Gebruik van melkzuurbacteriën voor de productie van moutgebaseerde gefermenteerde frisdranken

GEBRUIK VAN MELKZUURBACTERIËN

VOOR DE PRODUCTIE VAN

MOUTGEBASEERDE

GEFERMENTEERDE FRISDRANKEN

Célestine De Baets

Promotoren: Dr. ir. David Laureys, Prof. Dr. ir Jessika De Clippeleer

Tutor: Dr. ir. David Laureys

Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad van Master of Science in de biowetenschappen: voedingsindustrie

GEBRUIK VAN MELKZUURBACTERIËN

VOOR DE PRODUCTIE VAN

MOUTGEBASEERDE

GEFERMENTEERDE FRISDRANKEN

Célestine De Baets

Promotoren: Dr. ir. David Laureys, Prof. Dr. ir Jessika De Clippeleer

Tutor: Dr. ir. David Laureys

Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad van Master of Science in de biowetenschappen: voedingsindustrie

Auteursrechtelijke bescherming

“De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”

“The author and the promoter give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using the results from this thesis”.

05 mei 2020

VOORWOORD

Het schrijven van een thesis is een uitdaging die ik niet had kunnen overwinnen zonder de hulp en steun van vele mensen die ik met dit voorwoord wil bedanken.

Vooreerst wil ik mijn promotor Dr. ir. David Laureys en co-promotor Prof. Dr. ir. Jessika De Clippeleer bedanken om mij de mogelijkheid te bieden wetenschappelijk onderzoek uit te voeren naar een moutgebaseerde, gefermenteerde drank, een onderwerp waar ik van in het begin reeds erg enthousiast over was. Daarbij wil ik hen bedanken voor de tijd die zij vrijmaakten om mij te begeleiden bij dit onderzoek en om steeds mijn vragen te beantwoorden.

Ik had graag ook Sander Wittouck bedankt, waarmee ik in het eerste semester samen de identificatie van de melkzuurbacteriën mee uitvoerde, voor de leuke samenwerking en vlotte communicatie. Ik wil ook Anneleen Wieme bedanken die ons in het eerste semester op weg heeft geholpen met de MALDI-TOF MS identificatie.

Eveneens wil ik Sylvie Vandoorne, Dana Vanderputten en André Heereman bedanken voor hun kennisoverdracht tijdens mijn onderzoek. Ook mijn medestudenten Arne Demeester, Adrianus Verschuren, Stijn Vanderroost, Michael Schoofs, Anton Van Quaethem en Kenneth Vanderhaeghe had ik graag bedankt voor steevast een goede sfeer in het labo.

Als laatste had ik graag mijn vrienden en familie bedankt, voor de continue steun en soms ook nodige afleiding die zij boden tijdens dit onderzoek.

CORONA

Op 18 maart 2020 werden verstrengde maatregelen ingevoerd om de verspreiding van het coronavirus COVID-19 zo veel mogelijk te vertragen. Dit impliceerde dat vanaf dat moment alle onderzoeksactiviteiten in het kader van een bachelor- en masterproef waarvoor fysieke activiteit in de UGent- en HOGENT-gebouwen noodzakelijk was, werden stopgezet. Alle lopende en geplande experimenten werden onmiddellijk onderbroken. Om deze reden kon een groot deel van het praktische werk binnen deze masterproef niet afgerond worden.

In overleg met de promotor van dit onderwerp werd de masterproef deels heringevuld. Er werd een hoofdstuk ‘Geplande experimenten’ ingevoerd waar de experimenten die normaal uitgevoerd zouden worden, in detail uitgeschreven werden alsook de te verwachte resultaten. Al deze zaken werden gestaafd met de nodige en relevante literatuur.

ABSTRACT (NEDERLANDS)

Het doel van dit onderzoek is nagaan of het mogelijk is een lekkere gefermenteerde, moutgebaseerde drank te produceren met behulp van melkzuurbacteriën. Deze drank zou een antwoord kunnen bieden op de vraag van de samenleving naar producten met zowel een lager alcohol- als suikergehalte als gevolg van een groter gezondheidsbewustzijn van de consument en verschillende campaigns die de gevaren van alcoholmisbruik benadrukken. Wort werd gebruikt als basis voor de gefermenteerde drank. Melkzuurbacteriën werden geïsoleerd uit zuurdesems en aangekochte starterculturen en geïdentificeerd met MALDI-TOF MS. Er werd nagegaan welke stammen een goede groei vertoonden in wort en in welke mate de inoculumconcentratie (0,1%, 1,0%, 5,0%) en fermentatietemperatuur (25°C, 37°C) de groei beïnvloedden. Hiervoor werd het wort geënt met culturen die in de diepvries bewaard werden bij -20°C en op MRS-broth werden geactiveerd door twee dagen te incuberen bij 25°C. L. brevis, P. pentosaceus, L. plantarum, Lc. lactis en Lc. lactis ssp lactis vertoonden een goede groei in wort bij 37°C en 5,0% (v/v) inoculum (respectievelijk 6,8 log10 kve/mL, 7,2 log10 kve/mL, 6,9 log10 kve/mL, 7,0 log10 kve/mL en 5,8 log10 kve/mL) en werden dus opgenomen in de verdere experimenten. De beste groei werd vastgesteld voor Lactobacillus brevis en Lactobacillus plantarum. Voor de fermentatie bij 25°C werden de ingevroren culturen rechtstreeks gebruikt voor de inoculatie van het wort, zonder activatie vooraf, en werden geen groeicurves bekomen. Er werd geconcludeerd dat de geïsoleerde stammen goed kunnen groeien in wort bij 37°C indien ze geactiveerd worden vooraf aan de inoculatie.

Er werd een experimenten uitgewerkt om na te gaan welke suikers gefermenteerd kunnen worden door de stammen op te groeien op een MRS-medium waarvan de oorspronkelijke koolhydraatbron werd weggelaten en waaraan één van volgende suikers werd toegevoegd: maltose, fructose, sucrose of glucose. In een vervolgexperiment kan worden nagegaan hoe de substraatconsumptie en metabolietvorming gedurende de fermentatie verlopen bij enkele verschillende melkzuurbacteriën. Op deze manier kan een inzicht verkregen worden van de suiker:zuur verhouding verkregen bij de fermentatie met verschillende stammen en voor verschillende tijdsduren (24h, 36h, 72h). Ten slotte kan een sensorische evaluatie uitgevoerd worden om na te gaan hoe deze verhouding de smaak van de gefermenteerde drank zal beïnvloeden.

ABSTRACT (ENGLISH)

The goal of this research is to determine whether it is possible to make a tasty, fermented, malt based beverage with lactic acid bacteria. This beverage could provide an answer to society’s demand for products with both reduced sugar and alcohol levels as a result of the consumers growing health consciousness and several campagnes that emphasize the dangers of alcohol abuse. Wort was used as a base for the fermented beverage. Lactic acid bacteria were isolated from sourdoughs and starter cultures and identified with MALDI-TOF MS. It was investigated which strains demonstrated a good growth in wort and how the inoculum size (0.1%, 1.0%, 5.0%) and fermentation temperature (25°C, 37°C) influenced that growth. For this the wort was inoculated with cultures that were stored in a freezer at -20°C and that were activated on MRS-broth for two days at 25°C. L. brevis, P. pentosaceus, L. plantarum, Lc. lactis and Lc. lactis ssp lactis exhibited a good growth in wort at 37°C and with 5.0% (v/v) inoculum (respectively 6.8 log10 cfu/mL, 7.2 log10 cfu/mL, 6.9 log10 cfu/mL, 7.0 log10 cfu/mL and 5.8 log10 cfu/mL) and were included for further investigation. Maximum growth was attained by L. brevis and L. plantarum. For the fermentation at 25°C the frozen cultures were directly used for inoculation of the wort, without activating them beforehand. As a result no growth curves were obtained. It was concluded that the isolated strains can grow in wort at 37°C if they are activated beforehand.

An experiment to determine which sugars can be fermented was proposed. The strains can be grown on MRS from which the carbohydrate source was omitted and to which one of the following sugars was added: maltose, fructose, sucrose or glucose. In a follow-up experiment the substrate consumption and metabolite production can be tracked during the fermentation. With this information insight could be gained in the attained sugar to acid ratio when fermenting with different strains and for various periods of time (24h, 36h, 72h). Finally a sensory evaluation could determine how this ratio will influence the taste of the fermented beverage.

