. Environ.
Toxicol.
and Chem., 19: 1911-1918.(ll)
Klein
D.,
Sato S.&
SummerK.H.
(1994). Quantificationof
oxidized metallothionein in biological material by a Cd saturation method. Anal. Biochem.,221'. 405-409.(12)
BienegràberM.,Forderkuffi
S.,Klein D.
&
SummerK.H.
(1995)
Determinationof
Cu-containing metallothionein: comparison
of Ag
saturation assay,thiomolybdate
assay,and eruyme-linked immunosorbent assay. Anal. Biochem . 228'. 69-73.