1

INHOUDSTAFEL

1.2.2 Marktonderzoek: laag- en non-alcoholische bieren ... 9

1.2.3 Zoektocht naar non-alcoholische alternatieven ... 9

1.2.4 Innovatie... 12

1.3 GEFERMENTEERDE DRANKEN EN GEZONDHEID ... 12

1.3.1 Fermentatie ... 12 1.3.2 Gezondheidsvoordelen ... 13 1.4 GISTEN ... 14 1.5 MELKZUURBACTERIËN ... 14 1.5.1 Metabolisme ... 15 1.5.2 Mannitol ... 19 1.5.3 Zuurtolerantie... 21 1.5.4 Osmotolerantie... 22

1.6 WORT ALS BASIS VOOR EEN GEFERMENTEERDE DRANK ... 23

1.6.1 Fermentatie van wort door melkzuurbacteriën... 24

1.6.2 Groei van melkzuurbacteriën in wort ... 27

1.6.3 Organoleptische aspecten ... 29

2. ONDERZOEKSVRAGEN ...30

3. MATERIALEN EN METHODEN ...31

3.1 ISOLATIE VAN DE MELKZUURBACTERIËN ... 31

3.2 OPZUIVERING ... 31

3.3 STOCKAGE ... 31

3.4 IDENTIFICATIE VIA MALDI-TOFMS ... 31

3.5 KATALASE ... 32

3.6 GRAM POSITIVITEIT/NEGATIVITEIT ... 32

3.7 EXOPOLYSACHARIDE VORMING ... 33

3.8 KOOLZUURGAS PRODUCTIE ... 33

3.9 GROEI VAN MELKZUURBACTERIËN IN WORT ... 33

3.9.1 Bij 37°C ... 33

3.9.2 Bij 25°C ... 34

2

3.10 FERMENTEERBAARHEID MONO- EN DISACHARIDEN ... 34

4. RESULTATEN EN DISCUSSIE ...36

4.1 ISOLATIE EN IDENTIFICATIE VAN DE MELKZUURBACTERIËN ... 36

4.1.1 Beperkingen ... 39

4.2 GROEI VAN MELKZUURBACTERIËN IN WORT ... 39

4.2.1 Bij 37°C ... 39

4.2.2 Bij 25°C ... 42

4.2.3 Bespreking ... 44

4.2.4 Beperkingen ... 45

4.3 FERMENTEERBAARHEID MONO- EN DISACHARIDEN ... 46

5. GEPLANDE EXPERIMENTEN ...47

5.1 FERMENTEERBAARHEID MONO- EN DISACHARIDEN ... 47

5.1.1 Materialen en methoden ... 47

5.1.2 Verwachte resultaten ... 47

5.2 SUBSTRAATCONSUMPTIE, METABOLIETVORMING EN PH-VERLOOP IN WORT ... 48

5.2.1 Materialen en methoden ... 48 5.2.2 Verwachte resultaten ... 49 5.2.3 Beperkingen ... 51 5.3 SENSORISCHE EVALUATIE ... 51 5.3.1 Materialen en methoden ... 52 5.3.2 Verwachte resultaten ... 53 5.3.3 Beperkingen ... 53 6. CONCLUSIE ...54 7. LITERATUURLIJST ...56 8. BIJLAGEN...60

3

Lijst met tabellen

Tabel 1: Indeling van het genus Lactobacillus op basis van de gebruikte metabolische

pathway...17

Tabel 2: Uitwendige pH (pHo) en pH van het cytoplasma (pHi) van Lactobacillus acidophilus bij de toevoeging van verschillende buffers aan MRS...62

Tabel 3: Suikergehalte van het wort medium en productie van primaire metabolieten gedurende de fermentatie met Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum en Lactobacillus acidophilus...62

Tabel 4: Samenstelling MRS-medium zonder glucose...63

Tabel 5: Resultaten van de primaire testen en identificatie van de geïsoleerde stammen...37

Tabel 6: Samenstelling van moutextract en van wort gemaakt op basis van dat extract...50

Tabel 7: Suikergehalte van enkele typische softdrinks...65

Tabel 8: Gebruikte schaal voor de acceptatie door de consument bij een 9-punten hedonische test...53

4

Lijst met figuren

Figuur 1: Percentage van de bevolking (ouder dan 15 jaar) dat dagelijks alcohol gebruikt, volgens

gewest en jaar ...8

Figuur 2: Druglijn: Affiche over het alcoholgebruik van studenten en affiche die 55-plussers sensibiliseert over de impact van alcohol op hun gezondheid...60

Figuur 3: ‘Energibajer’ van Mikkeler, een alcoholvrij tarwebier...60

Figuur 4: Nagra, gefermenteerde drank op basis van gerstemout van Innovative Beverages...61

Figuur 5: Overzicht van ‘the millennial mindset’...61

Figuur 6: Overzicht van het fermentatie mechanisme...13

Figuur 7: De twee belangrijkste pathways voor de fermentatie van glucose: de homolactische en heterolactische fermentatie...18

Figuur 8: Fermentatieprofiel van een fed-batch mannitol fermentatie met Leuconostoc mesenteroides bij een temperatuur van 25°C en een pH-waarde van 5,5...21

Figuur 9: Concentratie aan vrije amino stikstof (FAN) en aminozuren in gerstemout wort vóór en na 72h fermentatie...26

Figuur 10: pH-verloop in functie van de concentratie aan organische zuren en verandering in buffercapaciteit (BC) als gevolg van de stijgende pH waarde van het medium bij de fermentatie van gerstemoutwort met L. plantarum, L. amylolyticus en L. brevis...27

Figuur 11: De groei van L. plantarum, L. fermentum, L. reuteri en L. acidophilus op een mout medium...27

Figuur 12: Kinetiek van de groei, mortaliteit en vitaliteit van zes MZB stammen (L. plantarum, L. amylolyticus en L. brevis) gedurende de fermentatie van een moutmedium...28

Figuur 13: Aangekochte starterculturen...64

Figuur 14: Productie koolzuurgas (CO2), test m.b.v. een geïmproviseerde Durham tube...36

Figuur 15: Dendrogram van de geïsoleerde MZB stammen...38

Figuur 16: De groei van Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Pediococcus pentosaceus (a), Lactococcus lactis ssp lactis , Lactococcus lactis en Leuconostoc pseudomesenteroides in wort bij 37°C en 5,0% inoculum door het meten van de optische densiteit (600nm)...40

5 Figuur 17: Groei van Lactobacillus brevis in wort bij 37°C en bij verschillende inoculumconcentraties (5,0%, 1,0%, 0,1%)...41 Figuur 18. Groei van Lactobacillus sakei op MRS bij 28°C en bij verschillende inoculumconcentraties (0,1%,0,5%,1,0% en 5,0% (v/v))...41 Figuur 19: Groei van Pediococcus pentosaceaus (b), Pediococcus pentosaceus (a), Lactobacillus brevis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Lactococcus lactis, Lactobacillus sanfranciscensis,

Lactobacillus plantarum en Lactococcus lactis ssp lactis op MRS en op wort bij 25°C en 1%

inoculum door het meten van de optische densiteit (600nm)...43 Figuur 20: Groei van een niet vooraf geactiveerde Lactococcus lactis ssp lactis stam bij verschillende inoculumconcentraties in wort (0,1%, 1,0%, 5,0% (v/v)) en in MRS (1,0%) bij 25°C...45

6

1. LITERATUURSTUDIE

1.1 Inleiding

De zoektocht van de samenleving naar gezonde(re) en natuurlijke(re) voedingsartikelen, gekenmerkt door een nieuwe smaak en nieuwe ingrediënten, wordt in de drankensector weerspiegeld door een toename in belangstelling voor non-alcoholische, functionele en veelal gefermenteerde dranken (Peyer, Zannini, & Arendt, 2016). Veel gebruikte substraten binnen de industrie van gefermenteerde voedingsmiddelen zijn melk, vlees, groenten en fruit (Kandasamy, Kavitake, & Shetty, 2018). Om te kunnen beantwoorden aan de vraag van de consument naar functionele voedingsartikelen die tevens rekening houden met voedselallergieën en -intoleranties en de levensstijl van de consument zoals vegetarisme of veganisme, is er nood aan alternatieve substraten. Om die reden krijgt het gebruik van graan als grondstof recent veel aandacht. Granen hebben enkele gewenste eigenschappen zoals een hoge nutritionele waarde en een hoog gehalte aan bioactieve componenten (Nsogning Dongmo, Procopio, Sacher, & Becker, 2016). Door dit substraat te gebruiken voor melkzuurfermentaties kan men de functionaliteit verhogen en een meer specifiek smaakprofiel bekomen (Peyer et al., 2016). Door granen, graangebaseerde substraten of een combinatie daarvan met behulp van melkzuurbacteriën (MZB) te fermenteren, zou een niet-alcoholische drank met een licht zure smaak verkregen kunnen worden.

Als gevolg van een groter gezondheidsbewustzijn van de bevolking en verschillende campagnes die de gevaren van alcoholmisbruik benadrukken, is er een groeiende interesse in non-alcoholische dranken. Om de consumptie van deze dranken te kunnen promoten, is het belangrijk de klant te voorzien van een voldoende groot en aantrekkelijk aanbod. Naast de gedealcoholiseerde varianten van bestaande bieren, is er binnen deze markt nog veel ruimte voor innovatieve producten. Dit soort artikelen laat de consument toe om gezond te leven zonder daarbij geremd te worden in diens deelname aan sociale activiteiten waarbij normaal alcohol geconsumeerd wordt. Er wordt getracht een antwoord te vinden op de vraag:

7 In deze thesis werd onderzocht worden of het mogelijk is een lekkere, non-alcoholische, moutgebaseerde (fris)drank te produceren. De productie van deze drank werd gebaseerd op de fermentatie van een moutextract met behulp van melkzuurbacteriën. Melkzuurbacteriën zijn micro-organismen die veel gebruikt worden bij voedselfermentaties en bezitten daardoor een GRAS-status (Generally Recognised As Safe). MZB zorgen niet enkel voor gewenste smaakveranderingen, maar verhinderen ook de groei van ongewenste micro-organismen. Zowel de aanwezigheid van MZB op zich, als de metabolieten die ze produceren, kunnen bovendien een gezondheidsbevorderend effect hebben.

Om een drank met een volwaardige smaak te verkrijgen en met eenzelfde complexiteit als bier, werd gedroogd moutextract als grondstof gebruikt. Vanuit dit extract werd wort bereid, dat als fermentatiemedium diende. Tijdens de fermentatie zetten MZB de aanwezige voedingsstoffen, voornamelijk suikers, om tot primaire metabolieten, voornamelijk melkzuur.

Een geslaagd eindresultaat van deze dissertatie is de productie van een moutgebaseerde frisdrank met een goede zoet-zuur balans, een degelijke carbonatie en een aantrekkelijk aroma.

1.2 Alcoholgebruik en -misbruik

1.2.1 Initiatieven en bewustzijn

Met initiatieven zoals de jaarlijkse Tournée Minérale en de BOB-campagne wordt meer bewustwording gecreërd omtrent het gebruik en misbruik van alcohol. Een glas wijn bij het avondmaal of een biertje na het sporten: voor vele mensen maakt alcohol deel uit van de dagelijkse routine (De Doncker, De Donder, & Möbius, 2016). Deze alcoholconsumptie, sociaal aanvaard en inherent aan onze cultuur, kan echter zelfs in beperkte mate de gezondheid negatief beïnvloeden (Gisle, Demarest, & Drieskens, 2018).

Drinken wordt veelal geassocieerd met plezier maken, gezelligheid en ontspanning (VAD, 2016). Toch staat men onvoldoende stil bij het feit dat teveel drinken niet enkel jezelf, maar ook anderen in gevaar kan brengen. Alcohol is alomtegenwoordig en iedere gebeurtenis, een trouw, geboorte of verjaardag, vormt een gelegenheid om een glaasje (of vaak meerdere) te drinken. Maar ook bij het uitgaan, na het sporten of om het begin van het weekend te vieren komt er vaak alcohol bij te pas. Jongeren gaan hier soms nog verder in, ze drinken om een roes te creëren, als het ware een vlucht uit de realiteit. Uitgaan zonder alcohol wordt moeilijk en niet drinken is ongezellig en flauw. Steeds vaker dient men zich te verantwoorden voor het niet drinken van alcohol.

8 In de gezondheidsenquête (2018) komen enkele straffe cijfers naar boven (Gisle et al., 2018). 77% van de bevolking drinkt alcohol, waarvan 10% dit dagelijks doet (fig. 1). Voor 14% vormt het gebruik van alcohol een potentieel gevaar, daar ze dagelijks drinken en meer drinken dan het aanbevolen maximum van 10 alcoholische consumpties per week. Zes procent van de bevolking drinkt overmatig alcohol, dit is meer dan 14 glazen alcohol per week voor vrouwen en meer dan 21 glazen voor mannen (Gisle et al., 2018). Deze cijfers liggen allemaal lager dan in 2013, wat aantoont dat het gebruik van alcohol bij de algemene bevolking een dalende trend volgt. Dit betekent echter dat nog steeds meer dan één miljoen mensen een bepaalde vorm van alcoholafhankelijkheid vertonen in België.

De cijfers voor de meest schadelijke vormen van alcoholgebruik, hyperalcoholisatie en piekdrinken, bleven onveranderd sinds 2013 (Gisle et al., 2018). Bijna de helft van de bevolking had ervaring met hyperalcoholisatie in 2018, waarbij ze bij eenzelfde gelegenheid minstens zes glazen alcohol dronken en voor 8% gebeurde dit zelfs wekelijks. Recent onderzoek toont het verband aan tussen het gebruik van alcohol en wel tweehonderd fysieke en geestelijke aandoeningen, alsook het verband met fysieke en psychologische trauma's door geweld, agressie of ongevallen onder invloed. Hiermee wordt duidelijk dat de gevolgen van het misbruik niet beperkt blijven tot de gebruiker, maar ook diens familiale, sociale en professionele omgeving raken. Bijna 25% van het aantal overlijdens bij personen van 20-39 jaar is rechtstreeks of onrechtstreeks te wijten aan een overmatig alcoholgebruik.

De slogan ‘Bier met liefde gebrouwen, drink je met verstand’ dateert uit 1992 en kwam op initiatief van de Belgische Brouwers (Brouwerij Haacht, 2018). De eerder vermelde cijfers wijzen er echter

Fig. 1: Percentage van de bevolking (ouder dan 15 jaar) dat dagelijks alcohol gebruikt, volgens gewest en jaar (Gisle et al., 2018).

9 op dat er te vaak onverstandig of zelfs roekeloos gedronken wordt. Een goede sensibilisering door middel van campagnes is cruciaal om een eind te maken aan het veel voorkomende overdadig alcoholgebruik (zie bijlage, fig. 2). In 2019 deed maar liefst 18% van de Belgen mee aan Tournée Minérale. Het succes van deze campagne toont aan dat er een groeiende interesse is in non-alcoholische dranken, ook bij mensen die regelmatig alcohol drinken. De beschikbaarheid van lekkere en trendy non-alcoholische alternatieven is een essentieel onderdeel van deze evolutie.

1.2.2 Marktonderzoek: laag- en non-alcoholische bieren

Een sterker bewustzijn omtrent gezondheid wordt weerspiegeld in een toename van de verkoop van laag- en non-alcoholische dranken (Russell & Kellershohn, 2018). Dit heeft te maken met de zoektocht van millennials naar producten met zowel een lager alcohol- als suikergehalte. Ook grote merken zien het potentieel in deze markt, zo stelde AB InBev dat tegen 2025 hun aanbod voor minimum 20% zou bestaan uit laag- en alcoholische bieren. De shift naar laag- en non-alcoholische dranken geeft vorm aan de toekomst van de industrie in kwestie. Er wordt verwacht dat de globale markt van non-alcoholische bieren zal groeien met 7% tegen 2027 (Fact. MR., 2020).

De snelle verstedelijking, de stijging van het besteedbaar inkomen en een toenemend aantal gezondheidsbewuste mensen zijn sleutelelementen bij de marktpenetratie van deze producten (Ahuja & Rawat, 2019). Enkele topspelers van de industrie zoals Carlsberg, Heineken, Corona en Budweiser brachten reeds nieuwe non-alcoholische varianten van hun bieren op de markt als uitbreiding van hun aanbod en om elk klantsegment te kunnen voorzien. Een stijgend aantal brouwerijen die non-alcoholische producten op de markt brengen, zorgen voor een toenemende competitie waardoor de klant van een groot assortiment wordt voorzien (Ahuja & Rawat, 2019). Innovatie wordt essentieel om zich te differentiëren van de concurrentie.

1.2.3 Zoektocht naar non-alcoholische alternatieven

Een laag- of non-alcoholische bier kan op twee wijzen worden geproduceerd. Ten eerste door het bier te dealcoholiseren na een standaard brouwproces met behulp van reverse osmose, een hittebehandeling of vacuümdestillatie (Russell & Kellershohn, 2018). De tweede wijze steunt op het onderbreken van de fermentatie vooraleer alcohol wordt geproduceerd. In 2016 werd meer dan 80% van de dranken geproduceerd via dealcoholisatie (Ahuja & Rawat, 2019). Er wordt echter een samengesteld jaarlijks groeipercentage (CAGR) van 7% verwacht tussen 2017 en 2024 voor de productie via onderbroken fermentatie, dankzij een beter behoud van aromatische componenten bij deze methode.

10 Verschillende non-alcoholische dranken worden op de markt voorgesteld als alternatieven voor sterk gesuikerde softdrinks of zelfs als sportdranken onder het mom van een ‘verfrissende isotone hersteldrank’ (Russell & Kellershohn, 2018). Bieren met een alcoholgehalte lager dan 2% hebben niet het dehydraterend effect dat optreedt bij bieren met hogere alcoholpercentages en bevatten een hoeveelheid koolhydraten en mineralen die de nodige energie geven om snel te kunnen herstellen na het sporten (Shirreffs & Maughan, 1997). Een voorbeeld van zo een sportdrank is het 0,0% ‘energibajer’ of ‘racing beer’ van het Deense merk Mikkeller (zie bijlage, fig. 3). Deze drank werd geproduceerd met een gist die de fermentatie vervolledigt zonder alcohol te produceren. Hierdoor bevat het bier 0,0% alcohol, wat uitzonderlijk is voor een bier dat niet gedealcoholiseerd werd.

In 2018 kwam ook een nieuw Belgisch product op de markt: Nagra, een verfrissende melkzuurgefermenteerde drank op basis van gerstemout (zie bijlage, fig. 4). Door toevoeging van sinaasappelschil en korianderzaadjes werden complementaire aroma’s ontwikkeld. De drank bevat enkel natuurlijke suikers, ± 6g suiker/100 mL, wat slechts de helft is van een klassieke frisdrank of een natuurlijk appelsap (“Nagra”, 2018).

Kombucha

Een voorbeeld van een drank die recent aan een sterke opmars is begonnen, is kombucha. Kombucha is een drank die ontstaat uit de fermentatie van gezoete thee, na inwerking van een symbiotische cultuur van gisten en azijnzuurbacteriën (Michiels, 2014). Soms zijn ook melkzuurbacteriën in kleine concentraties aanwezig in deze cultuur. De fermentatie verloopt bij kamertemperatuur en duurt 4 tot 21 dagen. De verfrissende drank heeft een aangename zoet-zure balans, waarbij de zoet-zure smaak toeneemt naarmate men langer fermenteert (Laureys, 2017). Indien te lang wordt gefermenteerd, wordt een azijnzure smaak verkregen. De symbiotische groei tussen vooral azijnzuurbacteriën en giststammen heeft het uitzicht van een zwam (Michiels, 2014). Toch is deze massa geen echte zwam, maar een gelatineuze structuur opgebouwd uit cellulose, verkregen door de omzetting van koolhydraten tot cellulose door de azijnzuurbacterie Komagataeibacter xylinus (Laureys, Britton, & De Clippeleer, 2020).

In Belgïe zijn er reeds enkele brouwerijen die een eigen kombucha op de markt brengen zoals Yugen en Cult in Gent (Bogaerts, 2019). De drank, die reeds in verschillende smaken verkrijgbaar is, is een geliefd alternatief bij consumenten op zoek naar een gezonde variant van een frisdrank (Russell & Kellershohn, 2018).

11 Kefir

Kefir is een drank die ontstaat door de anaerobe fermentatie van een oplossing van water, suiker en gedroogde vijgen met behulp van waterkefir korrels (Laureys, 2017). De water kefir granen bevatten een hoeveelheid polysachariden en bezitten tevens de micro-organismen die verantwoordelijk zijn voor de fermentatie. De belangrijkste soorten die op het graan teruggevonden kunnen worden zijn Lactobacillus casei/paracasei, Lactobacillus harbinensis, Lactobacillus hilgardii, Bifidobacterium psychraerophilum/crudilactis, Saccharomyces cerevisiae en Dekkera bruxellensis (Laureys & De Vuyst, 2014). Zowel zuurstof en enkele specifieke nutriënten kunnen het fermentatieproces beïnvloeden en de proliferatie van bepaalde micro-organismen bevorderen of juist verhinderen. Zo zullen azijnzuurbacteriën in de aanwezigheid van zuurstof snel vermenigvuldigen waardoor hoge concentraties azijnzuur bekomen kunnen worden (Laureys, Aerts, Vandamme, & De Vuyst, 2018). Na een fermentatie van 2 tot 4 dagen bij kamertemperatuur worden de waterige kefir oplossing en de korrels van elkaar gescheiden. De bekomen drank heeft een lichtzoete, zure, alcoholische en bruisende toets, een gele kleur en een fruitig aroma. Waterkefir is wereldwijd terug te vinden onder verschillende namen zoals tibicos, tibi granen, Japanse bierzaden, balsem van Gilead, etc. In amerika worden de korrels ook wel gebruikt voor de productie van moonshine whisky en in de Britse Eilanden worden de korrels gebruikt voor de productie van gemberbier.

Boza

Boza is een graangebaseerde drank gemaakt door de fermentatie van een gekookte, gezeefde en gesuikerde graanslurry. Boza, ook wel bosa of bozo, is een perzische term voor gierst, alhoewel in de praktijk ook bloem, griesmeel, maïs, rijst of mengsels hiervan worden gebruikt als grondstof (Gobbetti & Gänzle, 2013). De drank zelf is een behoorlijk dense vloeistof met een geel uitzicht en een zoet-zure smaak en kan verdund worden met water tot een gewenste consistentie bekomen wordt. Als starterculturen worden micro-organismen uit zuurdesems, pure culturen of yoghurt gebruikt of kan men werken via 'backslopping' waarbij een hoeveelheid vloeistof van een vorige fermentatie wordt gebruikt voor de inoculatie van een nieuwe batch. De cultuur bestaat hoofdzakelijk uit melkzuurbacteriën en gisten. Na 24h fermentatie is de drank reeds sterk verzuurd, is de pH gedaald van 6,1 tot 3,5 en bedraagt het kiemgetal aan melkzuurbacteriën 5 x 108 _{kve/ml. De MZB zijn voornamelijk heterofermentatieve organismen van het geslacht} Lactobacillus en Leuconostoc, en de gisten zijn voornamelijk Saccharomyces soorten.

12

1.2.4 Innovatie

Een innovatief product is niet enkel de concretisering van een goed idee, het dient tevens economisch rendabel te zijn. Dit gaat gepaard met een hele resem aan marketing strategiën die onderhevig zijn aan de opinie van het publiek en hoe deze openstaat voor het nieuwe artikel (Sahu & Panda, 2018). Belangrijke factoren in de acceptatie door de consument, afgezien van een goede smaak, zijn de eventuele gezondheidsvoordelen van het product. Deze dienen dan ook grondig onderzocht te worden en transparant overgedragen te worden naar de klant. Kwaliteit, productintegriteit en een goede labeling van de nutritionele eigenschappen zijn slechts enkele voorbeelden van hoe men de millennials op de markt voor zich kan winnen (Russell & Kellershohn, 2018).

Om een product snel te lanceren, is het vitaal om populariteit te winnen bij de belangrijkste consumentengroep: de millennials (Kellershohn, 2018). Deze groep mensen, geboren tussen 1980 en 2000, zijn opgegroeid met technologie en social media en verwachten ook van merken om hen via deze weg aan te spreken en te overtuigen van een product. Wanneer het gaat over dranken willen millennials via hun aankoop deel uitmaken van een social drinking experience. Dranken met een unieke ingrediëntenlijst of overtuigend merkverhaal vallen snel in de smaak. De verkozen marketingsstrategie dient dus voldoende rekening te houden met de millennial mindset (zie bijlage, fig. 5).

1.3 Gefermenteerde dranken en gezondheid

1.3.1 Fermentatie

Tijdens een fermentatieproces worden suikers door micro-organismen omgezet tot metabolieten zoals organische zuren, alcohol en koolzuurgas (fig. 6). Deze metabolieten dragen niet enkel bij aan de sensorische eigenschappen van het gefermenteerde product, maar zorgen evenals voor een verlenging van de shelf-life en verhogen de nutritionele waarde (Behera, Bal, Das, Panda, & Mohanty, 2018).

13 Vroeger verliep het proces zonder dat men inzicht had in de biochemie die zich achter de fermentatie schuilhield. Vanaf halverwege de negentiende eeuw vond een sterke industrialisatie plaats van de productie van gefermenteerde levensmiddelen (Kandasamy et al., 2018). Al snel volgde de ontdekking van enkele interessante micro-organismen, wat heeft geleid tot het gebruik van goed-gedefinieerde starterculturen: micro-organismen of combinaties van micro-organismen (bacteriën, gisten en schimmels) die tijdens de fermentatie de grondstof op een gewenste wijze modificeren. De belangrijkste micro-organismen die in melkzuurfermentaties worden aangewend zijn van het geslacht Lactobacillus, organismen die in staat zijn koolhydraten om te zetten tot melkzuur. Ook de azijnzuurproducerende Acetobacter en enkele species van het geslacht Bacillus worden veel gebruikt voor fermentaties (Sahu & Panda, 2018). Bij gisten is Saccharomyces het belangrijkste geslacht, met als voornaamste soort Saccharomyces cerevisiae, ook wel bakkersgist genoemd.

1.3.2 Gezondheidsvoordelen

Behalve een verlengde bewaring zijn een verrijking van de smaak, verbeterde verteerbaarheid en toename van de nutritionele waarde eigenschappen toegeschreven aan gefermenteerde producten (Kandasamy et al., 2018). De vraag naar gefermenteerde producten en innovatieve ‘functional foods’ zit in de lift dankzij de vele potentiële gezondheidsvoordelen (Sahu & Panda, 2018). Enkele van deze voordelen zijn een anti-constipatieve werking, cholesterol reductie, bloedglucose verlaging en een algemene verbetering van de gezondheid van het gastro-intestinale stelsel (Sahu & Panda, 2018). De bioactieve componenten hiervoor verantwoordelijk zijn onder andere vetzuren, aminozuren, fenolen, mineralen en vitamines die niet of in veel beperktere mate voorkomen in het ongefermenteerd product (Kandasamy et al., 2018).

14 Een tweede voordeel bij de consumptie van gefermenteerde producten is de opname van probiotica; levende micro-organismen met een positief effect op de gezondheid wanneer ze in voldoende hoeveelheden (6 log10 kve/ml bij een dagelijkse dosis van 100 mL) geconsumeerd worden (Rathore, Salmerón, & Pandiella, 2012). Het darmkanaal is gekoloniseerd door populaties van verschillende soorten bacteriën. Soorten die in grote aantallen voorkomen, vertonen symbiose met de gastheer, wat een sleutelrol speelt in het behoud van de gezondheid van diens gastro-intestinaal stelsel. Aan melkzuurbacteriën worden enkele probiotische eigenschappen toegekend dankzij hun overleving bij grote pH-schommelingen in het spijsverteringsstelsel en hun gal- en zouttolerantie (Kandasamy et al., 2018). Enzymes geproduceerd door de melkzuurbacteriën kunnen problemen met malabsorptie verhelpen en kunnen een positief effect hebben op de vertering. Verschillende studies toonden reeds aan dat de consumptie van bepaalde gefermenteerde dranken en voedingsmiddelen kan resulteren in concrete veranderingen in de samenstelling van de microbiota van het darmkanaal. Voornamelijk de toename van bifidobacteriën en/of lactobacillen wordt beschouwd als een merker voor de darmgezondheid (Behera et al., 2018). Enkele voorbeelden van de commercieel verkrijgbare probiotische culturen zijn Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus helveticus en Lactobacillus delbrueckii.

1.4 Gisten

Gisten zijn eencellige, eukaryote organismen die in staat zijn koolhydraten om te zetten tot ethanol en koolstofdioxide (Kandasamy et al., 2018). Daarbij produceren gisten een aantal hydrolytische enzymes (amylase, protease, invertase, lipase, etc.) die zullen instaan voor de degradatie van de grondstof. Gisten dragen, net zoals de melkzuurbacteriën, bij tot een verhoging van de nutritionele waarde van het product en zullen de groei van ongewenste organismen voorkomen (Romano, Capece, & Jespersen, 2006). Dit laatste realiseren ze door de aanmaak van alcohol, zuren, antibiotische factoren en waterstofperoxide (Chen, Aorigele, Wang, Simujide, & Yang, 2015).

1.5 Melkzuurbacteriën

De melkzuurbacteriën zijn een groep van grampositieve bacteriën die tijdens de fermentatie koolhydraten omzetten tot hoofdzakelijk melkzuur (Axelsson, 2004). Enkele andere algemene kenmerken zijn dat ze niet-sporenvormende, katalase-negatieve, zuurtolerante, strikt fermentatieve anaerobe coccen of staafjes zijn. Een verdere classificatie in verschillende genera

15 is gebaseerd op de wijze waarop de glucose wordt gefermenteerd, de morfologie, de temperatuur van optimale groei en de opbouw van het gevormde melkzuur (D/L of R/S).

De belangrijkste families gebruikt bij voedselfermentaties zijn Lactobacillaceae en Leuconostocaceae, beide van de orde Lactobacillales (Gänzle, 2015). Vanuit een voedseltechnologisch perspectief worden volgende genera beschouwd als de principiële melkzuurbacteriën: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus en Weissella. Voor fermentaties van granen worden voornamelijk Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus brevis, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus panis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sanfranciscensis en Weissella cibaria toegepast (Gobbetti & Gänzle, 2013).

Melkzuurbacteriën gebruikt voor voedselfermentaties worden getypeerd door een sterk competief en inhiberend karakter ten opzichte van andere bacteriën, mogelijk gemaakt door de combinatie van een snelle benuttiging van de aanwezige koolhydraten en de daaruit resulterende opstapeling van melkzuur en azijnzuur (Gänzle, 2015). De gevormde non-specifieke antimicrobiële stoffen zijn onder andere ethanol, korte keten vetzuren, waterstofperoxide, bacteriocines en antischimmel stoffen (Kandasamy et al., 2018). Waterstofperoxide is een sterke oxidant die door de vorming van het zeer reactieve hydroxyl radicaal (OH*) de groei van de meeste pathogenen zal inhiberen. Waterstofperoxide geaccumuleerd door MZB kan worden toegepast als alternatief voor chemische stoffen met antimicrobiële werking bij de voedselconservering (Ito et al., 2003)

1.5.1 Metabolisme

Het belang van melkzuurbacteriën is te danken aan hun efficiëntie om koolhydraten te fermenteren en het substraat te fosforyleren met vorming van ATP. Het gevormde ATP kan op zijn beurt gebruikt worden voor biosynthetische doeleinden. Melkzuurbacteriën kunnen obligaat homofermentatief, facultatief heterofermentatief of obligaat heterofermentatief zijn (Gänzle, 2015). Er wordt een onderscheid gemaakt in de wijze waarop suikers gefermenteerd kunnen worden door melkzuurbacteriën. Enerzijds is er de glycolyse (Embden-Meyerhof-Parnas pathway), waar onder normale omstandigheden haast uitsluitend melkzuur gevormd zal worden (Axelsson, 2004). De organismen die deze omzetting verwezenlijken noemen we homofermentatief. Anderzijds is er de pentosefosfaatweg (pentose-fosfoketolase pathway) die heterofermentatief is, daar er naast melkzuur ook andere eindproducten gevormd worden zoals CO2, ethanol of acetaat.

16 Bij de homolactische fermentatie vormt pyruvaat het vertakkingspunt (Gänzle, 2015). Glucose wordt geprefereerd waardoor andere suikers onderworpen zijn aan carbon catabolite repression (CCR). De groeicondities van de MZB spelen een belangrijke rol in de vorming van de eindproducten. De verdere omzetting van pyruvaat is namelijk afhankelijk van de aanwezigheid van zuurstof en de hoeveelheid substraat. Het anaeroob metabolisme in aanwezigheid van voldoende fermenteerbare koolhydraten leidt tot de vorming van melkzuur. Indien het substraat gelimiteerd is, kan pyruvaat worden omgezet tot ethanol en azijnzuur met behulp van pyruvaat formaat lyase. Aerobe conditities kunnen ervoor zorgen dat het homofermentatief metabolisme verschuift naar de vorming van acetoine en acetaat als voornaamste eindproducten. Toch zullen meeste MZB geen zuurstof gebruiken ook al is het aanwezig. De vorming van acetoine zou de kwaliteit van het product kunnen doen dalen doordat bij de chemische oxidatie van een intermediair diacetyl zal vrijkomen. De vorming van diacetyl in bier wordt beschouwd als bederf daar deze stof een onaangenaam boteraroma heeft. Voedselfermentaties met melkzuurbacteriën worden gewoonlijk niet belucht. Indien in de eerste fase van de fermentatie nog zuurstof aanwezig is, kan deze geëlimineerd worden door het cytochroom oxidase van melkzuurbacteriën dat werkzaam is bij lage zuurstofconcentraties. Aerobe condities zijn wel voordelig bij de opgroei van starterculturen, daar een toename van de biomassa en verhoogde resistentie tegen oxidatieve stress de productie op grote schaal bevordert.

Heterofermentatieve melkzuurbacteriën kataboliseren koolhydraten via de fosfoketolase pathway waarbij acetylfosfaat het centrale vertakkingspunt vormt (Gänzle, 2015). Disachariden worden geprefereerd over glucose en fructose kan gereduceerd worden tot mannitol. Algemeen wordt het pyruvaat afkomstig van de hexosen en pentosen omgezet tot melkzuur. Bij het begin van de omzetting komt koolzuurgas vrij en wordt ethanol gevormd vanuit acetylfosfaat. Fructose kan optreden als elektronenacceptor voor de recyclage van de gereduceerde cofactoren bij de fermentatie. Dit beïnvloedt de kwaliteit van het product, omdat de productie van azijnzuur hierdoor gestimuleerd wordt. Azijnzuur draagt bij tot de verzuring van het product, heeft een antibacteriële en antifungale werking en wordt in te hoge concentraties als bederf beschouwd in alcoholische dranken.

De termen hetero- en homofermentatief zijn niet altijd eenduidig. Algemeen wordt de term ‘homofermentatief’ gebruikt voor organismen die gebruik maken van de glycolyse pathway voor hun fermentatie, terwijl organismen die de pentosefosfaatweg hanteren bestempeld worden als ‘heterofermentatief’ (Axelsson, 2004). Toch kan het zijn dat de glycolyse leidt tot de vorming van andere producten naast melkzuur onder bepaalde condities of zullen homofermentatieve melkzuurbacteriën bij de aanwezigheid van specifieke substraten toch gebruik maken van de pentosefosfaatweg (Axelsson, 2004).

17 De keuze van de pathway steunt op de aan- of afwezigheid van twee sleutelenzymen: fructose-1,6-difosfaat aldolase dat essentieel is voor de glycolyse en fosfoketolase dat onmisbaar is voor het doorlopen van de pentosefosfaatweg (Axelsson, 2004). Op basis hiervan werden de melkzuurbacteriën onderverdeeld in drie groepen (tabel 1). Tot de eerste categorie behoort de groep I van Lactobacillus, waarvan de organismen obligaat homofermentatief zijn en suikers dus enkel fermenteren langs de glycolyse pathway. De tweede categorie bestaat uit obligaat heterofermentatieve micro-organismen die suikers enkel via de pentosefosfaatweg gaan fermenteren en bevat onder andere de geslachten Leuconostoc, Oenococcus en Weissella en groep III van Lactobacillus. Er bestaat tevens een derde, intermediaire groep die over FDP aldolase beschikt en normalerwijze suikers fermenteert volgens de glycolyse pathway. Afhankelijk van het substraat, wanneer bijvoorbeeld pentose in plaats van glucose aanwezig is, zullen deze organismen echter geïnduceerd worden tot het uitvoeren van een heterolactische fermentatie.

Tabel 1: Indeling van het genus Lactobacillus op basis van de gebruikte metabolische pathway (Axelsson, 2004).

Eigenschap Groep I: obligaat homofermentatief

Groep II: facultatief heterofermentatief

Groep III: obligaat heterofermentatief fermentatie pentose - + - CO₂ uit glucose - - + CO₂ uit gluconaat - ₊a +a FDP aldolase + + - fosfoketolase - ₊b ₊ voorbeeld Lb. acidophilus Lb. delbrueckii Lb. helveticus Lb. casei Lb. plantarum Lb. sakei Lb. brevis Lb. fermentum Lb. reuteri a Bij fermentatie b

Induceerbaar door pentoses

1.5.1.1 Glycolyse

In een eerste stap wordt glucose omgezet tot fructose-1,6-difosfaat, welke op zijn beurt wordt gesplitst in dihydroxyacetonfosfaat (DHAP) en glyceraldehyde-3-fosfaat (GAP) (Axelsson, 2004; fig. 7). Wanneer deze cyclus tweemaal doorlopen wordt en er twee GAP ter beschikking is, worden de twee molecules GAP omgezet tot twee molecules pyruvaat. Bij de omzetting van GAP naar pyruvaat wordt op twee plaatsen het substraat gefosforyleerd met vorming van 2 ATP uit 2 ADP en zal ook 2 NAD+ _{gereduceerd worden tot 2 NADH. Uiteindelijk wordt iedere molecule} pyruvaat omgezet tot een molecule melkzuur. Hierbij wordt het eerder geproduceerde NADH

18 opnieuw geoxideerd tot NAD+_{. Aangezien melkzuur het enige eindproduct is, wordt gesproken} van een homofermentatief proces.

Fig. 7: De twee belangrijkste pathways voor de fermentatie van glucose: (A) homolactische fermentatie (glycolyse, Embden-Meyerhof-Parnas pathway); (B) heterolactische fermentatie

(6-fosfogluconaat/fosfoketolase pathway). Enzymes: 1. glucokinase; 2. fructose-1,6-difosfaat aldolase; 3. glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase; 4. pyruvaat kinase; 5. lactaat dehydrogenase; 6. glucose-6-fosfaat

dehydrogenase; 7. 6-fosfogluconaat dehydrogenase; 8. fosfoketolase; 9. acetaldehyde dehydrogenase; 10. alcohol dehydrogenase (Axelsson, 2004).

19 1.5.1.2 Pentosefosfaatweg

Er bestaan vele synoniemen voor deze pathway waaronder de pentose-fosfoketolase weg, hexosemonofosfaatshunt of de 6-fosfogluconaat weg (Axelsson, 2004). In een eerste stap wordt glucose gedehydrogeneerd met vorming van 6-fosfogluconaat, waarbij na decarboxylatie pentose-5-fosfaat overblijft (fig. 7). Deze molecule wordt vervolgens gesplitst in glyceraldehyde-3-fosfaat (GAP) en acetylfosfaat. GAP wordt verder omgezet tot melkzuur op dezelfde wijze als bij de glycolyse. Acetylfosfaat wordt via acetyl-coA en acetylaldehyde omgezet tot ethanol. Aangezien verschillende eindproducten gevormd worden, wordt gesproken van een heterofermentatief proces.

Er kunnen ook andere hexosen dan glucose gebruikt worden als koolstofbron, zoals mannose of fructose (Axelsson, 2004). Deze suikers treden de pathway binnen ter hoogte van fructose-6-fosfaat of glucose-6-fructose-6-fosfaat na isomerisatie en/of fosforylatie en doorlopen hetzelfde proces als glucose. De fermentatie van andere disachariden zoals cellobiose, trehalose en melobiose werd nog niet uitvoerig bestudeerd. Er wordt aangenomen dat het metabolisme gemedieerd wordt door specifieke transportsystemen en hydrolases en dat de resulterende monosachariden één van de eerder vermelde pathways (glycolyse of pentosefosfaatweg) zal volgen.

1.5.1.3 Fermentatie van pentoses

Wanneer de pentosen na enzymgemedieerd transport de cel binnenkomen, zullen ze na fosforylatie worden omgezet tot ribulose-5-fosfaat of xylulose-5-fosfaat om vervolgens verder gemetaboliseerd te worden langs de fosfoketolase pathway (Axelsson, 2004). Bij de fermentatie zal acetaat gevormd worden in plaats van ethanol en ontstaat er geen CO2. Ook facultatief heterofermentatieve micro-organismen kunnen pentoses als koolstofbron aanwenden. Het gebruik ervan wordt geïnduceerd door de aanwezigheid van substraten gefermenteerd via de pentosefosfaatweg en onderdrukt door de aanwezigheid van glucose.

1.5.2 Mannitol

Mannitol is een polyol of suikeralcohol dat door verschillende micro-organismen geproduceerd kan worden (Soetaert, Buchholz, & Vandamme, 1995). Naast zijn natuurlijke zoetkracht, die 0,5 tot 0,7 keer die van sucrose bedraagt, worden ook enkele gunstige eigenschappen aan mannitol toegekend, onder andere een anti-oxidatieve werking (Wisselink, Weusthuis, Eggink, Hugenholtz, & Grobben, 2002). De dagelijkse inname mag maximum 20 gram bedragen, aangezien de stof een laxatieve werking heeft. Mannitol zou ook een beschermende functie uitoefenen over bacteriën en gisten bij stresscondities, onder andere bij osmotische stress. Soetaert et al. (1995) adviseert het gebruik van Leuconostoc mesenteroides voor de productie van een functionele

20 drank. Le. mesenteroides is een melkzuurbacterie die in staat is fructose als alternatieve elektronenacceptor te gebruiken, waarna het gereduceerd wordt tot mannitol.

Homofermentatieve MZB zullen in aanwezigheid van glucose gewoonlijk pyruvaat reduceren tot melkzuur met behulp van een NAD+_{-afhankelijk lactaat dehydrogenase waardoor NAD}+ _wordt geoxideerd tot NADH (Wisselink et al., 2002). Uitzonderlijk kan NAD+ _{via een alternatieve} pathway geregenereerd worden, waarbij mannitol wordt geproduceerd. Fructose-6-fosfaat, een intermediair van de glycolyse, wordt dan gereduceerd tot mannitol-1-fosfaat dat op zijn beurt wordt gefosforyleerd tot mannitol.

Heterofermentatieve MZB kunnen acetyl fosfaat omzetten naar azijnzuur in plaats van ethanol waardoor een additionele hoeveelheid ATP geproduceerd wordt. NAD+ _{moet hierbij gereduceerd} worden met behulp van een alternatieve elektronenacceptor. Onder anaerobe condities kan hiervoor fructose gebruikt worden waarbij mannitol geproduceerd wordt. Bij de fermentatie worden 1 mol glucose en 2 mol fructose gefermenteerd met vorming van 2 mol mannitol, 1 mol D-melkzuur, 1 mol azijnzuur en 1 mol CO2 (Wisselink et al., 2002). Theoretisch kan deze omzetting voor 100% gebeuren, maar praktisch zal dit rendement lager liggen aangezien fructose ook deels omgezet kan worden tot organische zuren (Soetaert et al., 1995). Er werd evenals opgemerkt dat een verlaagde pH en temperatuur leiden tot een betere omzettingsefficiëntie, maar een vertraagde omzettingssnelheid. Een voldoende hoge initiële (extracellulaire) fructoseconcentratie is essentieel, aangezien te lage concentraties kunnen leiden tot een daling van de efficiëntie tot slechts 50% en deze parameter ook de gevormde ethanol/mannitol verhouding zal beïnvloeden. Bij de juiste condities kan de ethanol/mannitol verhouding gereduceerd worden tot 1/100. Bij een pH van 5,5, een temperatuur van 25°C en bij voldoende hoge initiële concentraties van glucose en fructose werd een maximale omzettingsefficiëntie van 94% bekomen. Bij deze optimale condities bedroeg de maximum omzettingssnelheid 11g/L mannitol per uur en werd een eindconcentratie van 150g/L mannitol bekomen (fig. 8).

21

1.5.3 Zuurtolerantie

De verzuring en verlaagde pH van het product als gevolg van de accumulatie van melkzuur kan het verdere koolhydraat metabolisme van melkzuurbacteriën inhiberen (Gänzle, 2015). Bij een lage pH kan worden overgegaan tot het gebruik van aminozuren in plaats van de fermentatie van hexosen. De pH homeostase en overleving van de MZB worden bepaald door glutamine, glutamaat en arginine. Het katabolisme van arginine en glutamine resulteert in een pH stijging, zowel intra- als extracellulair, die bijdraagt tot de zuurresistentie van de MZB. De bijdrage van arginine is optimaal bij pH-waarden hoger dan 3,5. De bescherming door glutamine is nog bij lagere pH-waarden werkzaam. De omzetting van de aminozuren resulteert echter in de vorming van een aantal ongewenste eindproducten. Zo zal de conversie van arginine off-flavours veroorzaken en worden bij de decarboxylatie van aminozuren, met uitzondering van glutaminezuur, ongewenste biogene amines gevormd.

Melkzuurbacteriën zijn in staat hun cytoplasma meer alkalisch te behouden dan hun omgeving (Kashket, 1987). Hoe sterker de verzuring van de omgeving is, hoe moeilijker de alkalisatie van het cytoplasma wordt en hoe meer de inwendige pH zal dalen. In een omgeving met pH-waarde van 3,5 zal het cytoplasma een pH-waarde van ongeveer 4,4 aannemen. Het onderzoek vermeld dat een treshold pH bestaat waarbij cellulaire functies geïnhibeerd worden door overdadige acidificatie van het milieu als gevolg van de accumulatie van organische zuren en alcoholen. De

Fig. 8: Fermentatieprofiel van een fed-batch mannitol fermentatie met Leuconostoc mesenteroides bij een temperatuur van 25°C en een pH-waarde van 5,5 (Soetaert et al., 1995).

22 inhiberende werking van organische zuren steunt op hun activiteit als protonoforen, terwijl andere solventen zoals alcoholen het fosfolipidemembraan kunnen verstoren. Wanneer deze stoffen in hoge concentraties aanwezig zijn, versterken ze de inwaardse stroom van H+_{, zodat de efflux van} H+ _{niet langer volstaat om het cytoplasma te alkaliseren.}

De pH-daling in het medium en daaruitvolgende pH-daling in het cytoplasma van de MZB zorgen ervoor dat de cellen stoppen met groeien terwijl de fermentatie wel nog kan doorgaan (Kashket, 1987). Bij toevoeging van een buffer zoals sodiumacetaat zal een tragere pH-daling plaatsvinden en kunnen celdensiteiten bereikt worden die driemaal hoger liggen dan wanneer geen buffer wordt toegevoegd (zie bijlage, tabel 2). Lactobacillen groeien dus beter in aanwezigheid van een acetaatbuffer doordat langer een inwendige pH hoger dan 4,4 kan worden aangehouden. Minder osmotolerante MZB vertonen een vertraagde groei bij toevoeging van de buffer, maar bereiken uiteindelijk wel hogere celdensiteiten.

In een onderzoek van Giraud, Lelong, & Raimbault (2014) werd de invloed van de pH en de melkzuurconcentratie op de groei van Lactobacillus plantarum afzonderlijk bestudeerd. Een optimale pH-waarde lag rond 6,0 en de limiterende pH-waarden waren 3,4 en 8,8. De pH had een duidelijk effect op de groeisnelheid, maar slechts een beperkt effect op de hoeveelheid melkzuur die werd geproduceerd per substraat dat werd verbruikt. Wat betreft de initiële melkzuurconcentratie is er een lineair verband aanwezig met de groeisnelheid van L. plantarum. Bij een kritische concentratie van 110 g/l azijnzuur, vertoonde L. plantarum geen groei meer. De opbrengst (melkzuur/substraat) veranderde weinig bij azijnzuur concentraties tot 33 g/l, terwijl bij hogere concentraties een snelle daling in opbrengst werd waargenomen.

1.5.4 Osmotolerantie

In het onderzoek van Kashket (1987) werd de osmotolerantie van enkele lactobacillen onderzocht. Algemeen worden deze micro-organismen niet gekenmerkt door een hoge osmotolerantie en bestaan er gradaties in osmotolerantie tussen de verschillende stammen; sommigen vertonen nog groei in media met 1,0 M zout (NaCl, KCl of natriumacetaat), terwijl andere stammen zoals Lactobacillus acidophilus en L. delbrueckii concentraties van respectievelijk slechts 0,3 M en 0,6 M tolereren. De resistentie tegen osmotische stress is gebaseerd op de accumulatie van K+_{, specifieke koolhydraten en/of aminozuren.}

23

1.6 Wort als basis voor een gefermenteerde drank

De verhoogde belangstelling in het verbeteren van het welzijn door middel van het dieet is een bepalende factor in de wereldwijde toegenomen interesse voor functional foods (Salmerón, Thomas, & Pandiella, 2015). Eén van de snelst groeiende sectoren binnen deze functional foods is die van melkgebaseerde producten die gericht zijn op het bevorderen van de darmgezondheid. De grote vraag naar dit soort producten, waarbij evenals rekening gehouden wordt met zaken zoals intoleranties (lactose) en levensstijl keuzes (vegetarisme, veganisme), creërt een behoefte aan nieuwe substraten. Er zijn reeds onderzoeken naar het gebruik van fruit- en groentensappen als een nieuwe voedselmatrix waarop gewenste bacteriën kunnen groeien. Recent is er ook veel belangstelling naar granen als potentieel substraat, doordat de nutriënten makkelijk ter beschikking zijn voor de probiotica. Daarbij beschermen graangebaseerde substraten zoals haver, gerst en mout de overleving van lactobacillen tegen de extreme condities binnen het maag-darmstelsel.

Alhoewel er reeds enkele onderzoeken zijn over de productie en procesinnovatie van graangebaseerde dranken gefermenteerd door melkzuurbacteriën, is het aanbod op de markt beperkt. De belangrijkste tekortkoming van het product is een te lage concentratie aan aromatische componenten (Nsogning Dongmo, Fischer, & Becker, 2018). Voor een functional food werd in 59% van de gevallen de smaak als belangrijkste aspect beschouwd, terwijl de nutritionele waarde slechts in 36% van de gevallen als belangrijk werd aanschouwd (Nsogning Dongmo et al., 2016). De twee belangrijkste factoren die de smaak van het product beïnvloeden zijn de gebruikte stam(men) en het fermentatiemedium. De performantie en het metabolisme van de gebruikte stam zijn op zich sterk afhankelijk van de samenstelling van het medium; de aanwezigheid van essentiële nutriënten bepaalt de fysiologische conditie van de cellen. MZB hebben aminozuren, vetzuren, fermenteerbare suikers, vitamines en purines nodig voor hun groei. Een tekort aan één of meer van deze componenten zal dus een negatief effect hebben op de groei van de aanwezige micro-organismen. Daarbij moet er rekening gehouden worden met de veranderende compositie van het medium gedurende de fermentatie.

Nsogning et al. (2018) onderzocht het gedrag van zes MZB stammen tijdens een fermentatie op gerstemout wort. Het gaat om de fermentatie van Lactobacillus brevis en drie Lactobacillus plantarum stammen bij 28°C en twee Lactobacillus amylolyticus stammen bij 48°C. Een publicatie van Charalampopoulos et al. (2002) onderzocht welke factoren de groei en metabolische activiteit van enkele specifieke MZB gedurende de fermentatie van verschillende media (mout, gerst, tarwe) bij 37°C beïnvloeden. De stammen die in dit onderzoek werden toegepast, waren

24 Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus en Lactobacillus plantarum.

1.6.1 Fermentatie van wort door melkzuurbacteriën

Zuren

Reeds verschillende onderzoeken bestudeerden het negatieve effect van een stijgende concentratie aan organische zuren en een dalende pH op de groei en overleving van melkzuurbacteriën (Gänzle, 2015; Giraud et al., 1991; Kashket, 1987; Peyer et al., 2017). In het onderzoek van Nsogning Dongmo et al. (2018), waar de zuurconcentratie gedurende de fermentatie werd opgevolgd, nam men een eindconcentratie van 3,9 ± 0,4 g/L melkzuur waar, met een opbrengst van 0,11-0,49 g melkzuur per gram suiker. De verkregen concentraties azijnzuur (0,07-0,2 g/L) lagen behoorlijk lager dan die van melkzuur. Per gram melkzuur werd gemiddeld slechts 0,09 gram azijnzuur gevormd. Bij de perfect heterolactische fermentatie in aanwezigheid van alternatieve elektronenacceptoren zal 1 mol glucose-6-fosfaat omgezet worden tot 1 mol melkzuur (90,08 g/mol) en 1 mol azijnzuur (60,05 g/mol). Theoretisch kan er maximaal 0,67 gram azijnzuur per gram melkzuur geproduceerd worden, in de praktijk ligt deze opbrengst echter behoorlijk lager.

In het onderzoek van Charalampopoulos et al. (2002) vertoonden L. fermentum en L. reuteri een heterofermentatief metabolisme en werden voornamelijk melkzuur (2,69 ±0,28 g/L), azijnzuur (0,60 ± 0,03 g/L) en ook een kleinere hoeveelheid ethanol geproduceerd in een wort medium (zie bijlage, tabel 3). Lactobacillus plantarum vertoonde een homofermentatief metabolisme waarbij voornamelijk melkzuur (5,74 ± 0,1 g/L) en een kleine hoeveelheid azijnzuur (0,32 ± 0,05 g/L) werden geproduceerd.

Magni, De Mendoza, Konings, & Lolkema (1999) onderzochten welke concentraties aan organische zuren de groei van Lactococcus lactis inhibeerden. Voor melkzuur werd de groei geremd bij 1,8 g/L, voor azijnzuur bij 1,2 g/L. Zowel in het onderzoek van Nsogning Dongmo et al. (2018) als in het onderzoek van Charalampopoulos et al. (2002) werden concentraties aan melkzuur hoger dan 1,8 g/L gerapporteerd. Azijnzuur op zich zal een weinig inhiberende werking hebben, maar een mogelijks gecombineerd effect met melkzuur is niet te verwaarlozen.

Suikers

In het onderzoek van Charalampopoulos et al. (2002) werd de consumptie van de verschillende suikers opgevolgd gedurende de fermentatie. Bij de fermentatie met L. fermentum, L. reuteri en L. plantarum werden glucose en fructose zo goed als volledig opgebruikt (zie bijlage, tabel 3).

25 L. acidophilus vertoonde ook een volledig verbruik van het aanwezige fructose, er bleef echter nog een aanzienlijke hoeveelheid glucose over. In dit experiment bleven na de fermentatie nog 34-47% en 30-53% over van respectievelijk maltose en sucrose, terwijl voor zowel glucose en fructose bij alle stammen minder dan 10% overbleef. Uit het onderzoek bleek ook dat de verschillende micro-organismen andere suikers verkiezen als uitgangspunt voor de fermentatie. Zo verkoos L. fermentum in eerste instantie (0-12h) maltose voor de fermentatie, terwijl L. reuteri en L. acidophilus voornamelijk glucose en fructose prefereerden en L. plantarum naast glucose en fructose ook sucrose in grote mate verbruikte.

In het onderzoek van Nsogning et al. (2018) werd de suikerconsumptie gedurende de fermentatie van 14% gerstemout wort opgevolgd. Op het einde van de fermentatie bleef nog 52-83% glucose, 46-98% sucrose, 96-99% maltose en 100% maltotriose over. Enkel het aanwezige fructose werd snel opgebruikt en in totaal werd slechts 5,3-8,2% van de totale suiker verbruikt.

Over de rol van fructose als essentiële suiker voor de groei van melkzuurbacteriën werd geen onderzoek teruggevonden. Er wordt echter vermoed dat eerder andere factoren (pH, buffercapaciteit) werkelijk doorslaggevend zijn bij de groeilimitatie van de MZB. Deze stelling wordt ondersteund door een onderzoek van Venkatesh et al. (1993) waarin een fermentatie met Lactobacillus bulgaricus bij overmaat aan suikers tweemaal werd uitgevoerd; eerst zonder pH-controle, en vervolgens bij constante pH-waarde van 5,6. Dit onderzoek rapporteerde een onvolledig verbruik (17%) van de aanwezige suikers en een versnelde rem (na ±10h) in de groei van L. bulgaricus in het eerste geval, terwijl bij constante pH 90% van de suikers verbruikt werd en de exponentiële fase langer aanhield (±18h).

Aminozuren

Verschillende aminozuren, voornamelijk lysine, arginine en glutaminezuur zijn essentieel voor de groei van melkzuurbacteriën (Nsogning Dongmo et al., 2018). Het katabolisme van deze aminozuren draagt namelijk bij tot de zuurresistentie van de micro-organismen (Gänzle, 2015). Een tekort aan aminozuren heeft hierdoor een dubbel effect: een remming van de groei van de micro-organismen en een vermindering van hun zuurresistentie (Nsogning Dongmo et al., 2018).

26 In het onderzoek van Nsogning et al. (2018) bevatte een moutmedium initieel 0,58 ± 0,02 g/L FAN en 4,60 ± 0,03 g/L aminozuren waarvan respectievelijk 77% en 76% werden opgebruikt tijdens de fermentatie (fig. 9). Lysine, arginine en glutaminezuur werden bijna volledig opgebruikt, op het einde van de fermentatie bleef minder dan 2% over. Er werd tevens vermeld dat de melkzuuraccumulatie de opname van aminozuren door MZB zal beperken. Hierdoor is het mogelijk dat naar het einde van de fermentatie toe, te weinig aminozuren worden geassimileerd. Bij de opgroei van L. plantarum op MRS werd een groter verbruik van lysine en arginine waargenomen in vergelijking met andere aminozuren. Er werd reeds aangetoond dat glutaminezuur essentieel is voor verschillende MZB stammen.

pH en buffercapaciteit

De buffercapaciteit (BC) van het medium is belangrijk omdat een hoge BC de pH daling, als gevolg van de stijgende zuurconcentratie, beperkt. Nsogning et al. (2018) stelde vast dat in het begin van de fermentatie het wort medium een slechte buffercapaciteit vertoonde; de vorming van kleine hoeveelheden zuren ging gepaard met een sterke pH daling (fig. 10). De gevormde zuren droegen bij aan de toename van de melkzuur/lactaat buffer, waardoor het medium in een tweede fase een verhoogde BC vertoonde. Vanaf een pH-waarde van ± 3,5 (inititiële pH = ± 5,0) was een goede BC waarneembaar en bleef de pH vrij constant ondanks de blijvende opstapeling van organische zuren. Het onderzoek van Charalampopoulos et al. (2002) bevestigt dat een pH-daling van 1,5 tot 2 eenheden verwacht kan worden bij de fermentatie met melkzuurbacteriën van een moutmedium met intitiële pH van ± 5,2.

Fig. 9: Concentratie aan vrije amino stikstof (FAN) en aminozuren in gerstemout wort vóór (volle balken) en na (gestreepte balken) 72h fermentatie. De hoeveelheid die verbruikt werd ten opzichte van de initiële hoeveelheid in het gerstemout wort werd weergeven als percentage (Nsogning Dongmo et al., 2018).

27

1.6.2 Groei van melkzuurbacteriën in wort

Om een goede fermentatie van het medium te bekomen, moeten voldoende levensvatbare cellen aanwezig zijn. Een voldoende efficiënte celreproductie en -vitaliteit zijn twee factoren die de performatie van de fermentatie zullen bepalen (Nsogning Dongmo et al., 2016). In het onderzoek van Charalampopoulos et al. (2002) nam het celaantal toe met ± 3 log10 kve/ml tijdens de exponentiële fase van L. fermentum, L. reuteri en L. plantarum (fig. 11). L. acidophilus vertoonde een beperktere groei; een toename van het celaantal met ± 1 log10 kve/ml.

Fig. 11: De groei van ■: L. plantarum; ●: L. fermentum; ▲: L. reuteri en ◊: L. acidophilus op een mout medium. Volle lijnen weerspiegelen de voorspelde groeicurves (Charalampopoulos et al., 2002). Fig. 10: (a) pH-verloop in functie van de concentratie aan organische zuren en (b) verandering in buffercapaciteit (BC) als gevolg van de stijgende pH waarde van het medium bij de fermentatie van gerstemoutwort met: L. plantarum (♦,◊ en ■), L. amylolyticus (● en ○) en L. brevis (Δ) (Charalampopoulos et

28 Een verklaring hiervoor kan de afwezigheid van een specifiek nutriënt in het mout medium zijn dat essentieel is voor een goede groei van L. acidophilus, vb: B-vitamine of een bepaald mineraal. Het onderzoek van Nsogning et al. (2018) stelde vast dat terwijl de levende cellen vermenigvuldigden in het fermentatiemedium, een groot aantal niet of minder resistente cellen continu afstierf. Dit uitte zich in een exponentiële toename van zowel de levende als de dode cellen en een drastische daling van de vitaliteit gedurende de fermentatie (fig. 12) (Nsogning Dongmo et al., 2018). Een verklaring voor het afsterven van de cellen is de toenemende concentratie aan melkzuur geproduceerd door de MZB. Hoe langer gefermenteerd wordt, hoe meer melkzuur accumuleert en hoe minder gunstig het medium wordt voor de groei en overleving van de MZB.

Fig. 12: Kinetiek van de groei (a), mortaliteit (b) en vitaliteit (c) van zes MZB stammen gedurende de fermentatie van een moutmedium. L. plantarum: Lp.758 (♦), Lp.765 (◊), Lp.725 (■); L. amylolyticus La.TL5 (○), La.TL3 (●); en L.

brevis Lb.986 (▲). CFU = colony forming units (kolonievormende eenheden); AP = acidification power value

(verzuringskracht). De standaardvariatie van drie onafhankelijke triplicaten wordt voorgesteld d.m.v verticale lijnen (Nsogning Dongmo et al., 2018).

Verschillende studies benadrukken het belang van de aanwezigheid van levende en metabolisch actieve cellen voor de vorming van een voldoende hoge concentratie aan metabolieten, noodzakelijk voor het verkrijgen van een drank met een krachtig aroma. Het snelle afsterven en de lage vitaliteit van de cellen bij de fermentatie met MZB wijst echter op enkele limitaties aan het gebruik van wort als medium en kan een verklaring vormen voor de zwakheid van de gevormde aroma's. Indien de fermentatie bij een hogere temperatuur wordt uitgevoerd, zullen de micro-organismen zich sneller vermenigvuldigen en kunnen hogere celaantallen bereikt worden binnen eenzelfde tijdspanne.